Abstract
chemoprotective egenskaper Sulforafane (SF), som stammer fra cruciferous grønnsaker, er allment kjent for å oppstå fra sin potente induksjon av xenobiotisk-metabolizing og antioksidant enzymer. Men mye mindre er kjent om virkningen av SF på effekten av kreftbehandling gjennom modulering av narkotika enzymer. For å identifisere proteiner som er modulert ved en lav konsentrasjon av SF, behandlet vi HT29 kolon kreftceller med 2,5 uM SF. Protein overflod endringer ble detektert ved stabil isotop merking av aminosyrer i cellekultur. Blant 18 proteiner som finnes å være signifikant oppregulert, aldo-keto reduktase 1C3 (AKR1C3), bioactivating DNA kryssbinding prodrug PR-104A, ble ytterligere karakterisert. Preconditioning HT29 celler med SF redusert EF
50 av PR-104A 3,6 ganger. Økningen i PR-104A cytotoksisitet var knyttet til AKR1C3 overflod og aktivitet, både indusert av SF på en doseavhengig måte. Denne effekten var reproduserbar i en andre tykktarmskreft cellelinje SW620, men ikke i andre koloncancercellelinjer hvor AKR1C3 overflod og aktivitet var fraværende eller knapt synlig og kunne ikke bli indusert av SF. Interessant, SF ikke hadde noen vesentlig innflytelse på PR-104A cytotoksisitet i ikke-kreftceller, udødeliggjort human colonic epithelial cellelinjer som uttrykker enten lave eller høye nivåer av AKR1C3. I konklusjonen, forbedret respons av PR-104A etter prekondisjonering med SF var tydelig bare i kreftceller, forutsatt at AKR1C3 er uttrykt, mens dens uttrykk i ikke-kreftceller ikke lokke fram en slik respons. Derfor kan en undergruppe av kreft være utsatt for kombinerte mat-avledet komponent og prodrug-behandlinger med ingen skade på normalt vev
Citation. Erzinger MM, Bovet C, Hecht KM, Senger S, Winiker P, Sobotzki N , et al. (2016) Sulforaphane Forbehandling sensitizes menneske Colon kreft celler mot Bioreductive Anticancer Prodrog PR-104A. PLoS ONE 11 (3): e0150219. doi: 10,1371 /journal.pone.0150219
Redaktør: Douglas Thamm, Colorado State University, USA
mottatt: 26 oktober 2015; Godkjent: 10 februar 2016; Publisert: 07.03.2016
Copyright: © 2016 Erzinger et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av den sveitsiske National Science Foundation (136 247), www.snf.ch.
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Kreft narkotika er ofte forbundet med alvorlige bivirkninger som begrenser dosering potensial, derfor prolegemidler som krever bioaktive i målcellene er aktivt forfulgt som en strategi for å fremme terapeutisk selektivitet [1]. For ytterligere å differensiere mellom mål- og ikke-målceller, spesielt for enzymaktiverte promedikamenter, er en ny alternativ metode for selektivt å forutsetning kreftceller med ikke-giftige mengder av en naturlig bioaktiv forbindelse til en sikker måte å forbedre resistens [2]. Disse forbindelsene ofte up-regulere narkotika metabolizing enzymer som bioactivate narkotika, derfor til tross for lave eksponeringer, kan de ha betydelig innvirkning behandlingsresultater [3]. I motsetning til legemiddelinteraksjoner, har matvare-modulert endringer i legemiddelmetabolisme som påvirker legemidlets effekt i kreftbehandling sjelden blitt behandlet.
Isothiocyanates som sulforaphane (SF) er avledet fra cruciferous grønnsaker, er biotilgjengelig i tykktarmen [ ,,,0],4], og modulere genekspresjon av et stort antall xenobiotisk-metaboliserende enzymer og antioksidant [4-6]. I stor utstrekning er denne prosess mediert av transkripsjonsfaktoren nukleær faktor erytroid 2 relatert faktor to (Nrf2) [7]. Påvirkningen av SF på gentranskripsjon og protein uttrykk har vært preget i gnagermodeller og humane cellelinjer fra ulike vev opprinnelse [8-18], inkludert fire studier som medfører proteomikk tilnærminger [14, 16-18]. SF reagerer med cysteinrestene i Nrf2 repressoren Keap1, noe som resulterer i nukleær translokasjon av Nrf2 og binding av transkripsjonsfaktoren til DNA [7]. Genekspresjon påvirkes hovedsakelig for gener som koder for fase II og avgiftning enzymer, men også cellulære NADPH-regenererende enzymer, antioksidanter, eller xenobiotiske-metaboliserende enzymer [14-18]. De fleste anvendelser av translasjonelle SF tar sikte på å utnytte den regulering potensialet for deaktivering av elektrofiler og reaktive oksygenarter i friske eller pre-maligne celler til kreftforebyggende [15, 19].
SF eller høye nivåer av Nrf2 kan bidra til chemoresistance [7, 20], har det motsatte forholdet også blitt observert, med viktige forskjeller som mekanisme for narkotika handling og celleegenskaper [21]. De fleste kjente tilfeller innebære en direkte terapeutisk funksjon av SF i et legemiddel-lignende måte, men det er begrenset kjennskap angående påvirkning av ikke-toksiske, lave konsentrasjoner av SF potensielt oppnådd ved diett. En prosess med særlig relevans er hvordan transcriptional aktivering av narkotika aktiverer enzymer kan fremme virkningen av kreft forløpere. I denne forbindelse er det blitt observert at når kreftceller (bryst TD47D) ble behandlet med SF, NAD (P) H: quinon oksidoreduktase 1 (NQO1), en aktivator av mitomycin C (MMC), ble indusert, og cellene ble sensibilisert overfor MMC [22]. I en oppfølgingsstudie, ble dimetylfumarat brukt som NQO1 inducer, og de første SF funnene ble bekreftet
in vivo
. Viktigere var det ingen observerte økning i uønskede toksisitet, motiverende videre studier av hvordan kosthold-relevant enzyminduksjon kan påvirke prodrug aktivitet [23]. Disse data, sammen med den etablerte biotilgjengeligheten av SF i den humane kolon, foreslått av oss relevansen av karakteriserende proteom dekkende forandringer i humane tarmkreftceller eksponert for ikke-toksiske doser av SF hjelp stabil isotop merking med aminosyrer i cellekultur ( SILAC) [24], et metabolsk merking tilnærming som tillater kvantifisering av tusener av proteiner med høy presisjon og følsomhet [25].
PR-104A er prodrogen metabolitt av dinitrobenzamide sennep pre-prodrug PR-104 (figur 1) [26-29]. I tidligere studier, enzymet Aldo-keto reduktase (AKR) 1C3 er etablert for å formidle den aerobe aktivering av PR-104A [29, 30]. Dette enzym er et medlem av superfamilien AKR enzymet, som består av ketosteroid reduktase enzymer som regulerer produksjonen av androgener, østrogener, progestiner og [31] og dets ekspresjon blir regulert av Nrf2 /Keap1-reaksjonsveien [29]. PR-104 har vært involvert i en rekke tidlige kliniske studier for kreftbehandling [32-35], men en potensiell gunstig effekt av kjemisk indusert enzymet uttrykk på PR-104A cytotoksisitet har ikke blitt rapportert.
In vivo
, er hydrolysert PR-104 til PR-104A, som er ytterligere redusert til metabolitter som danner cytotoksiske ICLs.
for å bestemme påvirkning av en lav SF konsentrasjon som kan være utnyttes for modulering av legemidlets effekt, analyserte vi proteomet endringer på hele ved SF prekondisjonering i HT29 tykktarmskreftceller ved SILAC [24]. På grunnlag av disse data formuleres vi den hypotese at PR104A aktivitet kan fremmes i kreftceller. Derfor ble det undersøkt virkningen av SF prekondisjonering på PR-104A cytotoksisitet i disse og flere andre etablerte tarmkreftcellelinjer og i forhold til udødelig men normale diploide humane kolon epitelceller (HCEC) som en modell for sunt vev kolon. En rekke data fra cellulært opptak, enzym overflod, aktivitet i forskjellige celletyper og knock-down-analyser tyder på en modell som involverer SF-promo sensibilisering på grunnlag av økt AKR1C3 protein mengde og aktivitet, og cellulære egenskaper som favoriserer positiv interaksjon.
Materialer og metoder
Material
Cell kulturmedium og kosttilskudd var fra Invitrogen (Life Technologies) og kjemikalier fra Sigma Aldrich, hvis ikke annet er spesifisert. Stamløsninger av R-Sulforafane (LKT Laboratories) og PR-104A (Proacta) ble utarbeidet i DMSO, klorambucil i etanol. NADPH var fra Calbiochem. Coumberone ble sjenerøst gitt av professor Dalibor Sames (Columbia University, New York, USA) og SN34037 av professor Bill Wilson og Dr. Adrian Blaser (Auckland Cancer Society Research Centre, University of Auckland, New Zealand). ON-TARGETplus Menneskelig AKR1C3 siRNA (SMARTpool) og ON-TARGETplus ikke-måls basseng siRNA ble hentet fra Dharmacon (Thermo Scientific). Lipofectamine RNAiMAX transfeksjon reagens (Life Technologies) ble brukt for siRNA transfeksjon ifølge produsentens protokoll.
Cells og kultur betingelser
HT29 celler ble hentet fra Leibnitz-Institut DSMZ GmbH i januar 2012. SW620, SW480, HCT116 og GP2d celler, som er beskrevet i [36, 37], ble hentet fra Institute of Molecular Cancer Research (Universitetet i Zürich, Sveits) i oktober 2013 og godkjent av selskapet Microsynth (Balgach, Sveits) ved hjelp av korte tandem gjenta profilering i januar 2015. HT29, SW620 og GP2d-celler ble dyrket i DMEM, SW480 celler ble dyrket i RPMI-1640 medium og HCT116-celler ble dyrket i McCoys medium. Alle media ble supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum og 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. HCEC kloner ble oppnådd i august 2011 (HCEC1CT) og august 2013 (HCEC2CT) og dyrket under tidligere rapportert forhold, men under normoxia [38]. Alle cellelinjer har jevnlig blitt bekreftet å være mycoplasma gratis. For SILAC eksperimenter ble HT29-celler dyrket i lysin og arginin fri DMEM (Silantes) som enten var supplert med 0,219 mM lysin (Lys0) og 1,14 mM arginin (Arg0) for lys medium (L), mens den tunge medium (H) ble supplert med mM [
13C
6
15N
2] 0,219 -lysin (Lys8) og mM 1,14 [
13C
6
15N
4] – arginin (Arg10). For en fullstendig inkorporering av isotopmerkede aminosyrer, ble celler dyrket i totalt 24 cellepopulasjon doblinger (seks passasjer, 4 celle populasjonsdoblinger hver) i SILAC medium før forsøket. 24 timer etter utsåing ble cellene dyrket i SILAC lys medium behandlet med 0,1% (v /v) DMSO og celler dyrket i SILAC tung medium ble behandlet med 2,5 uM SF i 48 timer. Alle celleprøver ble fremstilt in triplo.
Protein Extraction
Cellene ble trypsinert, vasket med PBS, og inkubert ved 4 ° C i 15 minutter med lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCI, 1 mM EDTA, pH 7,4) inneholdende proteaseinhibitorer (Complete mini, Roche Diagnostics). Lysatet ble ultralydbehandlet og sentrifugert, proteinkonsentrasjon bestemt ved BCA-analyse (Thermo Fisher Scientific), og prøvene lagres ved -80 ° C.
SILAC
Protein fordøyelse, massespektrometrisk analyse av prøvene og SILAC bioinformatikk analyse ble utført ved tilpasning av standard tilnærminger (fullstendige opplysninger om metoden etablert for denne studien i S1 bilag).
AKR1C3 aktivitet
AKR1C underlaget coumberone ble brukt som aktivitet probe sammen med en bestemt AKR1C3 inhibitor (SN34037) ved modifikasjon av fremgangsmåten beskrevet i [30]. I 96-brønners plater for hver prøve, ble 40 ug av totalt protein tilsatt til analysebuffer (100 mM KPO 4-buffer [pH 7] inneholdende 250 uM NADPH) med eller uten 1 mM SN34037, og inkubert i 60 min, 37 ° C. Reaksjonen ble initiert med coumberone (30 mM endelig; DMSO 5% [v /v]). Fluorescensemisjonen, på grunn av dannelsen av coumberol, ved 510 nm (385 nm eksitasjon) ble registrert på en uendelig M200 PRO plateavleser (Tecan) ved 37 ° C. AKR1C3 aktivitet ble beregnet som ΔRFU /min over 60 min (full coumberone metabolisme i S1 figur). Målinger som utføres i duplikat med biologiske triplo; statistisk analyse (middelverdier, student t-test) utført ved anvendelse av GraphPad Prism 6.
Western Blot analyse
Cellelysater ble separert på NuPAGE® 4-12% Bis-Tris gel ved 200 V i 45 min i 1X NuPAGE® MES SDS buffer (Life Technologies) og elektro overført til Amersham Hybond-P PVDF membran (GE Healthcare) ved 30 V i 60 min i 1X NuPAGE® overføringsbuffer (Life Technologies). PVDF-membraner ble blokkert med 5% melk og frukt-TBST ved romtemperatur. Membranene ble inkubert med kanin-polyklonalt anti-AKR1C3-antistoff (1: 2’000, Thermo Scientific), etterfulgt av inkubasjon med anti-kanin-IgG-HRP-antistoff (1: 5000, GE Healthcare). Proteinet ble oppdaget ved hjelp av en Pierce® ECL Western blotting substrat (Thermo Scientific). Behandlede membraner ble eksponert for røntgenfilm. Membranen ble strippet, inkubert med anti-actin-antistoff (1: 1’000, Sigma Aldrich) og analysert på nytt. Proteinbåndene ble kvantifisert med ImageJ programvare [39], og ble justert for tilsvar aktin lasting kontroll
Drug Cytotoksisitet
Celler ble sådd i 96-brønners plater (HT29, HCEC, SW480. 1 «500 celler /brønn; SW620: 1’000 celler /brønn; HCT116: 500 celler /brønn; GP2d: 5000 celler /brønn). 24 timer senere ble cellene eksponert for 2,5 uM SF (unntak HCT116: 1 uM) som svarer til en IC
10 eller 0,1% (v /v) DMSO. Etter 48 timer ble mediet fjernet, og økende konsentrasjoner av legemiddel i friskt medium ble tilsatt. 24 timer senere ble mediet erstattet med friskt medium. 72 timer senere celle levedyktighet ble analysert ved hjelp av CellTiter-Glo® Lysende celleviabilitet Assay (Promega) i henhold til produsentens protokoll. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. Alle luminescens verdier ble normalisert i forhold til kjøretøy-behandlede celler. Den dose-responskurver ble tilpasset ved ikke-lineær regresjon en funksjon i GraphPad Prism 6. Statistisk analyse ble utført ved ekstra sum-av-kvadrater F-test for å teste om dose-respons kurver i kontroll og SF-celler forbehandlet statistisk forskjellige fra hverandre.
PR-104A Cytotoksisitet med siAKR1C3
HT29 celler ble sådd i 6-brønners plater (90’000 celler /brønn) og lov til å feste. 24 timer senere ble de utsatt for siAKR1C3 (120 pmol) og 2,5 uM SF eller 0,1% DMSO samtidig. Etter 48 timer ble mediet fjernet og tre konsentrasjoner av PR-104A (0, 25, 100 uM) ble tilsatt i friskt medium. 4 timer etter tilsetning av medikamentet, ble mediet fjernet og en klonogene overlevelses assay ble utført i henhold til standardprotokoller [40]. Etter to ukers inkubasjon ble kolonier farget med Giemsa beis og telles. Som en kontroll, ikke-målsøkende siRNA (120 pmol) ble anvendt. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. Statistiske analyser (uparet t-test med Welch korreksjon) ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism 6.
SF Uptake
Intracellulær SF-konsentrasjonene i HT29 og HCEC1CT celler ble målt ved hjelp av HPLC-koplede cyclocondensation assay ( reaksjon med 1,2-benzenedithiol), som tidligere beskrevet (ytterligere detaljer i S1 bilag) [41].
Resultater
Influence of SF på genuttrykk i HT29 tykktarm kreft celler
SILAC ble anvendt for å undersøke forandringer i mengde nivåer av cellulære proteiner ved behandling med en lav konsentrasjon av SF i HT29 kolon kreftceller. Etter behandling med 2,5 uM SF i 48 timer, svarende til en IC
10 i HT29-celler (S2) Fig; vi identifisert 23 forskjellig rikelig proteiner (fig 2, Tabell 1). En overvekt av proteiner involvert i cellulære metabolske og redoks prosesser ble funnet å være anriket, og enzymer karakterisert tidligere for å mediere aktivering av reduktive prolegemidler, slik som AKR1C3, PTGR1, og NQO1 var blant denne gruppen [22, 29, 42-44] . Den største ganger endring var tydelig for cyclin-D1-bindende protein 1, en negativ regulator av transkripsjonen aktivering involverer E2F transkripsjonsfaktorer [45], mens flere metabolske og redoks regulerende proteiner som reguleres av transkripsjonsfaktor Nrf2, inkludert AKRs og et aldehyd dehydrogenase, økte med 4,6 ganger eller høyere. Den store endringen i mengde til AKR1C3 (7-fold), på forhånd implisert i aktivering av PR-104A, påkalles mulighet for medikament sensibilisering. Derfor fokuserte vi videre innsats i å belyse noen SF-PR104A interaksjoner og bidrag fra AKR1C3 som en molekylær basis. En fullstendig liste over alle kvantifisert proteiner i SILAC eksperiment, inkludert deres normalisert H /L ratio, er gitt i S1 tabell.
2653 proteiner (svart og grå) ble kvantifisert og testet for signifikans. Blant de 23 betydelig regulerte proteiner (svart), 18 var oppregulert og 5 nedregulert i overflod.
For å uavhengig bekrefte økningen i AKR1C3 overflod tydelig i SILAC studien, Vest blot-analyse ble utført og det ble funnet at AKR1C3 overflod ble indusert i HT29-celler i et SF doseavhengig måte (figur 3A). For å bekrefte høyere AKR1C3 aktivitet i HT29-lysatene, ble det benyttet en modifisert versjon av en metode som tidligere er beskrevet for å måle spesifikt AKR1C3 aktivitet i intakte celler, som involverer coumberone som et substrat for alle fire medlemmer av AKR1C familien, og den spesifikke AKR1C3 inhibitoren SN34037 [30 ]. I likhet med proteinnivåer, øket AKR1C3 aktivitet på en doseavhengig måte i HT29-celler (figur 3A).
AKR1C3 aktivitet og proteinnivåer er vist i (a) for HT29-celler og i (e) for HCEC1CT cellene behandlet 48 timer med SF eller DMSO (kontroll). Barer representerer gjennomsnittsverdier og feilfelt er standardfeil. Statistisk analyse ble utført av en uparet t-test med Welch korreksjon. Forsøk ble utført in triplo. (*:
p
0,05; RFU = relative fluorescens enheter). Modulering av celle-levedyktighet er vist for HT29 i (b) og for HCEC1CT i (f) etter at cellene ble inkubert 48 timer med 2,5 uM SF eller 0,1% DMSO (kontroll) og inkubert med økende konsentrasjoner av PR-104A. Viste data er gjennomsnittsverdier ± SD fra fire (HT29) eller tre (HCEC1CT) biologiske replikat. En ekstra sum-av-kvadrater F-test ble utført for å teste om dose-responskurver statistisk forskjellige fra hverandre. De resulterende p-verdier viser at SF i betydelig grad påvirker stoffet respons i HT29 celler, og har ingen signifikant effekt på HCEC1CT celler. (C) klonogene overlevelsesanalysen viser økt overlevelse av HT29 behandlet med siRNA mot AKR1C3 sammenlignet med celler behandlet med ikke-målsøkende siRNA etter PR-104A behandling i 4 timer. Celler ble forbehandlet i 48 timer med 2,5 uM SF sammen med siRNA. Hvert datapunkt representerer tre uavhengige eksperimenter. Feilsøylene viser standardavvik for gjennomsnittet. Statistisk analyse ble utført av en uparet t-test med Welch korreksjon; **:
p
0.01, ***:
p
0,001. (D) Western Blot viser nivåer av AKR1C3 protein i HT29 celler behandlet med enten ikke-måls siRNA eller siAKR1C3 med eller uten samtidig SF behandling (kontroll = 0,1% DMSO).
Effekt av SF-mediert AKR1C3 induksjon på legemiddeltoksisitet i HT29 kolon kreftceller
Vi fant at ved prekondisjonering HT29-celler med 2,5 uM SF i 48 timer, etterfulgt av behandling med økende doser av PR-104A, en signifikant 3,6 gangers reduksjon i EC
50 av medikamentet ble observert (figur 3B, tabell 2;
p
0,0001). Høyere SF-konsentrasjoner ble testet for forkondisjonering, men øker toksisiteten av forbehandlingen selv forhindret den videre anvendelse av disse høyere SF konsentrasjoner. Som en kontroll, ble denne interaksjonen sammenlignet med påvirkning av SF prekondisjonering på cytotoksisiteten av klorambucil (CBL), et anticancer medikament som også danner DNA interstrand kryssbindinger (ICLs), men ikke er avhengig av enzymatisk bioaktivering. Som forventet, cytotoksisitet av CBL var uendret (tabell 2).
For å bekrefte om økt AKR1C3 overflod nivåer på grunn av SF preconditioning av HT29 er ansvarlig for den økte cytotoksisitet av PR-104A, vi utførte RNA interferens ved hjelp av en pool av fire siRNAs mot
AKR1C3
. En klonogene assay ble anvendt for å bestemme cytotoksisiteten til PR-104A i HT29-celler etter samtidig prekondisjonering med SF og siRNA mot
AKR1C3 plakater (figur 3C og 3D, S2 tabell). Som kontroll ble det ikke-målsøkende siRNA anvendt. Videre ble varierende inkubasjonstider og siRNA konsentrasjoner testet for å sikre at SF-indusert AKR1C3 uttrykk ble undertrykt av siRNA mot
AKR1C3
under de forholdene som er beskrevet, og etter 48 timer samtidig prekondisjonering med SF og siRNA mot
AKR1C3
, proteinnivåer var lik nivåene i ubehandlede HT29-celler (data ikke vist). Når SF-indusert AKR1C3 overekspresjon ble nedregulert via RNA-interferens, ble cytotoksisiteten til PR-104A redusert, noe som indikerer at SF prekondisjonering senket PR-104A konsentrasjon som er nødvendig for å oppnå en tilsvarende cytotoksisitet ved å indusere AKR1C3 overflod nivåer. Disse data støtter tidligere etablert koblingen mellom AKR1C3 overflod og PR-104A effekt [29, 30], og dessuten bekrefter samme effekt under forhold med kjemisk induksjon, dvs. med SF.
Effekt av SF preconditioning på legemiddeltoksisitet i HCEC ikke-kreft kolon celler
Fremme narkotika cytotoksisitet i kreftvev kan være en fordel hvis den samme samhandlingen er fraværende eller redusert hos friske kolleger. Derfor ble en kombinasjon av SF, og PR-104A undersøkt i en immortalisert human colonic epithelial cellelinje (HCEC) som en modell for ikke-kreft vev [38]. HCECs (HCEC1CT og HCEC2CT, fra to forskjellige individer) er ikke-tumorigene diploide celler som uttrykker epitelial samt stamcellemarkører og ble etablert fra normal colonic slimhinnene. De bærer ikke mutasjoner i hot spot gener som
APC
,
KRAS
, eller
TP53 product: [38]. AKR1C3 overflod nivåer målt ved Western Blot ble litt indusert ved SF behandling i HCEC1CT celler (figur 3E), men i en lavere grad enn for de HT29-celler (figur 3A). Det var verken betydelig økning i AKR1C3 aktivitet (figur 3E) eller resistens (HCEC1CT: Fig 3F, tabell 2;
p
= 0,2; HCEC2CT: Tabell 2;
p
= 0,8).
SF opptak i HT29 og HCEC1CT celler
for å undersøke om annet svar i HT29 vs. HCEC1CT celler kan være relatert til mobilnettet SF opptak, analyserte vi SF opptak i HT29 og HCEC1CT av en cyclocondensation analyse. Denne analysen har fordelen av å tillate mengdebestemmelse av fri SF samt SF bundet til cellulære tioler såsom glutation [41]. Det var ingen signifikante forskjeller i SF opptak (S3 figur), noe som tyder utelukkelse av økt opptak som grunnlag for SF-PR104A samhandling i HT29 men ikke HCEC celler.
Effekt av SF preconditioning på legemiddeltoksisitet i ekstra tykktarm kreft cellelinjer
for å utforske generalitet og grunnlaget for SF preconditioning effekter, ble cytotoksisitetstester eksperimenter utført med flere tykktarmskreft cellelinjer med ulike genetiske bakgrunn (tabell 2). I likhet med HT29, i SW620 EF
50 av PR-104A ble betydelig redusert 3,6 ganger ved SF prekondisjonering (
p
0,0001). Som i HT29-celler, ble AKR1C3 overflod i SW620-celler indusert rundt tre ganger og aktiviteten økte 1,7-ganger (figur 4, S3 tabell). I motsetning til dette, for HCT116, SW480, og GP2d celler, PR-104A cytotoksisitet ble ikke endret. Denne observasjonen virker i overensstemmelse med det faktum at ingen AKR1C3 protein ble påvist i HCT116 og SW480 cellelysater, og heller ikke SF prekondisjonering indusere protein overflod eller aktivitet (figur 4, S3 tabell). I GP2d celler, ble AKR1C3 knapt uttrykt; Men overflod og aktiviteten til dette enzymet økte ikke tilstrekkelig med SF å endre PR-104A cytotoksisitet (figur 4, S3 tabell). En klar trend ble observert mot lavere PR-104A EC
50 verdier for celler med høyere AKR1C3 aktivitet (figur 4C, R
2 = 0,7063;
p
0,01). Disse resultater indikerer at en kombinasjon av AKR1C3 basalnivåer og aktivitet, såvel som følsomhet overfor induksjon av SF, påvirker tilbøyelighet av celler for å understøtte den PR-104A-styrke potensialet av SF. Derfor genetisk variasjon på tvers av primær sunt og tumorvev, så vel som forskjellige kreftformer, kan ventes å bidra til individuelle responser.
(a) AKR1C3 aktivitet med (grå) og uten (sort) SF prekondisjonering for kolon cellelinjene anvendt i denne studien. Statistisk analyse ble utført av uparet t-test med Welch korreksjon; *:
p
0,05. (B) Western Blot for AKR1C3 protein med og uten SF prekondisjonering (2,5 uM i 48 timer). (C) Sammenheng mellom AKR1C3 aktivitet og PR-104A cytotoksisitet (
p
0,01). Grafen inneholder data fra HCEC1CT, HCEC2CT, HT29, SW620, og GP2d celler med (åpne symboler) og uten (lukkede symboler) SF prekondisjonering. Cellelinjer som ikke AKR1C3 protein (HCT116, SW480) har blitt fjernet. *: Signifikant endring i EC
50 ved SF prekondisjonering ifølge ekstra sum-av-kvadrater F-test for å teste om dose-respons kurver i kontroll og SF forbehandlet celle statistisk forskjellige fra hverandre
diskusjon
til tross for tilgjengeligheten av data om virkningen av SF på genekspresjon, det var bare begrenset informasjon om protein overflod endring i menneskelige kolon celler, spesielt for SF konsentrasjoner for lave til å vesentlig endre celle levedyktighet. I proteomikk skjermen gjennomført her, 23 proteiner var forskjellig rikelig, 18 økes i overflod ved behandling med 2,5 mikrometer SF. Flere av disse proteinene, inkludert forskjellige AKRs, ble funnet tidligere for å bli indusert av høyere doser av SF (5 og 15 uM) i brystcellelinjer etablert fra brystkjertlene med fibrocystisk sykdom og human colon adenokarsinom Caco-2-celler også ved hjelp av proteomic tilnærminger [14, 16]. Imidlertid, i den foreliggende undersøkelse, ble den cellulære responsen analysert ved en demonstrerte ikke-toksisk og eventuelt fysiologisk relevant konsentrasjon av SF eksponering i humant vev (2,5 uM) [46]. Ved høye doser, har SF cytostatisk og cytotoksisk aktivitet på dyrkede celler [47-50]. En moderat endring i AKR1C3 overflod (7,3 ganger) og generelt begrenset liste over opp-regulert enzymer som detekteres i vårt studium kan være relatert til celletype eller den lave SF-konsentrasjonen, som støtter en økning i en høy andel av reduktaseenzymer selv ved lav konsentrasjon .
på grunnlag av resultatene SILAC, vi utforsket muligheten for SF prekondisjonering av HT29-celler for å endre cytotoksisiteten til bioreductive prodrug PR-104A, og syntes det å være en positiv interaksjon direkte relatert til modulering av AKR1C3. Western blot analyse, spesifikke enzymaktivitetsmålinger, og siRNA knock-down eksperimenter alt bekreftet at forbedret følsomhet for PR-104A var knyttet til en økning i AKR1C3 overflod nivåer og aktivitet. I motsetning til dette, dette sensibilisering var ikke påvisbar i immortaliserte HCEC1CT celler, i samsvar med mangel på enzymaktivitet indusert påvist i disse cellene (figur 4A). På grunnlag av western blot-data, det syntes å være en relativ økning i protein overflod (figur 4B). Men absolutt protein nivåer holdt så lav i både pre-condition og ubehandlede celler som ingen effektiv allergi ble observert. Resultatet for HCEC1CT cellelinjen var av interesse på grunn av sin ikke-kreft-vev sted molekylære egenskaper som tyder på det som en modell for friske tykktarm epitelceller [38].
det mulig selektiv forbedring av PR-104A i tumorceller motiverte oss til å undersøke fem ekstra cellelinjer, nemlig HCEC2CT (ikke-kreft), og tykktarmskreft cellelinjer SW480, SW620, HCT116 og GP2d å bedre forstå hvordan molekylære faktorer påvirker kombinasjonen respons. I likhet med HT29 ble SW620 celler sensitivisert mot behandling med PR-104A ved SF-forbehandling. Videre AKR1C3 protein overflod og aktivitet ble også indusert i disse cellene. I motsetning til dette ble protein overflod og aktivitet påvirkes ikke av SF-forbehandling i ikke-kreftceller HCEC2CT derfor disse cellene ikke var sensibilisert overfor medikamentet. I cellelinjer som hadde svært lav eller ingen AKR1C3 mRNA nivåer [51] og uttrykte ikke proteinet (SW480, HCT116), AKR1C3 overflod var heller ikke induserbar med SF prekondisjonering. Det var derfor ingen innvirkning på PR-104A cytotoksisitet. GP2d cellene hadde lav
AKR1C3
mRNA nivåer [51], men protein overflod og enzymaktiviteten kan økes ved SF preconditioning, men med et nivå av induksjon tilsynelatende utilstrekkelig til å påvirke cytotoksisitet av PR-104A. Dermed AKR1C3 aktivitet syntes å være mer diagnostisk av PR-104A cytotoksisitet (fig 4C) enn små protein overflod endringer som kan oppdages av western blot, men var ikke nok til å ha en reell effekt. Denne observasjonen gir ekstra støtte i forbindelse med tykktarmskreftceller til forslaget om at AKR1C3 aktivitet kan brukes som en prediktiv markør for PR-104A mottakelighet som legger frem tidligere på grunnlag av data fra pasient avledet xenograft og leukemiceller. Til slutt, antyder det en verdi for fortsatt utvikling av strategier for å overvåke AKR1C3 aktivitet, herunder aktivitetsbaserte protein profilering [30, 52, 53].
Det har vært spekulert i at flere faktorer, som for eksempel DNA-reparasjon, kan konto for inkonsistente resultatene observert tidligere om forholdet mellom PR-104A mottakelighet og AKR1C3 aktivitet i cellelinjer, men våre data tyder på en svak rolle hvis noen for reparasjon forskjeller å være betydelig i tykktarm kreft celler vurderer til resultater oppnådd med CBL (tabell 2). PR-104A former ICLs, foreslått å være lik de som er beskrevet for CBL og MMC [26-28, 54]. Når vi testet CBL som en modell tverrbindingsmiddel og analysert cytotoksisitet på de samme cellelinjer som PR-104A, var det ingen betydelig påvirkning av SF prekondisjonering av cellelevedyktighet (tabell 2). Imidlertid, under aerobe forhold, som anvendt her, PR-104A ICLs antas å være bare dannes hvis AKR1C3 uttrykkes, også andre virkningsmåter i cellelinjer som mangler enzymet er blitt foreslått, for eksempel monoalkylering av DNA ved hjelp av PR-104A selv eller dets oksyderte halv sennep [27, 28, 54]. Strukturene for slike DNA-addukter har ikke blitt grundig preget, og heller ikke deres tilsvarende modus for reparasjon kjent, derfor viktigheten av disse banene i å påvirke cytotoksisitet i celler med lav basal eller indusert AKR1C3 nivåer garanterer videre studier.
Muligheten for å øke cytotoksisiteten av bioreductive anticancerlegemiddelforløpere med diett fytokjemikalier har blitt vist i en håndfull av tidligere studier av humane cellelinjer [21, 22, 43, 55]. Fire cellelinjer, av tykktarm, lunge eller bryst opprinnelse, ble sensibilisert mot bioreductive stoffet MMC ved induksjon av NQO1 [22]. Yu
et al
. brukt curcumin og resveratrol å indusere legemiddel metabolizing enzym PTGR1 og derfor bevisst lever HepG2 og tykktarm SW620 celler mot bioreductive stoffet hydroksymetylacylfulven [43].
