Abstract
Micro RNA (mirnas) regulerer uttrykket av målgener posttranscriptionally ved sammenkobling ufullstendig med mRNA i en sekvens-spesifikk måte. Omtrent 30% av humane gener som er regulert av mirnas, og en enkelt miRNA er i stand til å redusere produksjonen av hundrevis av proteiner ved hjelp av ufullstendig sammenkoblingen ved miRNA-mRNA-binding. I det siste har bevis implicating mirnas i utviklingen av lungekrefttilfellene har vært voksende. Spesielt MIR-19a, som er sterkt uttrykt i maligne lungekreftceller, er ansett som den tasten miRNA for tumorigenesis. Men dens direkte mål står underreported. I denne studien har vi fokusert på seks potensielle Mir-19a målgener valgt av miRNA mål prediksjon programvare. For å evaluere disse genene som direkte MIR-19a målgener, utførte vi luciferase, pull-down, og Western blot analyser. Luciferaseaktiviteten av plasmider med hverandre MIR-19a-bindingssete ble observert å synke, mens øket luciferaseaktivitet ble observert i nærvær av anti-MIR-19a låst nukleinsyre (LNA). Rullegardin analysen viste biotinylert MIR-19a å binde seg til AGO2 protein og fire av seks mulige mål mRNA. Western blot-analyse viste at ekspresjonsnivåene av fire gener endret avhengig av behandling med MIR-19a etterligne eller anti-MIR-19a-LNA. Til slutt,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
ble identifisert som MIR-19a mål. For å undersøke funksjonen av disse fire målgener i lungekreftceller, ble LK79 (som har høy MIR-19a ekspresjon) og A549 (som har lav MIR-19a uttrykk) anvendt. Ekspresjonen av de fire mål-proteinene var høyere i A549 enn i LK79 celler. De fire MIR-19a target cDNA ekspresjonsvektorer undertrykte celleviabilitet, kolonidannelse, migrasjon og invasjon av A549 og LK79 celler, men LK79 celler transfektert med
FOXP1 Hotell og
TP53INP1
cDNA viste ingen forskjell sammenlignet med kontrollcellene i invasjonen analysen
Citation. Yamamoto K, Ito S, Hanafusa H, Shimizu K, Ouchida M (2015) Avdekke direkte mål av MiR-19a Involvert i Lung Cancer Progresjon. PLoS ONE 10 (9): e0137887. doi: 10,1371 /journal.pone.0137887
Redaktør: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, USA
mottatt: 18 juni 2015; Godkjent: 24 august 2015; Publisert: 14. september 2015
Copyright: © 2015 Yamamoto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (nr 24591905 til MO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mikro RNA (mirnas) er ~ 22-bp ikke-kodende små RNA som posttranscriptionally regulerer genekspresjon i en sekvens-spesifikk måte [1]. mirnas er kodet av enten egne gener eller innebygd i introner av «host» gener og er transkribert av RNA Polymerase II som en del av en lang avkortet og polyadenylert transkripsjon (pri-miRNA) [2]. Pri-mirnas gjennomgå ytterligere behandling som innebærer fjerning av en hårnål struktur sammen med flankerende sekvenser av et medlem av RNase III familie drosha å lage pre-miRNA [3-4]. Forhånds mirnas blir eksportert til cytoplasma ved exportin-5 der de blir ytterligere spaltet av dicer som fjerner terminal sløyfe skape en ufullkommen RNA duplex [3-5]. En av trådene er fortrinnsvis bundet av RNA-indusert stanse kompleks (RISC) som inneholder argonaute (AGO) familie proteiner. Selv om begge tilnærmingene kan bli stabilt assosiert med AGO familie proteiner (lasting trinn) bare én tråd (anvisning tråd; miRNA) beholdes av AGO protein, mens den andre tråden (passasjer strand, miRNA *) er degradert. De menneskelige AGO proteiner (AGO1 til 4) er preget av et konservert Piwi domene som er strukturelt ligner på RNase H. Piwi domene samhandler med 5’end av modne miRNA og er involvert i spalting av målet mRNA. Alle fire menneskelige AGO proteiner viser bemerkelsesverdig lignende strukturelle preferanser for små-RNA tomannsboliger: sentrale uoverensstemmelser (anvisning posisjon 8-11) fremmer RISC lasting og uoverensstemmelser i frøet (guide stilling 2-7) eller 3′-mid regioner (guide stilling 12-15) er nødvendig for å slappe [6]. Det er vanskelig for små RNA tomannsboliger som bærer uoverensstemmelser i frøet regionen for å laste inn AGO proteiner [6-12]. På den annen side, anerkjennelse av en miRNA med target mRNA krever fullstendig eller nesten fullstendig kamper med frøet regionen. Mer enn 2500 mirnas er rapportert hos mennesker (GRCh38, https://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl?org=has), og 30% av menneskets gener kan bli regulert av mirnas [13] .
Lungekreft er ansvarlig for 19,4% av alle kreftrelaterte dødsfall, noe som utgjorde ca 1.59 million dødsfall på verdensbasis i 2012 (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/) . Lungekreft progresjon er tilknyttet flere genetiske og epigenetiske endringer som påvirker genekspresjon av et bredt utvalg av gener. Spesielt har endringer i ekspresjon av mer enn to dusin miRNA vært rapportert hos lungekreftpasienter [14], som blant annet nylig rapportert overekspresjon av MIR-17-92 klynge (oncomiR-1) som koder for, blant annet, MIR-19a og 19b [14]. OncomiR-1 er involvert i regulering av celleoverlevelse, proliferasjon, differensiering og angiogenese [15, 16]. Noen gener, for eksempel
STAT3 Hotell og
MAPK14
, som er involvert i tumordannelse, har blitt rapportert som målgener av MIR-17-92 i lungekreftceller [17]. MiR-19a, som er sterkt uttrykt i ondartede lunge kreftceller, regnes som nøkkelen miRNA i tumorigenesis [18]. Cell vekst og levedyktighet skiller mellom lymfomer transfektert med vill eller mutert MIR-19a; Derfor kan MIR-19a også være assosiert med cellevekst [18]. Videre aktiverer MIR-19a den Akt-mTOR veien ved å undertrykke tumor suppressor
PTEN product: [18, 19]. Videre
SOCS-en product: [20],
THBS1 product: [21],
IMPDH1
,
NPEPL1 product: [22], og
TNF -α
er også kjent som mål for Mir-19a [23].
Men som miRNA-mRNA bindende avhenger av frø sekvenser og ufullkommen sammenkobling av sine tråder, MIR-19a må ha enda uidentifisert målrette gener som påvirker utbruddet og progresjon av lungekreft. I denne studien identifiserte vi roman målgener av MIR-19a og viste den undertrykkende evne målgener på vekst, migrasjon, og invasjonen av lunge kreftceller.
Materialer og metoder
Valg av MIR-19a target kandidat gener
Potensielle målgener av MIR-19a ble spådd ved hjelp av følgende miRNA mål prediksjon programvare: PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu), TargetScan ( https://targetscan.org), Miranda (https://cbio.mskcc.org), og miGTS (Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Tokyo, Japan). Prediksjon ga 3,398 gener. For å begrense omfanget av mulige MIR-19a mål, ble gener involvert i kreft utvinnes ved søk raffinement ved å inkludere mer enn to ord relatert til kreft (svulst, Lyddemper, og apoptose) i den foreløpige litteratursøk. Selv om mer enn 10 gener forble som MIR-19a mål kandidater, seks gener (unntatt genene allerede rapportert som MIR-19a mål), nemlig gaffelhodeboks P1 (
FOXP1
), p53-avhengig skade-induserbar atom protein 1 (
TP53INP1
), TNF-α-indusert protein 3 (
TNFAIP3
), tumor suppressor kandidat 2 (
TUSC2
), SIVA apoptose-induserende faktor 1 (
SIVA1
), og tumor nekrose faktor reseptor super 12A (
TNFRSF12A
), ble valgt for denne studien.
Cell kultur
normalt humant lunge fibroblast cellelinje, WI-38 og human normal embryonisk nyrecellelinje HEK293 ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC). Menneskelig lunge liten-cell carcinoma cellelinjer SBC-5 og LK-79 og human ikke-småcellet lungekreft cellelinjer PC3, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu65A, arma 99c, har RERF-LCMS, og A549 blitt anvendt i vårt laboratorium [24]. HEK293, SBC-5, Lu-65A, PC3, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu-99c, og RERF-LCMS ble dyrket i DMEM (Life Technologies, Foster City, CA , USA) eller RPMI-1640 (Wako, Osaka, Japan). LK-79 og A549 ble dyrket i blandet DMEM og RPMI-1640 (1: 1) supplert med 10% FBS (Life Technologies), 100 enheter /ml penicillin G og 100 mg /ml streptomycin (Meiji Seika, Tokyo, Japan). Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2.
Eksogent miRNA transfeksjon eksperimenter ble utført med MIR-19a etterligne (1, 5 og 10 nM) (CosmoBio, Tokyo, Japan) ved hjelp HiPerFect Transfeksjon Reagens (Qiagen, Venlo, Nederland). Sekvensene var som følger: MIR-19a etterligne, sanse 5′-p-AUC CGC GCG AUA GUA CGU AUU-3’og antisense 5′-p-UAC GUA CUA UCG CGC GGA UUU-3′; tilfeldig miRNA (kontroll miRNA), følelse 5′-p-Ugu GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA-3’og antisense 5′-p- UUA Guu UUG CAU AGU UGC AC-3 «. Uttrykket av MIR-19a ble slått ned av transfeksjon med anti-MIR-19a låst nukleinsyre (LNA) (30 nM, 5′-TCA GTT TTG CAT AGA TTT GCA CA-3′) eller en kontroll-LNA oligonukleotid målretting GFP (5′ -ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG C-3») (Gene design Inc., Osaka, Japan) ved hjelp HiPerFect Transfeksjon Reagens (Qiagen). Mir-19a target cDNA uttrykk plasmider ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies). De transfekterte celler ble underkastet celle-levedyktighet analyser og RNA-ekstraksjon 24 timer etter transfeksjon, og protein utvinning 72 timer etter transfeksjon. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av et vannløselig tetrazoliumsalt assay, nemlig 2- [2-metoksy-4-nitro-fenyl] -3- [4-nitrofenyl] -5- [2,4-disulfofenyl] -2H-tetrazolium mononatrium salt assay (WST-1; Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland).
Colony formasjon analysen
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
cDNA uttrykk plasmider ble transfektert inn i A549 og LK79 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 og valgt av G418 (100-400 mg /ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA ) i 6-brønns plater. Etter 3 uker ble kolonier bestående av mer enn 200 celler farget med krystallfiolett. Antallet kolonier ble deretter regnet, og gjennomsnittsverdier ble beregnet i tre eksemplarer brønner.
Cell vekst
A549 eller LK79 celler transfektert med
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, eller
TUSC2
cDNA uttrykk plasmid vektor ble valgt ut av G418 for å få celler med stabil uttrykk. Etter 3 uker ble den hovedpopulasjon av G418-resistente celler oppsamlet og anvendt for cellevekstanalyse, migrering analysen, og invasjon assay. For cellevekstanalyse ble celler med stabil ekspresjon dyrket ved 500 celler /brønn i en 96-brønns plate. Etter 24, 48 og 72 timer, cellene ble telt ved bruk av Hoechst 33342 farging og mikroskopi. Gjennomsnittsverdier av cellene med tydelig fargede kjerner ble beregnet i triplikate brønner.
Migration assay
Cellene ble dyrket til 95% konfluens i en 60 mm plate og skrapet med en pipettespiss. De flytende celler ble fjernet ved vasking med fosfatbufret saltvann (PBS), og mikroskopiske bilder av sårene ble oppnådd etter 24 timer.
Invasion assay
A Corning Matrigel Invasion Chamber (24- brønns plate 8,0 mikron, Corning, NY, USA) ble anvendt for invasjonen analysen. A549 (1 x 10
5) eller LK79 (2,5 x 10
4) celler ble dyrket med serumfritt DMEM i det øvre kammer atskilt fra de nedre kamre, som ble levert sammen med DMEM med 10% FBS ved gjennomtrengelig gjennomsiktige PET membraner. Etter 24 timer ble cellene fiksert og farget med Cyto Kort A og B løsning (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan). Ikke-invasive celler på den øvre side av membranen ble forsiktig fjernet ved å tørke, og cellene på den nedre siden ble farget og observert av et mikroskop. Antallet invasive celler ble talt opp, og gjennomsnittsverdier ble beregnet i sju felt per kammer.
Pull-down analyse av målet mRNA fra Mir-19a
Semi-konfluente HEK293 celler på 90- mm kulturskåler ble vasket med kald PBS, høstet ved en skraper, og behandlet med 0,5 ml 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 70 mM KCl, 2,5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 80 U /ml RNase inhibitor (Life Technologies), og 1 x protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) på is i 20 min og sentrifugert ved 12 000
x g
i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble overført til et nytt rør. Biotinylated dobbelttrådet RNA (8 nmol) av MIR-19a (følelse 5′-p-Ugu GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA-biotin-3’og antisense 5′-p-AGU UUU GCA UAG auu UGC AUA AG-3 «) eller kontroll tilfeldig RNA (forstand 5′-p-AUC CGC GCG AUA GUA CGU AUU-biotin-3’og antisense-5»-p-UAC GUA CUA UCG CGC GGA UUU-3 «) ble tilsatt til supernatanten (500 pl) og inkubert ved 4 ° C i 30 minutter med 8-rpm risting og deretter ved 30 ° C i 1 time med 30 rpm risting. Ekstraktet ble inkubert ved 4 ° C i 1 time med 10 ul streptavidin-muteinet Matrix (Roche Applied Science), som ble forbehandlet med utvinning buffer [250 pg RNase-fri BSA og 100 pg gjær tRNA i 500 ul 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 70 mM KCl, 2,5 mM EDTA og 0,05% NP-40] i 3 timer og vasket med den samme buffer to ganger. Den streptavidin /biotin-miRNA /mRNA-komplekset ble samlet opp etter en sentrifugering ved 5000
x g
i 30 s og vasket 5 ganger ved 4 ° C i 5 minutter med 8-rpm risting ved anvendelse av 20 mM Tris-HCl ( pH 7,4), 400 mM KCl, og 0,5% NP-40. Biotin-miRNA /mRNA-komplekset ble eluert med 250 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 400 mM KCI, 0,5% NP-40, 5 mM biotin, og 80 U /ml RNase inhibitor ved 42 ° C i fem min.
PTEN
genet, rapporteres å være en MIR-19a mål, ble brukt som positiv kontroll, og
DAPK1
, hvis sekvens samsvarte ikke med MIR-19a frø sekvenser ved 3’uoversatt regionen (UTR) av sin mRNA, ble brukt som negativ kontroll.
Plasmider
cDNA av
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
ble forsterket ved hjelp av PCR med gen-spesifikke primere og humant normalt cDNA revers transkribert fra HEK293 mRNA ved hjelp ReverTra Ace-α kit (Toyobo, Osaka, Japan). CDNA ble klonet i pBluescript, og bekreftet ved DNA-sekvensering ved bruk av ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). FLAG tag sekvenser ble smeltet i 5′-enden av cDNA i ramme, og de ble satt inn i pIRES2-EGFP vektor (Clontech, Mountain View, CA, USA) med
Nhe
jeg og
Sal
I restriksjonsseter. Disse sekvensene ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering.
Luciferase reporter analysen
3′-UTR fragmenter som inneholder en mulig MIR-19a-bindende regionen i kandidatgener ble syntetisert som oligonukleotider for begge tilnærmingene, som kan produsere
Xba
jeg sammenhengende ender etter gløding. De glødet dobbelt garn ble klonet inn i 3′-UTR
Xba
jeg stedet
Renilla
luciferase i PTK-HRG vektor, som var en phRG-B vektor (Promega, Madison, WI, USA) som bærer luciferase cDNA nedstrøms av herpes tymidin kinase promoter som vi hadde satt inn. De innsatte fragmenter ble sekvensert, og deres orientering og fragment nummer ble bestemt. For luciferase-assay, konstruerer pTK-HRG (180 ng) ble ko-transfektert med ildflue luciferase reporter plasmid POA-SRa-luciferase (20 ng) som en intern kontroll inn i HEK293-celler. PTK-HRG konstruere uten innskudd ble anvendt som en kontroll. Luciferase-aktiviteten ble målt 48 timer etter transfeksjon ved bruk av en dual luciferase-rapportøranalysesystemet (Promega) på en Labosystems Luminoskan RT instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA). Den relative luciferase aktiviteten ble beregnet ved å normal
Renilla
luminescens til Firefly luminescens. For hver eksperimentell utprøving ble hver prøve analysert i duplikat.
p
-verdi ble beregnet ved hjelp av tosidige
t
-test. For det andre luciferase-analysen, PTK-HRG-konstruksjonene ble ko-transfektert med anti-MIR-19a LNA eller kontroll LNA (100 nM) under de samme betingelser. PTK-HRG konstruere bærer en mismatch med den sentrale regionen av MIR-19a frø sekvenser ble brukt som en negativ kontroll.
Kvantitativ revers-transkripsjon PCR
Det trakk ned biotin-miRNA /mRNA-kompleks ble behandlet med guanidium-fenol-kloroform-ekstraksjon prosedyre med ISOGEN-LS (Nippon Gene, Tokyo, Japan), etterfulgt av DNase i (Sigma-Aldrich) og ISOGEN-LS behandling. MRNA ble reverstranskribert i et totalt volum på 20 pl ved bruk av ReverTra Ace-α kit. CDNA av den biotin-miRNA /mRNA-komplekset ble amplifisert ved PCR i 20 ul volum inneholdende 0,2 ul av hver revers transkripsjonsreaksjon, og 10 pl av den TaqMan® 2 x Universal PCR Master Mix (Life Technologies) i en 7300 Fast Real- time PCR System (40 sykluser av 95 ° C i 15 s og 58 ° C i 5 minutter). Primere for å detektere kandidat MIR-19a target cDNA ble konstruert som flankerer en mulig MIR-19a-bindende regionen i mål-mRNA (S1 tabell). De TaqMan probe sekvenser med 5′-FAM og 3′-TAMRA merking for real-time PCR er vist i S2 tabell. Uttrykket nivå, dvs. syklus terskel (CT) verdi, for hvert mål mRNA i rullegardin prøven med MIR-19a-biotin ble sammenlignet med CT verdien av det i rullegardin prøven med MIR-random-biotin og vist som den relative forholdet. Hver PCR ble utført fire ganger, og
p
-verdi ble beregnet ved hjelp av tosidige
t
-test.
For MIR-19a uttrykk analyse, totalt cellulært RNA ble ekstrahert ved hjelp ISOGEN (Nippon Gene). Den kvantitative real-time PCR-analyse av MIR-19a ble utført med en TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit, TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix og TaqMan mikroRNA analyse (Life Technologies). Total RNA (10 ng) ble revers-transkribert i et totalt volum på 15 pl ved anvendelse av en TaqMan mikroRNA Reverse Transcription kit. Porsjoner av hver revers transkripsjonsreaksjon ble amplifisert ved PCR i 20 pl totalt volum inneholdende 10 mL av den TaqMan® 2 x Universal Master Mix PCR. PCR ble utført på en 7300 Fast Real-time PCR System med 50 sykluser av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 sek. Ekspresjonsnivået (CT-verdi) på MIR-19a ble normalisert til CT-verdien av en liten kjerne RNA, U6B, som var ko-amplifisert som et endogent kontroll. Den ΔCT ble beregnet som differansen i CT-verdier mellom MIR-19a og internkontrollen U6B i en prøve. Sammenlikninger av miRNA ekspresjonsnivåer ble utført ved bruk av ΔΔCT metode, hvor ΔΔCT var forskjellen i ΔCT verdiene av en forsøksprøve sammenlignet med kontrollprøven, og 2
-ΔΔCT representerer ganger endring i miRNA uttrykk.
for kvantitativ real-time PCR-analyse av Mir-19a målgener,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
cellulær mRNA ble reverstranskribert med den ReverTra Ace First Strand cDNA Synthesis Kit (Toyobo), og cDNA ble amplifisert ved PCR i 20 pl totalt volum inneholdende 0,2 ul av hver revers transkripsjonsreaksjon, og 10 ul av de TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix (Life Technologies) i en 7300 Fast real-Time PCR System med 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 58 ° C i 5 min. Primerne og probene som brukes til å oppdage disse cDNA var de samme som de for detektering cDNAs av biotin-miRNA /mRNA-komplekset som er beskrevet ovenfor. CT ble beregnet som forskjellen i CT-verdier mellom hver MIR-19a target-genet og β-aktin-genet i en prøve. Uttrykket nivåer av målet mRNA ble også målt ved hjelp av ΔΔCT metoden.
Western blotting-analyse
For bekreftelse av AGO2 proteinbinding med biotin-miRNA /mRNA på
in vitro
pull-down, komplekset ble kombinert med gel lastebuffer, oppvarmet til 95 ° C i 10 minutter, og deretter separert på 12% SDS-polyakrylamidgeler og elektrooverført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Life Technologies). Membranene ble blokkert over natten ved 4 ° C i 3% BSA /PBS og deretter inkubert i 4 timer ved romtemperatur med anti-AGO2 monoklonalt antistoff (No.016-20861, Wako, Osaka, Japan). Filtrene ble vasket med PBS /0,05% Tween-20 og deretter inkubert med alkalisk fosfatase-konjugerte antistoffer. Proteinet signalet ble visualisert ved hjelp av FLA-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan).
For effekten av MIR-19a på protein uttrykk, på 72 timer etter transfeksjon av HEK293 og A549 med MIR-19a ligne eller anti-MIR-19a-LNA, proteinprøvene (25 pg) ble separert på 8% eller 12% SDS-polyakrylamidgeler, elektrooverført på PVDF-membraner, og inkubert over natten ved 4 ° C med følgende antistoffer: anti-TP53INP1 (T -17, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), anti-FOXP1 (ab16645; Abcam, Cambridge, UK), anti-TNFAIP3 (ab74037; Abcam), anti-TUSC2 (ab70182; Abcam), anti-SIVA1 (ab67620 ; Abcam), og anti-TNFRSF12A (SAK-4, Santa Cruz Biotechnology). Anti-β-aktin (AC-15; Sigma-Aldrich). Ble anvendt som en kontroll lasting
Statistisk analyse
De relative forhold i luciferase, RNA-ekspresjon, celle-levedyktighet, cellevekst, kolonidannelse, og invasjonsforsøk er uttrykt som middelverdier ± SD og ble analysert ved hjelp av den tosidige
t
-test. En verdi på
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Evaluering av MIR-19a target kandidat gener ved luciferase reporter analysen
Vi har fokusert på seks MIR-19a target gen kandidater,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
,
TUSC2
,
SIVA1
, og
TNFRSF12A
, som hadde er valgt ved hjelp av miRNA mål prediksjon programvare. Nukleotidsekvensene til den mulige miRNA-bindingssete på det 3′-UTR av deres mRNA ble oppnådd fra miRNA target forutsigelse programvare (figur 1A). For å verifisere om miRNA-bindingsseter er regulert av MIR-19a
in vivo
, bygget vi luciferaserapportørplasmid plasmider med hver MIR-19a bindingssete i 3′-UTR av
Renilla
luciferase gen (fig 1B). Luciferaserapportørplasmid plasmider med sekvensene ikke samsvarer med MIR-19a frø regionen består den negative kontrollen. Vi transfektert
Renilla
luciferase reporter plasmider som bærer mulige MIR-19a-bindende områder av MIR-19a mål kandidater og intern kontroll ildflue luciferase plasmider i HEK293 celler der MIR-19a uttrykk ble bekreftet. Plasmidene ble deretter undersøkt for luciferase-aktivitet av den dual-luciferase-systemet. Luciferaseaktiviteten av alle plasmider med de miRNA-bindingsseter var signifikant lavere enn den til den tomme vektor kontroll (figur 1C), som tyder på at MIR-19a-bindende sekvenser i hver MIR-19a target kandidat mRNA blir gjenkjennes av endogent speil 19a i HEK293 celler. Videre undersøkte vi luciferaseaktiviteten av plasmidene som bærer miRNA-bindende områder under MIR-19a knockdown ved ko-transfeksjon med anti-MIR-19a LNA. Luciferaseaktiviteten av alle plasmider med de miRNA-bindingssetene har økt betydelig i de celler behandlet med anti-MIR-19a LNA sammenlignet med den for celler behandlet med kontroll LNA (Fig 1 D). Disse resultatene antyder muligheten for at disse genene er MIR-19a målgener. Vi deretter utført andre eksperimenter for å vurdere muligheten av disse er MIR-19a målgener.
(A) Oversikt over MIR-19a mål kandidat mRNA. Mir-19a-bindende områder som er identifisert ved hjelp av PicTar, TargetScan eller Miranda programvare vises i 3′-uoversatt (UTR) region av MIR-19a mål kandidat mRNA. (B) Bygging av luciferase vektorer. Mir-19a-bindende områder av kandidatgener og negative kontrollsekvenser (Negativ Ctrl) ble klonet nedstrøms for luciferase ORF på
Xba
restriksjonssete for PTK-HRG vektor. Sense (
øvre
) og antisense (
lavere
) tråder av komplementære sekvenser indikere miRNA målet stedet av mRNA 3′-UTR og MIR-19a sekvenser, henholdsvis. Understreking angir MIR-19a frø sekvenser. Den negative kontrollen plasmidet har uoverensstemmelser i sentrum av MIR-19a frø sekvenser. (C) Luciferaseaktiviteten av konstruksjoner med MIR-19a-bindingssteder ble sammenlignet med den til den tomme vektor, som hadde ingen innsats på
Xba
setet (No-Insert Ctrl), og ble statistisk analysert . (D) luciferase plasmider med Mir-19a-bindingssetet og negative kontroll plasmid ble transfektert med anti-MIR-19a-LNA eller kontroll-LNA (Ctrl). Luciferaseaktiviteten av celler behandlet med anti-MIR-19a-LNA ble sammenlignet med celler behandlet med kontroll-LNA. *,
p
0,05 og **,
p
0.005 ved hjelp av to-tailed
t
-UNDERSØKELSER.
Evaluering av kandidatgener ved en
in vitro
pull-down analyse ved bruk av biotinylert MIR-19a
Mirna målgener ble nylig gjenfunnet av en to-trinns prosedyre hvor mRNA /miRNA /FLAG-AGO2 komplekset ble først trukket ned med en anti-FLAG antistoff, og deretter ble mRNA /biotinylated miRNA kompleks renset ved Streptavidin perler i ekstraktet av cellene transfektert med biotinylert miRNA og FLAG-AGO2 cDNA ekspresjonsvektor [25]. Derfor, for å evaluere våre kandidatgener som MIR-19a mål, vedtok vi forbedret
in vitro
pull-down analysen (figur 2A). Ved første, celleekstrakt ble mildt forberedt fra HEK293 celler hvori tilstrekkelig ekspresjon av hver kandidat mRNA ble påvist (figur 2B). Det biotinylerte dobbelt-trådet MIR-19a eller tak tilfeldig RNA ble inkubert i celleekstrakt for å fremstille et kompleks av biotinylert miRNA enkelt streng med RISC og mRNA. Det biotinylerte miRNA /mRNA /RISC-komplekset ble inkubert med Streptavidin perler i ekstraktet, samlet ved kort sentrifugering, og eluert med elueringsbuffer inneholdende 5 mM biotin fra Streptavidin perler. Det biotinylerte miRNA /mRNA-komplekset ble behandlet med fenol-kloroform-ekstraksjon, DNase I, og revers transkripsjon. Før RT-PCR analyse av målet kandidat gener, fikk vi bekreftet om biotinylated MIR-19a /mRNA Komplekset inneholder RISC komponent AGO2 av western blotting. Ved hjelp av rullegardin kompleks med biotinylert MIR-19a oppviste signalet fra AGO2 proteinet (figur 2C, kolonne 1), mens intet signal ble notert for rullgardin kompleks med biotinylert tilfeldig RNA (figur 2C, kolonne 2), noe som tyder på at biotinylated MIR-19a, mål mRNA, og AGO2 kan danne et kompleks i denne rullegardin analysen. Deretter sammenlignet vi mengden av kandidaten målet mRNA i kompleksene trakk ned med biotinylated MIR-19a og kontrollere tilfeldig RNA av kvantitativ real-time PCR. PCR primere for kandidat målgener ble designet for å forsterke regionen (100 ~ 300 bp) som inneholder MIR-19a-bindingsseter i sin 3′-UTR (S1 tabell). Blant de seks kandidatene,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
mRNA nivåer ble betydelig høyere i komplekset trakk ned med biotinylert MIR -19a enn de av kontrollen (figur 2D). For bekreftelse av denne rullegardinsystem, undersøkte vi en positiv kontroll MIR-19a target genet,
PTEN
, samt en negativ kontroll gen, hvis sekvens samsvarte ikke med MIR-19a frø sekvenser. Vi oppdaget en økt grad av
PTEN
mRNA og redusert nivå av den negative kontrollen genet mRNA i rullegardin kompleks ved hjelp biotinylated MIR-19a. Derfor fokuserte vi på å vurdere
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
gener som MIR-19a mål.
(A) oversikt over
in vitro
rullegardin analysen. Det biotinylerte dobbelt-trådet MIR-19a eller tak tilfeldig RNA ble inkubert i celleekstrakt (trinn 1) for å gi et kompleks av biotinylert miRNA enkelt streng med mål-mRNA og RISC (trinn 2). Det biotinylerte miRNA /mål-mRNA-komplekset ble inkubert med streptavidin perler og trukket ned (trinn 3). Komplekset ble behandlet med DNase I og revers-transkribert (trinn 4). (B) Uttrykket av MIR-19a target kandidat mRNA i HEK293 celler.
PTEN
, kjent som en av MIR-19a målgener, ble anvendt som en positiv kontroll. Genet, hvis sekvens samsvarte ikke med MIR-19a frø sekvenser, ble brukt som negativ kontroll. (C) Bekreftelse på AGO2 protein i biotinylert miRNA /target mRNA kompleks av western blotting med AGO2 antistoff. Biotinylert MIR-19a (spor 1), biotinylert kontroll tilfeldig RNA (spor 2), og biotin (kolonne 3) ble anvendt for pull-down-analyse og underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese og Western blotting. Totalt celleekstrakt ble anvendt som den positive kontroll (felt 4). (D) Påvisning av målet mRNA i biotinylated miRNA /mål-mRNA-komplekset ved real-time RT-PCR. Det relative nivå av hvert mål-mRNA i komplekset trukket ned ved hjelp av biotinylert MIR-19a ble sammenlignet med den komplekse trukket ned ved hjelp av biotinylerte styre tilfeldig RNA. **,
p
0.005 ved hjelp av to-tailed
t
-UNDERSØKELSER.
Evaluering av fire kandidatgener av western blotting
Gener
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
ble evaluert som MIR-19a mål ved hjelp av en annen analyse for å undersøke posttranskripsjonelt regulering av MIR-19a i cellene. I begynnelsen var MIR-19a etterligne eller kontrollere tilfeldig miRNA transfektert inn HEK293 celler for å undersøke om MIR-19a redusert uttrykk av de fire MIR-19a target proteiner. Ved Western blotting ved 72 timer etter transfeksjon, redusert ekspresjon av de fire mål-proteinene ble observert i MIR-19a ligne-behandlede celler sammenlignet med den i kontroll miRNA-behandlede celler (figur 3A). For det andre, ble anti-MIR-19a LNA eller kontroll LNA transfektert inn i HEK293-celler til å slå ned endogen MIR-19a, og ekspresjonen av de fire kandidat proteinene ble analysert ved western blotting. Øket ekspresjon av de fire mål-proteinene ble observert i anti-MIR-19a LNA-behandlede celler sammenlignet med den i kontroll LNA-behandlede celler (figur 3B). Til sammen
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, og
TUSC2
ble bekreftet å være MIR-19a målgener. Ingen endring i SIVA1 eller TNFRSF12A uttrykk ble observert i anti-MIR-19a LNA-behandlede celler i forhold til at i kontroll LNA-behandlede celler (S1 fig).
(A) Expression analyse av kandidat proteiner ved vestre blot analyse ved hjelp av proteiner av HEK293 celler transfektert med MIR-19a etterligne eller kontroll oligo RNA.-, kontroll oligo RNA; +, MIR-19a ligne. (B) Expression analyse av kandidat proteiner ved western blot analyse ved hjelp av proteiner av HEK293 celler transfektert med anti-MIR-19a LNA eller kontroll LNA.-, kontroll LNA; *,
p
*,
p
