Abstract
Vγ9Vδ2 celler er cytotoksiske T-celler som er i stand til å gjenkjenne epitel ovarialcancer (EOC) celler. Derfor er Vγ9Vδ2 cellebasert adoptiv overføring en attraktiv terapi for EOC. Men den ineffektive
ex vivo
utvidelse etter spesifikk stimulering av Vγ9Vδ2 celler fra noen pasienter og forholdet mellom Vγ9Vδ2 celler og kliniske forløpet av EOC er problemer som gjenstår å bli avklart. Heri ble perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra 60 EOC pasienter stimulert med bromhydrin pyrofosfat (BrHPP) eller zoledronate, som er spesifikke agonister for Vγ9Vδ2 celler. Forbindelsene avvek i sine efficacies å indusere
ex vivo
Vγ9Vδ2 PBMC ekspansjon, men 16/60 prøvene forble ineffektivt utvidet med begge stimuli. Interessant, Vγ9Vδ2 cellene i disse lav-respons PBMC vist før ekspansjon (
ex vivo
PBMC) en endret fremstilling av de pro-inflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a, et redusert naiv fraksjon og et redusert frekvens . Ingen bevis for en involvering av CD4
+ CD25
+ foxp3
+ regulatoriske celler ble observert. Viktigere, våre data viser også at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre i EOC PBMC kunne bli brukt til å forutsi lave responser på både BrHPP og zoledronate. Videre våre data høydepunkt at en slik mangel ikke er korrelert med avanserte EOC stadier, men er assosiert med flere ildfaste stater til platina-basert kjemoterapi og er en uavhengig prediktor for kortere sykdomsfri overlevelse etter behandling. Disse resultatene er de første til å foreslå et potensielt bidrag fra Vγ9Vδ2 celler til anti-tumor effekter av kjemoterapeutika og de styrke interessen for strategier som kan øke Vγ9Vδ2 celler i kreftpasienter
Citation. Thedrez A, Lavoué V , Dessarthe B, Daniel P, Henno S, Jaffre jeg, et al. (2013) en kvantitativ mangel i perifert blod Vγ9Vδ2 Cells er en negativ prognostisk Biomarker i eggstokkreft pasienter. PLoS ONE 8 (5): e63322. doi: 10,1371 /journal.pone.0063322
Redaktør: Eric Vivier, INSERM- CNRS- Univ. Méditerranée, Frankrike
mottatt: 02.01.2013; Godkjent: 02.04.2013; Publisert: May 23, 2013
Copyright: © 2013 Thedrez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institut National du Cancer (INCA) PL2008-034, Cancéropôle Grand-Ouest og økonomisk støtte fra Medicine fakultet for Rennes University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Menneske Vγ9Vδ2 celler er en dominerende undergruppe av perifert blod γδ T-celler som uttrykker en unik TCR med Vγ9-Vδ2 regioner. Disse celler, som vanligvis utgjør 0,5-10% av den perifere lymfoide bassenget, reagere mot forskjellige tumorceller gjennom anerkjennelse av fosforylerte isoprenoid-derivater definert som phosphoantigens [1], [2]. Vγ9Vδ2 celler kan direkte drepe sine mål og slipper proinflammatoriske cytokiner som øker anti-tumor effektorceller av det adaptive immunsystemet [3]. På grunn av disse egenskaper, kan den selektive utløsning av disse cellene være av stor interesse i cancer immunoterapi [4]. Flere for tiden tilgjengelige kliniske klasse forbindelser som er i stand til sterkt å aktivere Vγ9Vδ2 celler og med IL-2, kan indusere den selektive utvekst av disse cellene
in vitro
og
in vivo
. Disse forbindelser er enten syntetiske phosphoantigens, såsom bromhydrin pyrofosfat (BrHPP, Phosphostim ™), eller farmakologiske inhibitorer av mevalonat reaksjonsveien, slik som aminobisphosphonates (dvs. zoledronate, Zometa ™). Slike forbindelser har nylig blitt vurdert i passive eller aktive immunterapeutiske studier hos pasienter med hematologiske maligniteter eller solide tumorer [5] – [14]. Disse behandlingene er vanligvis godt tolerert og har fremkalt oppmuntrende objektive responser hos noen pasienter [12], [15], [16].
ovarialcancer (EOC) er den femte hyppigste kreftform hos kvinner og forårsaker flere dødsfall enn noen annen gynekologisk kreft. De fleste EOC pasienter blir diagnostisert på et avansert stadium. For tiden er alle pasienter gjennomgår kirurgiske prosedyrer, og 90% av pasientene får også en platina-basert kjemoterapi. Imidlertid gjenstår det fem-års overlevelse under 40%. Derfor har økt kunnskap om hvilken rolle immunosurveillance i EOC ført til utforskningen av innovative terapeutiske strategier som retter seg mot immunsystemet [17]. Nylig demonstrerte vår gruppe som
in vitro
phosphoantigen-ekspanderte Vγ9Vδ2 celler fra EOC pasienter vise høy cytolytisk aktivitet overfor friske ovarie autologe tumorceller, og dermed gi en rasjonell for Vγ9Vδ2 cellebasert adoptiv overføring i EOC pasienter [18] . Men forholdet mellom Vγ9Vδ2 celler og progresjon eller kliniske utfall av EOC forbli uutforsket. I tillegg har noen bekymringer eksisterer om effekten av Vγ9Vδ2 celle utvidelser med konvensjonelle protokoller som er basert på
ex vivo
stimulering av perifere mononukleære blodceller (PBMC) med en enkelt dose av enten BrHPP eller zoledronate og dyrkningsforhold som krever IL-2. Disse protokollene er egnet for celler fra friske donorer [19], [20]. Men de klarte ikke å effektivt utvide Vγ9Vδ2 celler fra noen EOC pasienter [18], lik observasjoner i andre kreftformer [12], [14], [20] – [22]. Det gjenstår å se om disse feil i noen EOC pasienter er knyttet til iboende forskjeller i Vγ9Vδ2 celler eller skyldes forskjeller i andre miljøparametre. En forståelse av slike forskjeller vil bidra til å optimalisere fremtidige kliniske studier med Vγ9Vδ2 cellebaserte adoptiv overføring terapier i EOC
I denne studien undersøkte vi følgende i en kohort av 60 EOC pasienter. Parametrene assosiert med ineffektiv BrHPP- og zoledronate-indusert Vγ9Vδ2 celle utvidelser og muligheten for en sammenheng mellom tilstedeværelsen av Vγ9Vδ2 celler og det kliniske forløpet av EOC. Vi rapporterer at PBMC som ble ineffektivt utvidet med BrHPP og med zoledronate har før ekspansjon (
ex vivo
PBMC) reduserte frekvenser av Vγ9Vδ2 celler og at disse cellene vise endringer i sin fenotype og funksjonalitet. I tillegg, viser vi at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre i
ex vivo
EOC PBMC forut lave responser på både BrHPP- og zoledronate baserte stimuleringsregimer, og at et slikt celledelt mangel er relatert til den kliniske progresjon og tilbakefall av EOC etter kjemoterapi basert behandling.
Resultater
utvidelser av Vγ9Vδ2 PBMC i Response til BrHPP og Zoledronate er lavere i EOC Pasienter enn hos friske donorer
Først sammenlignet vi utvidelser av PBMC fra 60 EOC pasienter (EOC PBMC) og fra 13 friske kvinnelige donorer etter en bestemt Vγ9Vδ2 celle stimulering med en enkelt dose av enten BrHPP eller zoledronate (Zol), som var relevant for kliniske studier protokoller, og en kultur i to uker i nærvær av IL-2 (fig. 1). Median frekvens av Vγ9Vδ2 celler i utvidede PBMC (Fig. 1a) og median antall utvidet Vγ9Vδ2 celler (Fig. 1B) var signifikant lavere i EOC pasienter enn hos donorer på 14 dager etter stimulering med enten BrHPP eller Zol. Disse data bekrefter at svarene Vγ9Vδ2 PBMC til begge stimuleringsregimer er betydelig redusert i EOC pasienter.
Vδ2
+ CD3
+ cellefrekvenser blant utvidede celler (A) og Vδ2
+ CD3
+ celle tall generert fra 1 × 10
6 PBMC (B) ble målt ved 14 dager etter BrHPP (▴) eller zoledronate (Zol) (▪) stimulering. Resultatene fra n = 60 pasient PBMC og n = 13 donor PBMC vises.
BrHPP og Zoledronate ulik Kapasiteter å utvide Vγ9Vδ2 PBMC fra EOC Pasienter
Tatt i betraktning vår resultatene fra EOC pasientens PBMC utvidelser (Fig. 1) og den minimale hastighet av renhet som tidligere er definert for en Vγ9Vδ2 cellebasert terapi produkt [6], [23], valgte vi den ekspanderte Vγ9Vδ2 celletall på 2 x 10
6 celler (generert fra 1 × 10
6 PBMC) (se tabell 1 legende for detaljer) og Vγ9Vδ2 celle frekvens på 70% blant de utvidede celler som cut-off-verdier for å skille effektive utvidelser (≥2 × 10
6 celler og ≥70%) fra ineffektive utvidelser (mindre enn 2 × 10
6 celler eller 70%). Fire statistisk distinkte grupper av prøver ble således identifisert i våre eksperimentelle betingelser (tabell 1): respons PBMC (R) som er effektivt utvidet med begge stimuli (53%); de BrHPP-lav-svarer PBMC (Br-LR) som ble bare effektivt utvidet med Zol (13%); de Zol-lav-svarer PBMC (Zol-LR) som ble bare effektivt utvidet med BrHPP (7%); og de lavt svarer PBMC (LR) som var ineffektivt utvidet uansett stimulus påført (27%). Disse data indikerer de forskjellige evnene til konvensjonell BrHPP- og zoledronate-baserte protokoller for å effektivt utvide Vγ9Vδ2 PBMC fra EOC pasienter.
Kapasiteten Vγ9Vδ2 celler til å spre og å produsere de proinflammatoriske cytokiner IFN γ og TNF-α er redusert i LR EOC PBMC
for å undersøke parametere forbundet med lav respons status for Vγ9Vδ2 PBMC både BrHPP- og zoledronate baserte stimuleringsregimer, komparative analyser ble begrenset til LR og R-grupper.
Vi først sammenlignet gangers økninger av Vγ9Vδ2 PBMC 14 dager etter BrHPP eller Zol stimulering (fig. 2A og 2B). Den dobbelte økninger var betydelig lavere i LR PBMC enn i de R PBMC etter behandling med enten agonist (Fig. 2A). Median BrHPP-indusert Vγ9Vδ2 cell dobling var 812 [352-2333] for R-gruppen og bare 132 [74-609] for LR gruppen (Fig. 2A). En lignende trend ble observert i Zol-behandlede celler, med median fold økning på 712 [339-1854] for R-gruppen og 403 [140-872] for LR gruppen (Fig. 2B). Produksjonen av proinflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-alfa byVγ9Vδ2 celler i LR og R EOC PBMC før ekspansjon (
ex vivo
PBMC) ble også adressert med intracellulær farging. Eksperimenter ble utført ved å stimulere
ex vivo
PBMC med BrHPP eller PMA /Ionomycin. På grunn av noen PBMC mengder i prøver fra pasienter, zoledronate ble hoppet fra følgende aktiveringsanalyser. Produksjoner av TNF-α og IFN-γ ble funnet å være vesentlig redusert i LR PBMC sammenlignet med R PBMC (Fig. 2C og 2D). Viktigere, doser av BrHPP som ble mette for R PBMC ikke klarte å gjenopprette IFN-y og TNF-alfa responser i LR PBMC (Fig. S1). Alle sammen, disse resultatene viser en endret funksjonell profil Vγ9Vδ2 celler i LR EOC PBMC.
A, B) Vδ2
+ CD3
+ celle fold økning i LR (n = 16) og R (n = 32) EOC PBMC på 14 dager etter BrHPP (A) eller Zol (B) stimulering. C) Prosentandeler av IFN-γ
+ celler i Vδ2
+ CD3
+ celler målt 5 timer etter stimuleringen av
ex vivo
LR (n = 10) og R ( n = 10) PBMC med BrHPP (3 mm) eller PMA /ionomycin (PMA /iono). D) Prosenter av IFN-γ
+ celler (
venstre panel
) og TNF-α
+ celler (
høyre panel
) mellom Vδ2
+ CD3
+ -celler målt 5 timer etter stimuleringer av
ex vivo
LR (n = 4) og R (n = 4) PBMC med økende doser av BrHPP (0,1 til 6 um). E) Uttrykk for den CD3ζ kjeden målt på Vγ9Vδ2 PBMC fra LR og R-gruppene. Prosent (
øvre panel
) og MFI (
nedre panel
) av CD3ζ flekker i Vδ2
+ CD3
+ celler fra LR EOC PBMC (n = 5), R EOC PBMC (n = 3) og R-donor PBMC (n = 3). F) CRTAM ekspresjon på Vγ9Vδ2 celler målt ved 20 timer etter stimulering av LR (n = 8) og R (n = 8) EOC PBMC med BrHPP. Ingen Stim. Ingen stimulering
Den reduserte spredning og cytokin produksjon av Vγ9Vδ2 celler kan skyldes ulike faktorer, inkludert redusert uttrykk av T-celle reseptor CD3ζ kjeder, endrede proporsjoner naiv og minne undergrupper eller en ugunstige forhold på regulatoriske T-celler til Vγ9Vδ2 celler. Disse mulighetene ble senere undersøkt.
The Expression Nivå CD3ζ Chains er likhet mellom
ex vivo
LR og R EOC PBMC
Aktivering signaltransduksjon av T-lymfocytter passerer gjennom de cytoplasmatiske haler av T-cellereseptoren CD3ζ kjeder. En feil i uttrykket av disse komponentene på
ex viv
o Vγ9Vδ2 celler fra LR PBMC ble utforsket. Men ingen signifikante forskjeller ble påvist i prosenter og nivåer (MFI) av CD3ζ kjeden uttrykk mellom
ex vivo
LR og R Vγ9Vδ2 PBMC (Fig. 2E). Vi sammenlignet også evnene til Vγ9Vδ2 celler i LR og R EOC PBMC å uttrykke klasse I-begrenset T-celle-forbundet molekyl (CRTAM) [24], som nylig ble identifisert av vår gruppe som en fenotypisk markør som er sterkt knyttet til aktivering av Vγ9Vδ2 PBMC [25]. Interessant, etter BrHPP stimulering, ble CRTAM funnet å bli uttrykt på lignende måte (i prosent og MFI) på Vγ9Vδ2 celler fra både LR og R PBMC (fig. 2F og data ikke vist).
Den Naive Vγ9Vδ2 cellefraksjon blir redusert i
ex vivo
LR EOC PBMC
de naive og minne undergrupper av Vγ9Vδ2 celler ble analysert i
ex vivo
LR og R EOC PBMC henhold til uttrykk av CD27 og CD45 -RA markører (fig. 3). Median naive celle frekvens blant Vγ9Vδ2 PBMC var signifikant lavere i LR-gruppen (37%) enn i R-gruppen (53%, Fig. 3). Følgelig median minnecellen frekvens var høyere i den gruppe LR. Signifikant positiv korrelasjon ble funnet mellom de naive cellefrekvenser blant Vγ9Vδ2 PBMC og fold økning på Vγ9Vδ2 celler etter BrHPP stimulering (p = 0,041 henhold til Spearman korrelasjon test). En slik sammenheng ble ikke funnet i eksperimenter utført med Zol. Innenfor hukommelses noen statistisk påvist signifikante forskjeller mellom LR og R-gruppene i frekvensene i Sentral-, effektor eller terminalt differensiert effektor undergrupper blant Vγ9Vδ2 PBMC (Fig. 3). Dermed ble det ikke minne Vγ9Vδ2 undergrupper beriket fortrinnsvis i
ex vivo
LR EOC PBMC.
Prosent naiv (CD27
+ CD45RA
+), sentral minne (CM) (CD27
+ CD45RA
-), effektor minne (EM) (CD27
-CD45RA
-) og terminalt differensiert effektor minne (TEMRA) (CD27
-CD45RA
+) celler blant Vδ2
+ CD3
+ celler i
ex vivo
LR (n = 13) og R (n = 11) EOC PBMC.
en ubalanse mellom CD4
+ CD25
highFoxP3
høye Regulatoriske T-celler og Vγ9Vδ2 Cells Finnes i
ex vivo
LR EOC PBMC, men er imidlertid ikke i den Svekket Utvidelse av Vγ9Vδ2 Cells
Frekvensen av CD4
+ CD25
highFoxP3
høye regulatoriske T-celler (tregs) og prosenter av tregs til Vγ9Vδ2 celler (treg: Vγ9Vδ2 ratio) ble undersøkt i
ex vivo
LR og R EOC PBMC. De Treg celle frekvensene ble ikke funnet å være signifikant forskjellig mellom LR og R EOC PBMC (fig. 4A). Men betydelig nedgang i Vγ9Vδ2 cellefrekvenser i LR EOC PBMC ført til treg: Vγ9Vδ2 forholdstall som var betydelig høyere i LR-gruppen enn i R-gruppen (fig 4B.). Viktigere var det ikke noen invers korrelasjon observert mellom disse forholdene og de brette øker med Vγ9Vδ2 celler som ble målt etter stimulering med enten BrHPP eller Zol (i henhold til Spearmans korrelasjonskoeffisient analyser, p = 0,07 og p = 0,67, henholdsvis). I tillegg gjorde uttømming av Tregs i LR EOC PBMC med anti-CD25 mikroperler ikke bedre ekspansjons kapasiteter på Vγ9Vδ2 celler etter stimulering med BrHPP eller Zol (fig. 4C). Faktisk var ingen signifikante forskjeller observert i de frekvenser, tall eller fold økning av Vγ9Vδ2 celler fra CD25-utarmet LR PBMC sammenlignet med ikke-utarmet LR PBMC etter stimulering med enten BrHPP eller Zol (fig. 4C og data ikke vist). Av notatet, ingen sterk nedbryting av Vγ9Vδ2 celler og endrede celle viabilities var tydelig etter CD25-mangel (data ikke vist). Til sammen disse observasjonene tyder på at den økte andelen av tregs forhold til Vγ9Vδ2 celler i LR EOC PBMC ikke er involvert i svekket respons på Vγ9Vδ2 celler.
A) CD4
+ CD25
highFoxP3
høy celle (treg) frekvenser og tilsvarende Vδ2
+ CD3
+ cellefrekvenser i
ex vivo
LR (n = 13) og R (n = 11) PBMC. B) Forholdet mellom Tregs (%) til Vδ2
+ CD3
+ celler (%) (treg: Vδ2
+ ratio) blant PBMC i LR og R-gruppene. C) LR PBMC fra EOC pasienter (n = 6) ble stimulert med BrHPP (▴) eller Zol (▪) og IL-2 før og etter tømming av CD25
+ celler; spredning av Vδ2
+ CD3
+ celler ble analysert på dag 7. Vδ2
+ CD3
+ cellefrekvenser blant utvidede celler (
venstre panel
) og Vδ2
+ CD3
+ celle fold øker (
høyre panel
) er vist.
En redusert frekvens av Vγ9Vδ2 Celler i
ex vivo
EOC PBMC ≤0.35 % Spår en ineffektiv Response to Både BrHPP og Zoledronate
en analyse av
ex vivo
Vγ9Vδ2 cellefrekvenser ble deretter utført i de fire gruppene som tidligere er beskrevet i tabell 1. frekvensen av Vγ9Vδ2 celler var betydelig redusert i LR gruppen sammenlignet med alle andre grupper (fig. 5A). Medianverdiene for Vγ9Vδ2 celle frekvenser i PBMC var 0,28% for LR gruppen og 1,38% for R-gruppen (fig. 5A). Mellomliggende verdier ble observert for Br-LR og Zol-LR-grupper, med median frekvenser på 0,48% og 0,64%, henholdsvis. Interessant, ble det ikke observert signifikante forskjeller mellom LR, Br-LR, Zol-LR og R EOC grupper i frekvensene av ikke-Vδ2
+ γδ T-celler (fig. 5B) eller CD3
+ celler i PBMC (fig. 5C). Dessuten vurderer hele kohorten ble en signifikant positiv korrelasjon funnet mellom
ex vivo
Vγ9Vδ2 cellefrekvenser og fold øker etter stimulering med BrHPP men ikke med Zol (p = 0,015 henhold til Spearmans korrelasjonstester). I tillegg positive korrelasjoner mellom
ex vivo
Vγ9Vδ2 cellefrekvenser og IFN-y-produksjoner i respons til enten BrHPP eller PMA /ionomycin (. Målt i figur 2C) ble dokumentert (p = 0,015 og p henholdsvis 0,001,). Disse data indikerer en spesifikk reduksjon i frekvensen av det Vγ9Vδ2 delsett som er sterkt assosiert med funksjonelle uregelmessigheter i LR EOC PBMC.
Frekvensene Vδ2
+ CD3
+ -celler (A), Vδ2
-γδ
+ CD3
+ celler (B) og CD3
+ celler (C) mellom LR (n = 16), Br-LR (n = 8), Zol-LR (n = 4) og R (n = 32) EOC PBMC-er vist. Forskjeller mellom LR gruppe og hver av andre grupper er indikert. A) En mottager-operatoren karakteristikk (ROC) analyse ble utført hvori LR PBMC-prøver ble sammenlignet med de andre PBMC-prøver. Stiplede linjene indikerer cut-offs på 0,35% og 0,8%. Sp: Spesifisitet. Se:. Følsomhet
For å avgjøre om en bestemt Vγ9Vδ2 celle frekvensverdi kan brukes til å forutsi ineffektive tiltak mot både BrHPP og Zol, en mottaker-operatør karakteristisk (ROC) analyse ble utført. En Vγ9Vδ2 celle frekvens blant PBMC av 0,35% eller mindre var alltid forbundet med lav respons på både BrHPP og Zol (100% spesifisitet). For frekvenser av 0,8% eller mer, alle utvidelser var effektiv med minst én stimuli. For frekvenser mellom 0,35% og 0,8%, ble ineffektive svar på både stimuli og effektive reaksjoner observert. Disse resultatene viser at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre mellom
ex vivo
PBMC er prediktiv av ineffektive tiltak mot både BrHPP og Zol.
En Vγ9Vδ2 Cell Frekvens på 0,35% eller mindre i
ex vivo
EOC PBMC er en negativ prognostisk markør i EOC pasienter
for å undersøke forholdet mellom Vγ9Vδ2 celler og EOC sykdom, ble kliniske data fra pasienter som ble analysert i forhold til Vγ9Vδ2 cellefrekvenser i
ex vivo
PBMC (tabell 2 og fig. 5). Blant alle de parametrene som ble registrert på tidspunktet for blodprøvetaking, ble en forening etablert bare med pasientens alder (tabell 2). Median pasientens alder var signifikant høyere i gruppen som hadde Vγ9Vδ2 cellefrekvenser i PBMC av 0,35% eller mindre (group≤0.35%) enn i gruppen med frekvenser høyere enn 0,35% (gruppe 0,35%). Viktigere, ble ingen reduksjon i blodkonsentrasjonen av leukocytter og PBMC observert i group≤0.35%, noe som bekrefter den spesifikke kvantitative mangel av Vγ9Vδ2 celler i perifert blod. Ingen foreningen ble etablert mellom denne mangelen og administrasjon av kjemoterapi før blodprøvetaking. Videre ble ingen sammenheng funnet mellom mangel i perifert blod Vγ9Vδ2 celler og et avansert stadium av sykdommen eller høyere svulst grad. Med hensyn til behandlingen av EOC pasienter (tabell 2) ble det ikke observert noen signifikante forskjeller mellom de group≤0.35% og gruppen 0,35% i effektiviteten av debulking kirurgi, eller i form av kjemoterapi (tabell 2). Imidlertid ble de kliniske resultatene av kjemoterapi-behandlede EOC pasienter funnet å være tydelig mellom gruppene. Interessant, var andelen pasienter som var resistente mot kjemoterapi var signifikant høyere i group≤0.35% (62,5%) enn i gruppen 0,35% (17,5%) (tabell 2). I tillegg univariatanalyser av sykdomsfri overlevelse med andre relevante faktorer viste at en Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre i PBMC og en ikke-optimal debulking er prediktorene for kortere sykdomsfri overlevelse varighet (Tabell 3). Med en gjennomsnittlig oppfølging varighet på 13 måneder for disse pasientene var median varighet av sykdomsfri overlevelse var en måned i group≤0.35% versus 10 måneder i gruppen 0,35% (Fig. 5). Viktigere, ble den negative prognostiske verdien av redusert Vγ9Vδ2 celle frekvens opprettholdes etter en justering i en multivariat analyse (tabell 3).
Diskusjoner
Tidligere studier har vist at konvensjonell
ex vivo
Vγ9Vδ2 celle ekspansjonsprotokoller basert på stimulering av PBMC med BrHPP eller Zol mislyktes i et gjennomsnitt på 35% av kreftpasienter [12], [20] – [22], [26], [ ,,,0],27]. Her fikk vi bekreftet disse observasjonene i EOC. Fra 60 EOC PMBC prøver, ineffektive utvidelser etter stimulering med enten BrHPP eller Zol forekom hos 40% og 33% av tilfellene, respektivt. Interessant, våre komparative analyser avslørte også at BrHPP og Zol skilte seg i deres kapasitet til å utvide Vγ9Vδ2 PBMC fra pasienter. Prøver som ikke ble effektivt utvidet med BrHPP kunne effektivt utvides med Zol, og omvendt var også sant. Disse resultatene antyder at hver forbindelse som kan bli testet i småskala ekspansjons analyser for å muliggjøre valg av den beste forbindelsen for hver enkelt pasient. Likevel, 27% av PBMC prøver fra EOC pasienter forble ineffektivt utvidet med begge forbindelser (LR PBMC). Vi viste at Vγ9Vδ2 cellene i disse
ex vivo
LR PBMC ikke bare hadde redusert proliferativ kapasitet, men også vist en endret produksjon av proinflammatoriske cytokiner IFN-y og TNF-a? Sammenlignet med Vγ9Vδ2 celler fra å reagere (R) PBMC. Mette doser av BrHPP klarte å gjenopprette responsen Vγ9Vδ2 celler i LR PBMC. Disse resultatene støtter en iboende funksjonell defekt LR Vγ9Vδ2 PBMC og tyder på at bruk av høyere doser av phosphoantigens å forbedre responsen av Vγ9Vδ2 celler i LR EOC PBMC ville være mislykket. Så vidt vi vet, er dette den første
ex vivo
demonstrasjon av endrede Vγ9Vδ2 celle effektorfunksjoner i EOC pasienter.
Mange parametere kan være relatert til dette redusert funksjonalitet. Tapet eller redusert ekspresjon av CD3ζ kjeden på T-celler fra kreftpasienter som har vært implisert i nedsatt T-celleaktivering [28]. Men ingen forskjeller ble observert i CD3ζ kjeden uttrykk på
ex vivo
Vγ9Vδ2 celler mellom LR og R PBMC i vår EOC årsklasse, noe som indikerer at uttrykket av denne kjeden er ikke utløsende. Defekter i uttrykk for aktivering markører kan også være assosiert. Her molekylet CRTAM, nylig beskrevet av vår gruppe som en fenotypisk markør som er sterkt beslektet med det aktivering av Vγ9Vδ2 PBMC [25], ble funnet å bli uttrykt på lignende måte på Vγ9Vδ2 celler fra både LR og R EOC PBMCer etter BrHPP stimulering. Denne observasjonen tyder på at signal hendelser som førte til CRTAM uttrykk ikke er defekt på Vγ9Vδ2 fra LR PBMC. Dessuten kan nærværet av CD4
+ CD25
highFoxP3
høy-T regulatoriske celler (Tregs) være involvert i celle Vγ9Vδ2 manglene hos kreftpasienter [29]. Nyere data fra Kunzmann
et al
. har dokumentert at en økning i Treg: Vγ9Vδ2 forholdet trykt phosphoantigen-indusert γδ T celleproliferasjon og bidro til staten av tilsynelatende immunologisk manglende respons på phosphoantigens som ble observert hos noen kreftpasienter [27]. Våre resultater i EOC pasientene viste en økt Treg: Vγ9Vδ2 forholdet i
ex vivo
LR PBMC. Men vi fant ikke en invers korrelasjon mellom dette forholdet og fold økning av Vγ9Vδ2 celler i respons til enten BrHPP eller Zol. Videre Kunzmann
et al
. har rapportert at uttømming av tregs (ved hjelp av CD25-depletion) i lavt svarer PBMC fra pasienter med svulster andre enn EOC restaurert Vγ9Vδ2 celle ekspansjon i respons til phosphoantigens. Her, gjorde det samme celle uttømming i LR PBMC fra EOC pasienter ikke bedre spredning av Vγ9Vδ2 celler som respons på phosphoantigens eller aminobisphosphonates. I ytterligere analyser, testet vi en skrå fremgangsmåte for celle uttømming for å fjerne Tregs fra LR EOC PBMC og samtidig bevare CD25
+ aktiverte celler med bruk av CD4
+ CD25
+ CD127
dim /- Regulatory T Cell Isolation Kit II fra Miltenyi Biotec (data ikke vist). Interessant, virkningene av en slik utarming på proliferasjonen av celler Vγ9Vδ2 var lik den som ble observert med CD25-uttømming. Alle sammen, disse resultatene tyder på at tregs ikke er involvert i svekket spredning av Vγ9Vδ2 celler i EOC.
Alternativt forskjeller i
ex vivo
andeler av naive og minne Vγ9Vδ2 celle undergrupper kan være forbundet med nedsatt funksjon av Vγ9Vδ2 EOC PBMC, som det har blitt observert i andre krefttyper [12], [21], [22]. Heri, fant vi at den naive undergruppe ble betydelig redusert i
ex vivo
LR EOC PBMC. Denne reduksjonen kan ha blitt utløst av den gjentatte antigen grunning av Vγ9Vδ2 celler
in vivo
under utviklingen av sykdommen og med alder, som fører til en markert differensiering av naive celler til minnecellen rommet hos noen pasienter. De Vγ9Vδ2 cellefrekvenser i
ex vivo
PBMC fra pasienter kan også være relatert til ineffektive Vγ9Vδ2 celle utvidelser. Data fra litteraturen om dette problemet er divergerende. En korrelasjon mellom baseline prosenter av Vγ9Vδ2 celler i PBMC fra forskjellige kreftpasienter og
ex vivo
ekspansjonskapasitet er etablert nylig [12], mens en annen tidligere studie rapporterte ingen sammenheng mellom de samme parameterne i en stor kohort fra pasienter med forskjellige typer kreft [27]. Vår studie av EOC pasientene støtter den siste observasjonen av spesielt reduserte Vγ9Vδ2 cellefrekvenser i
ex vivo
LR PBMC. Disse manglene i Vγ9Vδ2 PBMC, kombinert med nedgang i andelen av den naive undergruppe som er utstyrt med proliferativ kapasitet [30], kan være delvis ansvarlig for reduksjonene i Vγ9Vδ2 celleproliferasjon som ble observert i noen LR EOC PBMC. Av notatet, ble de perifere blod Vγ9Vδ2 cellefrekvenser i EOC pasienter påvirkes ikke av kjemoterapi og vi bekreftet en aldersavhengig nedgang på Vγ9Vδ2 celle frekvenser i EOC pasienter, som ble observert av andre forfattere i friske individer [31], [32]. Viktigere, vi demonstrert at en Vγ9Vδ2 celle frekvens blant
ex vivo
PBMC fra EOC pasienter med 0,35% eller mindre var alltid forbundet med ineffektive utvidelser i respons til BrHPP og til Zol. Disse data identifisere Vγ9Vδ2 cellen frekvens i PBMC på 0,35% eller mindre som en unik biomarkør som kan være nyttig for prediksjon av ineffektive utvidelser av PBMC fra EOC pasienter i respons til både konvensjonelle BrHPP- eller Zol-baserte γδ ekspansjonsprotokoller.
Et annet viktig poeng er adressert i denne studien var relasjonene mellom Vγ9Vδ2 celler og de kliniske resultatene av EOC pasienter som ble behandlet med kirurgi pluss platina-basert kjemoterapi. Platinaderivater er blitt beskrevet som immunmodulerende forbindelser, og søkerimmun biomarkører som αβ T-celler har allerede vært implisert i virkningen av disse cytostatika [33], [34]. To studier i menneskelig avansert ovarialcancer har rapportert at tilstedeværelsen av tumor-infiltrerende CD3
+ T celler er korrelert med bedre kliniske resultater hos pasienter som ble behandlet med kirurgi pluss platina-basert kjemoterapi [35], [36]. Av disse to studiene, har man også rapportert en sammenheng mellom tilstedeværelsen av infiltrere γδ T-celler og en kort sykdomsfritt intervall etter behandling [36]. Men denne studien, som var basert på en molekylær vurdering av TCRγ ved hjelp av PCR-analyse, ikke diskriminere mellom Vγ9Vδ2 og andre γδ celler. Her viser vi at EOC pasienter med nedsatt perifer blod Vγ9Vδ2 celle frekvens på 0,35% eller mindre, noe som er korrelert sterkt med en svekket Vγ9Vδ2 PBMC funksjonell profil, er mer sannsynlig å bli ildfast til platina-basert kjemoterapi og vise et kortere sykdoms overlevelsestid etter behandling. En multivariat analyse bekrefter at denne reduserte frekvensen er en uavhengig prediktor for sykdomsfri overlevelse tid. Derfor kan den Vγ9Vδ2 cellen frekvensen i PBMC anvendes som en prognostisk biomarkør i EOC pasienter. Til sammen våre observasjoner støtter konklusjonen om at resultatene for kjemoterapi-behandlede pasienter er mer gunstig når det ikke er noen mangler i tallene og funksjonaliteten til perifert blod Vγ9Vδ2 celler.
