Abstract
Til tross for mange bevis som støtter konseptet «onkogen avhengighet» og mange hypoteser effektivisering av det, er det fortsatt mangel på detaljert forståelse til den nøyaktige molekylære mekanismen underliggende onkogen avhengighet. I denne kontoen, har vi utviklet en matematisk modell av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) forbundet signalnettverk, som innebærer EGFR-kjøring spredning /pro-overlevelse signalveier Ras /ekstracellulære signalregulert kinase (ERK) og phosphoinositol-3 kinase ( PI3K) /AKT, og pro-apoptotiske signalveien apoptose signalregulerende kinase 1 (ASK1) /p38. I innstillingen av vedvarende aktivering EGFR, simuleringsresultatene viser et vedvarende høyt nivå av proliferasjon /pro-overlevelses effektorer fosfo-ERK og fosfo-AKT, og et basalnivå av pro-apoptotiske effektor fosfo-p38. Potensialet av p38-aktivering (apoptotiske potensial) på grunn av forhøyet nivå av reaktive oksygenarter (ROS) er i stor grad undertrykkes ved den negative krysstale mellom PI3K /AKT og ASK1 /p38 veier. Ved akutt EGFR inaktivering, den overlevelsessignaler forråtnelse hurtig, etterfulgt av en rask økning av apoptotiske signal på grunn av frigjøring av apoptotiske potensial. Samlet vår systembiologi modellering sammen med eksperimentelle valideringer avslører at hemming av overlevelsessignaler og samtidig utgivelsen av apoptotisk potensial i fellesskap bidra til svulsten celledød etter hemming av avhengige onkogen i EGFR avhengige kreft
Citation. Zhou JP Chen X, Feng S, Luo SD, Pan YL, Zhong L, et al. (2011) Systems Biology Modellering avslører en mulig mekanisme for Tumor Cell Døden på Oncogene Inaktive i EGFR Avhengige Kreft. PLoS ONE 6 (12): e28930. doi: 10,1371 /journal.pone.0028930
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 20 juni 2011; Godkjent: 17 november 2011; Publisert: 14.12.2011
Copyright: © 2011 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (20872100, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm) og Foundation i Sichuan-provinsen (08ZQ026-030 http Youth: //www.qnjj .sc.cn /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
begrepet «onkogenet avhengighet» ble først hevet av Weinstein basert på de spesielle fenomener som proliferasjon og overlevelse av enkelte kreftformer sterkt avhengige av bare en onkogent protein eller vei, til tross for tilstedeværelsen av flere genmutasjoner og epigenetisk abnormaliteter [1] – [3]. Nå mange bevis er blitt funnet å understøtte dette konseptet, inkludert de fra genetisk modifiserte musemodeller [4], [5], mekanistiske undersøkelser i humane kreftcellelinjer [6], [7], og spesielt god klinisk terapeutiske effekt av en serie av antistoffer eller små molekylære stoffer som er rettet mot spesifikke proteiner i humane kreftformer som er rapportert i de senere år [8] – [10]. I dag flere hypoteser har blitt foreslått for å forklare fenomenet onkogen avhengighet, inkludert genetiske effektivisering [11], [12], syntetisk letalitet [13], onkogene hukommelsestap [14], og onkogen sjokk [15], [16]. Disse hypotesene gi forskjellige forklaringer fra forskjellige vinkler i forhold til fenomenet onkogen avhengighet. Likevel, det er fortsatt mangel på detaljert forståelse til den nøyaktige mekanismen bak den onkogen avhengighet. Spesielt, den molekylære basis for noen vesentlig fenomener relatert til onkogen avhengighet fortsatt uklart, for eksempel fenomen som akutte onkogen inaktivering fører til tumor celledød i den oncogene avhengige kreftformer, skåner andre celler som ikke på samme måte er avhengige av.
det er blitt foreslått at den oppdager uregelmessigheter av intracellulær krets (signaltransduksjon nettverk) eller «koblingsskjema» er den mest grunnleggende årsaken som står for fenomenet onkogen avhengighet [2], [17]. Kompleksiteten av intracellulær kretser sammen med multi-genetiske mutasjoner i kreftceller hemmer forståelse av molekylær basis underlaget onkogen avhengighet [18], [19]. Situasjonen har nå endret litt på grunn av nylige fremskritt innen systembiologi [20] – [22], spesielt beregningssystembiologi [23], [24]. Dermed er man inne i en god posisjon til å anvende slike teknologier for å avdekke mulige molekylære mekanismene bak ulike fenomener knyttet til onkogen avhengighet.
Som det første arbeidet med å forstå onkogen avhengighet fra synspunktet til systembiologi, i denne studien, har vi utviklet en matematisk modell av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) -associated signaleringsnettverk for å undersøke mulig molekylær mekanisme for tumor celledød som følge av hemming av avhengige onkogenet. Her valgte vi EGFR-assosierte signaleringsnett hovedsakelig på grunn av følgende årsaker: (1) EGFR er en av de viktigste onkogener og implisert i mange humane tumortyper, spesielt, lungekreft, hode- og hals tumorer [25], [ ,,,0],26]; (2) EGFR-signaleringsnett har blitt mye studert eksperimentelt og teoretisk [27] – [30], noe som tyder på at mange parametere er tilgjengelige i litteraturen som forenkler modellutvikling. Denne modellen ble validert først, og deretter brukt til å simulere normal tilstand av kreftceller og nettverks svar på akutte EGFR-hemming.
Resultater
Etablering av matematisk modell av EGFR-assosiert signalnettverk
Vi her presentere en ordinær differensialligning (ODE) basert matematisk modell av EGFR-assosiert signalnettverk, som innebærer EGFR-kjøring spredning /pro-overlevelse signalveier Ras /ekstracellulære signalregulert kinase (ERK) og phosphoinositol -3 kinase (PI3K) /AKT, og pro-apoptotiske signalveien apoptose signalregulerende kinase 1 (ASK1) /p38. De delene av Ras /ERK og PI3K /AKT trasé i denne modellen ble etablert basert på den kjente Ras /ERK og PI3K /AKT modeller, inkludert for eksempel Brightman [31], Birtwistle [30], Schoeberl [29], og Oda [32 ] modeller. Forfatterne kunnskap, men det er ingen matematisk modell av p38 medierte pro-apoptotiske signalveien rapportert ennå i litteraturen. Vi har derfor bygget en modell av p38-signalering, og innlemmet den i EGFR-signaleringsnett. Modellen består av 243 ligninger og interaksjoner med 160 forskjellige molekylære arter, preget av 145 kinetiske parametere og 28 ikke-null innledende molekylære konsentrasjoner. De fleste av de kinetiske parametere og innledende molekylære konsentrasjoner i denne modellen ble tatt fra litteraturen eller er avledet fra enkle fysiske mengder [29], [30], [33]. Andre ble estimert ved montering modell utganger til kjente eksperimentelle data med bruk av hybrid kvasi ensemble modellering algoritme foreslått av oss nylig [34]. De viktigste reaksjoner og parametrene er vist i tabell S1, og innledende molekylære konsentrasjoner i Tabell S2 (se tilleggsinformasjon). De viktige signalveier og viktige komponentene som er involvert i vårt nettverksmodell er vist i figur 1. En kort beskrivelse av dette EGFR-assosiert nettverk er gitt som følger.
Heltrukne linjer med piler indikerer aktivering av proteiner eller lipider. Stiplede linjene representerer direkte protein-protein og protein-lipid interaksjoner. Heltrukne linjer med butte ender representerer inhibering.
I normaltilstand, er nettverket signaleringen initiert ved binding av epidermal vekstfaktor (EGF) til EGFR, etterfulgt av dimerisering og påfølgende gjensidig trans-fosforylering videre flere tyrosin rester av EGFR; selv om EGFR familien har tre andre medlemmer inkludert ErbB2, ErbB3 og ErbB4 i tillegg til EGFR (ErbB1) som kan danne forskjellige dimmere (enten homo- eller hetero dimerer) [30], [35], bare EGFR og EGFR-EGFR homo -dimers anses i denne modellen for forenkling. Disse fosfo-tyrosin rester fungere som tilkoblings nettsteder som gjør reseptorer for å rekruttere adapter proteiner SHC og GRB2 [36], som deretter kan rekruttere den guanosin nucleotide utveksling faktor SOS. SOS fremmer utskifting av BNP med GTP i Ras, og dermed aktivere Ras [37]. Den aktiverte Ras resulterer deretter i aktivering av proteinkinase Raf [38]; siden den direkte aktivator av Raf kinase ikke er kjent ennå, antar vi at Raf fosforylering er direkte forårsaket av en Ras-GTP molekyl i denne modellen. Den aktiverte Raf aktiverer endelig den mitogen-aktivert protein kinase kinase1 /2 (MEK) og ERK i en kaskade måte [39]. Det aktiverte ERK fosforylerer kan oppstrøms-proteinet SOS, dermed forårsaker dissosiasjon av GRB2-SOS fra den reseptor-komplekset, som danner en negativ tilbakekoblingssløyfe [40]. I tillegg kan GRB2 i cytomembrane også rekruttere Gab1, noe som fører til fosforylering av Gab1 og påfølgende rekruttering av PI3K [41]. I cytomembrane, forvandler PI3K phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) inn fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP3) som induserer aktivering av AKT gjennom å samarbeide med tre-phosphoinositide avhengig protein kinase-en (PDK1) [42 ]. I denne prosessen, kan fosfatase og tensin homolog (PTEN) og proteinfosfatase 2A (PP2A) spesifikt dephosphorylate henholdsvis PIP3 og AKT [43]. Fosforylert Raf, MEK og ERK kan defosforylert ved deres spesifikke fosfataser [30]
P38 som er tenkt som en viktig pro-apoptotiske effektor kan aktiveres ved en rekke miljømessige påkjenninger og inflammatoriske cytokiner [44]. – [46]. Blant annet, av spesiell betydning er den spenning på grunn av reaktive oksygenarter (ROS). For eksempel Dolado et al. rapporterte at det onkogene H-Ras-indusert ROS spiller en nøkkelrolle i hemming av tumor initiering ved aktivering av p38 og følgelig resulterer i apoptose i fibroblaster avledet fra museembryoer [47]. Videre har tallrike undersøkelser har vist at stimulering av humane cancerceller med EGF resulterer i en økning i den intracellulære konsentrasjonen av ROS [48] – [50]. Jin og hans kolleger selv oppdaget frekvensen av ROS generasjon indusert av EGF stimulering i A431 [50]. Således blir ROS involvert i vår modell som en viktig komponent i oppstrøms p38 signalveien. ROS utløser aktiveringen av ASK1, som så induserer fosforylering av mitogen-aktivert protein kinase kinase3 /6 (MKK) og p38 i en kaskade stil [51]. Spesifikke fosfataser av ASK1, MKK og p38 er også inkludert i denne modellen. I tillegg er det blitt fastslått at aktivert AKT kan undertrykke aktivering av p38 via fosforylering ASK1, som danner en negativ krysstale mellom PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveier. For eksempel, Zhang et al. rapporterte at AKT kan fosforylere ASK1 på stedet Ser83 å inhibere hydrogenperoksyd-indusert ASK1 /p38-signaleringsaktivering i endoteliale celler [52]. Yuan og hans kolleger viste også at AKT kan hemme cisplatin-indusert p38 aktivering gjennom fosforylering av ASK1 [53]. Følgelig er crosstalk AKT-ASK1 mellom PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveier også involvert i vår modell.
Model validering
Den etablerte modellen ble validert ved å beregne tids kurs av flere nøkkel arter aktivering inkludert Ras, ERK, AKT og p38 etter en kort EGF stimulering og sammenligne simuleringsresultatene med andre publiserte eksperimentelle eller simuleringsstudier på EGFR signalering. Figur 2 viser de simulerte tidskursmønstre Ras, ERK, AKT og p38-aktivering eksponering til EGF med varierende konsentrasjoner over 60 minutter. Ved tilsetning av EGF ved t = 0, vil den totale konsentrasjon av Ras-GTP, fosfo-ERK (p-ERK) og fosfo-AKT (p-AKT) raskt øke til et maksimum i løpet av 5 minutter med sine topper avhengig av EGF-konsentrasjonen etterfulgt av råtnende til sine basale nivåer innen 50 minutter. I mellomtiden blir en forsinket økning av fosfo-p38 (p-p38), som nådde en topp etter 15 minutter, observeres. Dette er i samsvar med tidligere eksperimentelle funn. For eksempel EGF stimulering av PC12-cellene resulterer i en hurtig, forbigående aktivering av Ras og ERK [27]. Nivået av Ras-GTP hurtig når et maksimum i løpet av 2 minutters eksponering for EGF, men avtar i løpet av 10 minutter og gradvis vender tilbake til basalnivået i løpet av 60 minutter. Tilsvarende er ERK-aktivering maksimal i løpet av 5 minutter og avtar til mindre enn 50% av det maksimale nivå av 30 minutter, og til mindre enn 25% i løpet av 60 minutter. De forbigående aktiveringer av ERK og p38 etter EGF stimulering ble også observert i retinale, kapillært endotelialceller [54]. Etter en 5 minutters eksponering av retinale kapillære endotelceller til EGF, når ERK en maksimal grad av fosforylering som er 20 ganger større enn den for dens kontroll. I løpet av de etterfølgende 2 timer, avtar ERK-aktivering til den når en grunnlinje. For p-p38, øker det et nivå nesten tredoblet i forhold til sin kontroll etter 15 minutter, etterfulgt av en nedgang i sin kontrollnivået.
Konsentrasjons endringer av (A) aktiv ERK (fosfo-ERK), (B ) aktiv AKT (fosfo-AKT), (C) aktivert Ras (Ras-GTP) og (D) aktivert p38 (fosfo-p38) ved forbigående stimulering av EGF ved forskjellige konsentrasjoner.
Simulert vedvarende aktivering av EGFR
Vi deretter simulere vedvarende EGFR aktivering i EGFR avhengige kreftceller. For dette formål ble de reseptor-internalisering reaksjonene fjernes fra modellen, og de EGF-konsentrasjonen ble innstilt på en fast verdi. Figur 3 viser tids kurs av ERK, AKT og p38-aktivering. Åpenbart den vedvarende EGFR aktiverings til slutt resulterer i et stabilt høyt nivå av p-ERK og p-AKT etter en rask økning i begynnelsen. Imidlertid fremdeles holder p38-aktivering ved sin basalnivået selv om en påvisbar liten topp av p-p38 i løpet av de første 5 minutter. Alt i alt, den vedvarende aktivering av EGFR fører til et endelig resultat av vedvarende høyt nivå av p-ERK og p-AKT, men et lavt nivå av p-p38. Dette stemmer overens med eksperimentelle funn i EGFR-avhengige kreftceller som ERK og AKT holde på et høyt nivå av aktivering og p38 opprettholder i et lavt nivå av aktiverings [16].
Konsentrasjons forandringer av (A) aktiv ERK (fosfo-ERK), (B) aktiv AKT (fosfo-AKT) og (C) aktivert p38 (fosfo-p38) ved forlenget stimulering av EGFR på ulike nivåer.
Simulering av nettverket respons på akutt EGFR inaktivering i EGFR avhengige kreftceller
Vi har nettopp simulert normal tilstand av EGFR avhengige kreftceller, nemlig en innstilling av vedvarende EGFR aktivering. I denne delen skal vi simulere nettverk respons på akutt EGFR inaktivering, som etterligner situasjonen med å bruke EGFR-hemmere i EGFR avhengige kreftceller. I simuleringen, ble den akutte EGFR inaktiveringen utføres gjennom en forhåndsdefinert hendelse på et fast tidspunkt, nemlig EGFR-aktiviteten ble satt til den basale nivå. Forandringer i konsentrasjonen av aktivert ERK, AKT og p38 etter akutt EGFR-inhibering er vist i figur 4. Åpenbart, fører den akutte EGFR inaktivering til en umiddelbar reduksjon av konsentrasjonen av p-ERK og p-AKT, og en forsinket økning av p- p38. Simuleringen godt gjengitt de eksperimentelle fenomener som akutt inaktivering av EGFR onkogen resulterer i en hurtig minskning av celleproliferasjon /pro-overlevelses effektorer p-ERK og p-AKT, og påfølgende inngrep av de pro-apoptotiske effektor p-p38 i EGFR avhengige kreftceller [16], [55].
Profil av konsentrasjonsendringer av (A) aktiv ERK (fosfo-ERK), (B) aktiv AKT (fosfo-AKT) og (C) aktivert p38 (fosfo -p38). Den virtuelle tilfelle av EGFR-hemming ble utført ved tid 0 hr.
Følsomhetsanalyse avdekker kritiske faktorer ansvarlig for p38-aktivering
Sensitivitetsanalyse har lenge vært brukt i systembiologi å studere hvordan variasjon av verdien av den simulerte produksjon av en matematisk modell kan fordeles til ulike kilder til variasjon i inngangen på en modell, som kan brukes til å identifisere kritiske proteiner som dominerer produksjonen av en effektor-protein [29]. Her p-ERK, p-AKT og p-p38 ble tatt som utgangsvariabler for sensitivitetsanalysen. Figur 5 viser normaliserte tids integrert følsomhet for arter med ikke-null verdier i EGFR signalenettverksmodell. Selvfølgelig, de mest sensitive noder for ERK-aktivering er MEK og Raf i tillegg til incurious ERK og EGF; ERK og EGF er de trivielle løsninger siden ERK er den direkte forløperen til p-ERK, og EGF er initiativtaker til nettverket respons (for enkelhets skyld, vil disse incurious sensitive noder ignoreres senere). For AKT aktivisering, de mest sensitive noder inkluderer GRB2, PIP2, Gab1, PI3K, PDK1, SOS, og PTEN. Og de som for aktivering av p38 i hovedsak omfatte ASK1, MKK, RacGDP, PP2A, AKT, PDK1 og SOS.
Normaliserte tidsintegrert sensitiviteter av ERK, AKT og p38 fosforylering (p-ERK, p-AKT, og p-p38) til hver nonzero arter i EGFR-assosiert nettverksmodell.
den analysen over viser de kritiske regulatorer i nettverket for overlevelse effektorer p-ERK og p-AKT, og pro-apoptotisk effektor p-p38. Vi har også observert at de største positive og negative verdier av følsomhet alle svarer til utgangsvariabelen p-p38. For eksempel, AKT som har den største negative verdi av følsomheten til den pro-apoptotiske effektor p-p38 kan spille en viktig negativ regulering rolle i celle-apoptose. ASK1, MKK og RacGDP, som alle er viktige komponenter i ROS /ASK1 /MKK /p38 signalkaskade, har den største positive verdier av sensitivitet, noe som tyder på en viktig positiv rolle ROS tilhørende signalisering i celle apoptose. Disse funnene kan også være relatert til følsomheten av kreftceller til å drepe effekten av målrettede medikamenter. For å teste denne hypotesen, vi endret det opprinnelige nettverket ved å fjerne enten crosstalk AKT-ASK1 eller ROS, og deretter simulert nettverks responser i innstillingene for vedvarende EGFR aktivering og akutt EGFR inaktivering. Figur 6A presenterer simuleringsresultatene når du fjerner crosstalk AKT-ASK1. Selvfølgelig, høye nivåer av p-ERK og p-AKT i innstillingen av vedvarende aktivering EGFR og en rask nedgang på skrå EGFR-inhibering (se figur 6A) ble observert, noe som er svært lik den modelleringsresultater som oppnås på det opprinnelige nettverket. Imidlertid, etter fjerning av krysstale AKT-ASK1 holder p-p38 i et høyt nivå i tilfelle av enten vedvarende EGFR aktivering eller akutt EGFR inhibering, noe som tyder på en sterkere apoptotisk kapasitet. Figur 6B viser modelleringsresultatene når du fjerner ROS. I likhet med den saken når du fjerner AKT-ASK1, overvåket vi fortsatt høye nivåer av p-ERK og p-AKT i innstillingen av vedvarende EGFR aktivering og en rask nedgang på akutt EGFR hemming. Imidlertid ROS fjerning resulterte i et lavt nivå av p-p38 i tilfellet av enten vedvarende EGFR aktivering eller akutt EGFR inaktivering. Disse data viser at fjerning av ROS fører til tap av apoptotiske kapasitet.
Den virtuelle tilfelle av EGFR inhibering ble gjort ved tid 0 timer. (A) Virkningen av å fjerne krysstale AKT-ASK1 på konsentrasjonsendringer p-ERK, p-AKT og p-P38. (B) Effekten av ROS fjerning av konsentrasjonen endringer av p-ERK, p-AKT og p-P38.
Sammen simuleringsresultatene som oppnås her tyder på at det er en sterkere apoptotisk potensial eksisterende i normal tilstand av kreftceller, som er undertrykt av den negative crosstalk AKT-ASK1 mellom PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveier. Utgivelsen av apoptotiske potensial på grunn av filtrert bort av negativ crosstalk AKT-ASK1 på EGFR inaktivering kan være en viktig faktor som forårsaker celledød, i tillegg til hemming av spredning /pro-overlevelse signalering. Spesielt kan den raske utgivelsen av akkumulert apoptotisk potensial være en viktig årsak som fører til følsomheten av kreftceller til å drepe effekten av legemidler som er rettet mot den avhengige onkogen.
Eksperimentelle bevis for eksistensen av ROS og apoptotisk potensial i EGFR-avhengige kreftceller
modellen er beskrevet ovenfor er noe kunstig, noe som kanskje ikke samsvarer godt med den faktiske EGFR avhengige kreftceller. Derfor også utførte vi en rekke eksperimenter for å undersøke flere viktige problemstillinger knyttet til vår modellering. To ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer HCC827 og NCI-H460 (H460) ble valgt for eksperimenter; HCC827 er en typisk EGFR avhengige kreftcellelinje, og H460 er ikke avhengige av EGFR, som er for sammenligning. Den første eksperiment ble utformet for å undersøke ROS-nivåer i de to NSCLC-cellelinjer. Det intracellulære ROS-nivået ble vist ved 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) [56], et ROS responsive molekylær probe, og visualisert ved hjelp av et invertert mikroskop fluorescens. Som vist i figur 7, ble et meget høyt nivå av ROS påvist i de EGFR-avhengige HCC827 celler, mens ROS kan neppe oppfattes i H460-celler. Dette funnet reflekterer en faktum at HCC827 lider et stort ROS spenning, eller med andre ord, bærer HCC827 en sterkere apoptotisk potensial. Likevel HCC827 fortsatt holder kraftig spredning evne, noe som tyder på at den apoptotiske potensialet er godt undertrykt.
ROS-probe-signaler samt DAPI kjernefysiske lokalisering i HCC827 og H460 ble presentert alene eller sammen (Merge).
Deretter ble western blot analyse og flowcytometri (FCM) analyser ble brukt for å undersøke hvorvidt aktivering av p38 samt apoptose av kreftceller kan bli utløst gjennom AKT inhibering. Vi behandlet HCC827 og H460 celler med 1fiM Wortmannin; Wortmannin er en hemmer av PI3K /AKT signalering. Som vist i figur 8A, kan Wortmannin behandling av HCC827 celler kan forårsake nesten fullstendig hemming av AKT og stor akkumulering av p-p38 innen 4 timer etter behandling. For H460-celler, kan Wortmannin behandling også føre til nesten fullstendig hemming av AKT, men meget liten akkumulering av p-p38 uten å endre den intracellulære ROS-nivå (fig S1). Resultatene av FCM-analyser (figur 8b) viser at Wortmannin behandling kan resultere i en økning av apoptose priser både i HCC827 og H460 celler. I sammenligning med H460, HCC827 celler oppviste mye mer apoptose etter 10 pM Wortmannin behandling. Disse eksperimentene demonstrerer at inaktiveringen av overlevelse effektor p-AKT fører til hurtig frigjøring av akkumulert apoptotisk potensial i EGFR-avhengige kreftceller, som kan være en viktig årsak som fører til følsomheten av tumorceller til legemidler som er rettet mot den avhengige onkogen EGFR .
(A) Immunoblotting med angitt antistoffer for å vise fosforylering av AKT og p38 i HCC827 og H460 celler behandlet med 1 mikrometer Wortmannin (WM). (B) Apoptose av HCC827 og H460-celler med eller uten 10 mM Wortmannin (WM) behandling i 24 timer. Apoptose priser er oppgitt i prosent.
Siden vi har vist eksistensen av apoptotiske potensial på grunn av ROS stress i EGFR-avhengige kreftceller, vi videre postulere at Servitutt av ROS stress kan desensitize kreft celler til målrettet behandling. For å teste denne hypotesen, behandlet vi HCC827 celler med vitamin c, en antioksidant som kan brukes til å delvis redusere ROS stress. Deretter FCM og western blot analyser ble utført for å teste celle apoptose eksponering mot EGFR inhibitor gefitinib. Som vist i figur 9A, vitamin c redusere apoptose av HCC827 celler behandlet med gefitinib sammenlignet med kontrollgruppen som ikke vitamin C ble anvendt. Figur 9B viser resultatene av Western blot analyser som viser at reduksjon av ROS faktisk redusert p-p38-nivå i HCC827 celler behandlet med gefitinib. På samme tid, også la vi merke til at lindring av ROS reduserte p-ERK og p-AKT nivå også. En mulig forklaring kan være at ROS stress kan fremme spredning /overlevelse, i tillegg til å indusere apoptose [57] – [59], derav reduksjon av ROS consequentially fører til en reduksjon av p-ERK og p-AKT. Vi erkjenner at dette ikke får refleksjon fra våre modelleringsresultater siden vår matematisk modell ignorert signalanlegget fra ROS til ERK /AKT, som ikke er kjent i dag. I tillegg ble en MTT analyse utført for å teste levedyktigheten av HCC827 celler. Resultatet viser at vitamin C kan redusere cytotoksisitet av gefitinib i HCC827 celler (figur 9C). Disse resultatene tyder på at følsomheten av HCC827 celler til EGFR-hemmer gefitinib er redusert på grunn av reduksjon av apoptotisk potensial.
HCC827 celler ble behandlet med vitamin c (VC), gefitinib (GEF) eller deres kombinasjon (GEF + vc). (A) Strømningscytometri detektering av apoptose av HCC827 cellene under hver behandling i 24 timer. Apoptose priser av behandlinger er gitt som prosent. (B) Immunoblotting med angitte antistoffer for å vise fosforylering av ERK, AKT og p38 i HCC827 celler behandlet med angitte midler. 1fiM gefitinib, ble 1fiM vitamin c eller deres kombinasjon brukes. (C) Et cellelevedyktighet HCC827 celler eksponering for angitte midler målt ved MTT. 1 nM gefitinib, ble 10 nM vitamin c eller deres kombinasjon brukes.
Diskusjoner
Begrepet «onkogen avhengighet» har nå blitt akseptert av flere og flere forskere gjennom det siste tiåret . Likevel er mekanismen bak den oncogene avhengighet er langt fra forstått. I denne undersøkelsen har vi utviklet en matematisk modell av EGFR-assosiert signalnettverk. Vi erkjenner at det etablerte nettverksmodellen ikke inkluderer alle signalveier og komponenter som regulerer overlevelse og apoptose av kreftceller; etablering av et komplett nettverksmodell er upraktisk i dag. Fra et annet synspunkt, ignorerer andre alternative signalveier kan gi en heldig lykketreff at den etablerte modellen flere stenger til EGFR avhengige staten.
Simuleringer med den validerte EGFR-assosiert nettverksmodell sammen med den eksperimentelle validering avsløre eksistensen av apoptotisk potensial. Den apoptotiske potensialet kan bli indusert ved hjelp av forskjellige spenninger, typisk f.eks ROS. Kreftceller ofte viser økte nivåer av intracellulært ROS [60], [61]. Mange faktorer kan bidra til ROS generasjon [61]. Aktivering av onkogen EGFR kan bringe på ROS generasjon via sekvensiell aktivering av PI3K, Rac og NADPH oksidase [48]. I tillegg kan hypoksi-reperfusjon i tumoren mikromiljøet føre til ROS produksjon, som igjen kan innlede en viskøs syklus av mitokondriell skade og videre ROS generasjon [62]. I normale celler, kunne ROS lindres ved å engasjere glykolysen og nedregulere mitokondriefunksjon [63]. Kreftceller har ofte mangel i ROS reduksjon systemet på grunn av genetiske endringer, som hindrer clearance av ROS [61]. Oppbyggingen av ROS resulterer vanligvis i apoptose gjennom sekvensiell ROS /ASK1 /p38-aktivering [47], [64]. Ikke desto mindre, er aktivering av pro-apoptotiske effektor p38 inhibert av negativ krysstale AKT-ASK1 i kreftceller [52], [65]. Når reduksjon av negative crosstalk AKT-ASK1, gjennom for eksempel inaktivering av AKT, den apoptotiske potensialet kan utløses, og dermed indusere celle apoptose [53].
Den raske utgivelsen av akkumulert apoptotisk potensial som følge onkogen hemming er en viktig årsak som fører til følsomheten av tumorceller til de drepte virkningene av medikament som er rettet mot den avhengige onkogen, som er den viktigste kjennetegn på avhengighet onkogenet. Men det betyr ikke at den samlede apoptotisk utfallet i respons til onkogen inaktivering er bidratt bare av apoptotiske potensial. Det har blitt anerkjent som EGFR kan produsere pro-apoptotiske utfallet gjennom å aktivere noen nedstrøms effektor veier som har vært knyttet til pro-apoptotiske utfall. For eksempel kan EGFR binde direkte til det såkalte «døds ligand» FAS /CD95 [66], dermed fører til apoptotisk resultat. Nedstrøms Ras kan være pro-apoptotiske via en interaksjon med effektor målet Nore1 [67].
Funn i denne studien kan også ha kliniske implikasjoner i målrettet kreftbehandling samt i anti-kreft narkotika utvikling. For eksempel kan utelukkende bruk av ERK eller AKT hemmer ikke ta med en god terapeutisk effekt selv til pasienter med EGFR-avhengige kreft. Faber et al. [68] har vist at PI3K /AKT inhibering ikke fremmer betydelig apoptose i EGFR-avhengige kreftformer. Men blokerer både PI3K /AKT og Ras /MEK samtidig ført til apoptose til samme nivå som de EGFR-hemmere. I tillegg kan anvendelse av midler som er til fordel økningen av apoptotiske potensiell ytterligere å øke følsomheten av tumorceller til målrettede medikamenter. For eksempel har det blitt rapportert at ROS-genererende midler har selektive virkninger i drepe målrettede-terapi-resistente kreft [69], [70]. Omvendt midler som kan bidra til å redusere apoptotisk potensial kan redusere følsomheten av tumorceller til de EGFR-hemmere [59], som bør unngås å bruke klinisk. Til slutt, denne studien antyder også at en god anti-kreft mål bør ha en karakter som sin funksjonelle inhibering bør være til nytte for frigivelse av akkumulert apoptose potensial i kreftceller, i tillegg til blokkering av overlevelse.
Oppsummert våre systemer biologi modellering viser at det er en sterkere apoptotisk potensial som finnes i de EGFR-avhengige kreftformer, som i stor grad undertrykket av den negative krysstale mellom PI3K /AKT og ASK1 /p38 signalveier. Inhibering av overlevelsessignaler og samtidig frigjøring av akkumulert apoptotisk potensial i fellesskap bidrar til tumor celledød som følge av hemming av avhengige onkogenet i EGFR-avhengige kreftformer. Totalt sett er dette det første forsøket på å forstå «onkogen avhengighet» fra systembiologi synspunkt. Ytterligere innsikt i mekanismene bak onkogen avhengighet fra systembiologi synspunkt er fortsatt sterkt nødvendig. Noen fremskritt på dette feltet vil til slutt gagne målrettet kreftbehandling samt anti-kreft narkotika utvikling.
Materialer og metoder
Model Development
Nettverksmodellen ble utviklet ved hjelp av Matlab (MathWorks, MA, USA, https://www.mathworks.com). Informasjonen for alle signalveier og topologi av nettverket ble samlet inn fra forskjellige publiserte arbeider. Molekylære interaksjoner i modellen ble beskrevet av et sett med koblede oder, som ble utledet basert på Massevirkningsloven.
