Abstract
Bakgrunn
Devil Facial Tumor Disease (DFTD) er en unik klonal kreft som truer verdens største kjøttetende pungdyr, den tasmanske djevelen (
Sarcophilus harrisii
) med utryddelse. Denne overfør kreft er gått mellom enkelt djevler ved celle implantasjon under sosiale interaksjoner. Svulsten oppsto i en Schwann celle av en enkelt djevel over 15 år siden, og siden da har utvidet clonally, uten å vise tegn til replicative senescence; i sterk kontrast til en somatisk celle som viser en begrenset kapasitet for replikering, kjent som «Hayflick limit».
metodikk /hovedfunnene
I denne studien undersøker vi hvilken rolle telomerlengde , målt som telomere Copy Number (TCN), og telomerase og shelterin genekspresjon, samt telomeraseaktivitet i å opprettholde hyperproliferasjon av Devil Facial Tumor (DFT) celler. Våre resultater viser at DFT-celler har korte telomerer. DFTD TCN ikke skiller mellom geografiske regioner eller mellom stammer. Imidlertid har TCN økt over tid. Ubegrenset celleproliferasjon er sannsynlig å ha blitt oppnådd gjennom den observerte oppregulering av den katalytiske subenhet av telomerase (
TERT
) og samtidig aktivering av telomerase. Oppregulering av den sentrale komponenten i shelterin,
TRF1
-intercating nukleær faktor 2 (
TINF2
) gir DFT en mekanisme for telomerlengde homeostase. Jo høyere uttrykk for både
TERT Hotell og
TINF2
kan også beskytte DFT celler fra genomisk ustabilitet og forbedre tumor spredning.
Konklusjoner /Betydning
DFT celler ser ut til å overvåke og regulere lengden av de enkelte telomerer: det vil si kortere telomerer er langstrakte med opp-regulering av telomerase-relaterte gener; lengre telomerer er beskyttet fra ytterligere forlengelse av medlemmer av shelterin komplekset, noe som kan forklare mangelen på romlig og belastning variasjon i DFT-telomer-kopiantall. Den observerte lengdeøkning i genuttrykk i DFT vevsprøver og telomerase aktivitet i DFT cellelinjer kan indikere et utvalg for mer stabile svulster med høyere proliferativ potensial
Citation. Ujvari B, Pearse AM, Taylor R, Pyecroft S , Flanagan C, Gombert S, et al. (2012) telomerer Dynamics og Homeostase i en overførbar kreft. PLoS ONE 7 (8): e44085. doi: 10,1371 /journal.pone.0044085
Redaktør: Gabriele Saretzki, University of Newcastle, Storbritannia
mottatt: 14 januar 2012; Godkjent: 31 juli 2012; Publisert: 29 august 2012
Copyright: © Ujvari et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av Eric Guiler fondet (Save the Tasmanian Devil Appeal): https://www.tassiedevil.com.au/tasdevil.nsf/Grants- -scholarships/F3F98304778C800ECA2576CB007D1E6B, og den australske Forskningsrådet: https://www.arc.gov.au/. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Verdens største kjøttetende pungdyr, den tasmanske djevelen (
Sarcophilus harrisii
) har nylig blitt truet av utryddelse på grunn av en unik overførbar kreft, Devil Facial Tumor Disease (DFTD) [1], [ ,,,0],2], [3]. Før fremveksten av sykdommen, djevler var vanlig i Tasmania. Men siden den første glimt av DFTD i 1996, har sykdommen spredd seg over hele øystaten, som resulterer i befolkningen synker på opptil 90% [3]. Sykdommen forekommer nå i over 80% av djevelens geografisk område, og den raske befolkningsnedgang har ført til den tasmanske djevelen blir oppført som truet av internasjonal (International Union for Conservation of Nature [4]), samt nasjonale og statlige myndigheter [ ,,,0],5].
DFTD overføres mellom mennesker ved å bite i sosiale interaksjoner [6] og manifesterer i brutto ondartede svulster rundt i munnhulen, med hyppige metastaser til andre organer [7], [8]. På grunn av sult, sekundære infeksjoner og organfeil, djevler vanligvis gi etter for sykdommen innen 6 måneder svulst veksten [1], [7]. Cytogenetisk analyser har vist at DFTD er forårsaket av et falskt klonal cellelinje [9], som er sannsynligvis avledet fra celler av neural crest avstamning (Schwannske celler) [8], [10]. Selv om DFTD besitter en meget rearrangert genom, og er karakterisert ved tumorspesifikke komplekse translokasjoner og kromosomale rearrangementer, er cellelinjen used (kromosomalt) stabil [9]. Nylig har imidlertid fire, nært beslektet, men karyotypically distinkte DFT stammer har blitt identifisert, noe som tyder på at svulsten utvikler seg [11], [12]. Til tross for de fire ulike DFT stammer, har genetiske studier med mikro og immun-genmarkører viste at Devil Facial Tumor (DFT) celler er genetisk identiske [10], [13], [14], [15].
Siden deres veksten i 1996 [9] DFT cellene har gjennomgått kontinuerlig divisjon og forplantning i tusenvis av djevler uten utmattende deres evne til å replikere og svekke deres genomisk stabilitet. I motsetning til dette, normale humane somatiske celler viser en begrenset kapasitet for replikasjon, er kjent som «Hayflick limit» [16]. Det er, etter et gitt antall divisjoner, cellene eksos deres replicative potensial på grunn av kortere telomerer og angi en tilstand som kalles replicative alderdom. I hyperproliferative sykdommer, så som tumorgenesen, når telomere slitasje når et kritisk nivå, celler inn i en fase av vekststans referert til som «krise» [17], [18], [19]. Ved opp-regulering eller reaktivere telomere terminal transferase enzym (telomerase), kreftceller er i stand til å komme ut av «krise» tilstand og vedlikeholde telomerer som er litt lengre enn de som ble observert under «krise» [17], [20].
Telomerer er ribonucleoprotein komplekser i endene av eukaryote kromosomer viktige i regulering av celle levetid [18]. Deres primære funksjoner er å sikre riktig kromosom segregering under mitose, og for å forebygge kromosom fusjon og samtidig cellesyklus arrest, forårsaket ved slutten av kromosomene blir behandlet som DNA dobbel-tråd pauser [21]. I virveldyr, inkludert tasmanske djevler, telomerer består av variable antall tandem repetisjoner (TTAGGG nukleotider) er bundet av en spesialisert multiprotein kompleks kjent som shelterin [22], [23]. Telomerlengde homeostase i bakterie linje- og tumorceller er oppnådd gjennom den negative tilbakekoplingssløyfe av den shelterin komplekset og den telomere terminal transferase enzym [24]. Telomerase er aktivert i pluripotente embryonale, og voksne stamceller, for å stanse den progressive telomere slitasje ved tilsetning av TTAGGG gjentar til 3′-tråd av kromosomer [24]. De fleste humane tumorcellelinjer har stabile telomere innstillinger, som oppnås ved den negative regulering av telomerase ved shelterin komplekset [25]. Den shelterin Komplekset består av tre shelterin underenheter:
TRF1, TRF2 Hotell og
POT1
, som er forbundet med tre ekstra proteiner
TPP1, RAP1 Hotell og
TINF2
.
TINF2 product: (
TRF1
-interacting nukleær faktor 2, eller også kalt
TRF1
-Interacting Nuclear protein 2 (
TIN2
)) har en sentral plass i proteinkompleks, ved å tilveiebringe en bro mellom de underkomponentene av shelterin (for oversikt se [26]). Det er blitt vist at lave ekspresjon av
TINF2
har en destabiliserende effekt på shelterin [27], [28]. På grunn av den sentrale og kritiske rollen
TINF2
«(
TIN2
) i shelterin stabilitet vi valgte å måle uttrykket av dette genet, som en proxy for shelterin aktivitet.
Oppbyggingen av shelterin langs telomeric gjenta rekke hindrer videre telomerase indusert telomerer forlengelse [23]. Humane kreft studier har vist at den felles opp-regulering av telomerase ekspresjon og genene i shelterin komplekset kan lette i å stabilisere cancerceller ved å forhindre aktivering av DNA-skade responser, for eksempel apoptose [27]. I omtrent 85% av humane cancere har telomerase-aktivitet blitt vist å lette malign transformasjon ved å opprettholde replikative potensiell [29], [30]. I de resterende 10-15% av kreft, er forhindring av telomer-tap oppnås i fravær av telomerase-aktivitet, gjennom en rekombinasjon-mediert mal brytermekanisme er kjent som alternative forlengelse av telomerer (ALT) [31]. Derfor kreftceller er i stand til å unnslippe apoptose og dermed opprettholde uendelig replikasjonskapasitet.
DFTD cellelinjen har vært kontinuerlig å dele seg og tilpasse seg mikromiljøet av hver annen vert i over 15 år. Derfor er dette clonally overførbar sykdom gir en enestående mulighet til å studere kreftcelle utvikling og progresjon
in vivo
. Økt kunnskap om telomerer homeostase i denne overfør kreft kan gi ny innsikt i hvordan DFT celler oppnå og opprettholde sin hyperproliferative potensial og kan hjelpe oss å forstå opprinnelsen, somatisk evolusjon og ekstraordinære suksessen til denne parasittiske klonal avstamning. Videre har både
TERT Hotell og
TINF2
har blitt foreslått som potensielle terapeutiske mål i kreft hos mennesker [32], [33] og øke vår forståelse av hvilken rolle disse genene i Devil Facial Tumor sykdom kan åpne nye veier for sykdom behandling.
i denne studien har vi fokusert på rollen av telomer-lengden, kvantifisert som telomere Kopier numre (heretter TCN) i hyper av DFT prøver. Stedfortredere for telomerase aktivitet i tumor vevsprøver vi undersøkt uttrykk for den katalytiske subenhet av telomerase (
TERT
) og en av de viktigste komponentene i shelterin,
TRF1
-intercating nukleær faktor 2 (
TINF2
). I tillegg ble tidsmessige endringer i telomerase aktivitet kvantifisert i fem DFT cellelinjer.
Resultater
(a) telomere Restriction Fragment lengde analyserer
telomere restriksjonsfragment (TRF) lengde var analysert i både primær- og metastastatic svulster, samt milt prøver fra fire tasmanske djevler (totalt 12 prøver). Vi klarte ikke å tildele telomerlengde i alle de 12 prøvene som restriksjonskutting produsert flere gjentatte TRF-flekker på ulike lengder (alt fra 2 kpbs opp til 18 kpbs). (Figur 1)
Eksempel navn skildre den tiden av samlingen (10 = 2010). Identiske tallene representerer ulike vevsprøver hentet fra samme dyr, S skildrer milt og T viser DFT prøver. MWM står for molekylære markører. CTRL 1 indikerer lav molekylvekt kontroll-DNA (lengde: 3,2 kbp), CTRL 2 angir vekt kontroll-DNA med høy molekyl (lengde: 10,2 kbp). Kontrollprøver ble levert i Telo TAGGG TL Assay Kit og har sin opprinnelse fra udødelige cellelinjer.
(b) Relativ telomerer gjenta kopiantall
Til sammen 65 vevsprøver, samlet inn fra 17 steder over Tasmania (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, Mt William, Narawntapu, Railton, Ravenswood, Reedy Marsh, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale og West Pencil Pine, figur 2), ble inkludert i den relative telomere gjenta kopiantall analyse. Milt, lunger og tumorprøver viste en betydelig TCN variasjon (Kruskal Wallis test: T = 17,1, P = 0,0007, DF = 3); med svulster (både primære og metastatisk) som viser den laveste (gjennomsnitt = 3.21 ± 3.28) og milt den høyeste (gjennomsnitt = 12,52 ± 4,62), mens lunge prøvene viste mellom TCN (gjennomsnitt = 8,03 ± 2.04, figur 3). En posthoc Conover-Inman test (tilgjengelig i StatsDirect) viste ingen signifikant forskjell i TCN mellom lunge og milt (P = 0,52), mellom lunge og metastase (P = 0,08), mellom primærsvulster og metastase (P = 0,52). Den samme test gjorde, men viser en betydelig forskjell i TCN mellom lunge og primærtumorer (P = 0,006), mellom milt og tumor (P = 0,0001), og mellom milt og metastase (P = 0,01).
Tumor progresjon innen 2003 avbildet med stiplet, innen 2005 med stiplet-prikket og innen 2007 med stiplede linjer. Datoer angir progresjon datoene for DFTD. Sted forkortelser: Bo = Bothwell, Br = Bronte Park, Bu = Buckland, Fen = Fentonbury, For = Forestier, Fre = Freycinet, Ham = Hamilton, MTW = Mt William, Na = Narawntapu, Ra = Railton, Rav = Ravenswood, Re = Reedy Marsh, S = Sorell, STM = St. Marys, Vi = Weegena, Wi = Wisedale, WPP = West Pencil Pine.
Feilfelt skildre standardavvik. Eksempel på navnene indikerer tidspunktet for samlingen (06 = 2006, 07 = 2007, 10 = 2010). Identiske tallene representerer ulike vevsprøver hentet fra samme dyr. Antall prøver som brukes i analysen: primære svulster samlet i 2006: N = 30, 2007: N = 13 og 2010: N = 8; metastase: N = 4, milt: N = 5, lunge: N = 5.
(c) Temporal (langsgående) geografisk og belastning variasjon i TCN
En Kruskal-Wallis test avdekket en betydelig tidsmessig variasjon i TCN av prøver samlet inn i 2006, 2007 og 2010 (T = 7,66, P = 0,02, DF = 2) og en posthoc og en Conover-Inman test viste signifikante forskjeller i TCN mellom år 2006 og 2007 ( P = 0,03) og 2006 og 2010 (P = 0,01), men ble ikke observert noen signifikant forskjell i TCN mellom årene 2007 og 2010 (P = 0,6). Innlegget hoc testen antyder dermed en tidsmessig økning i TCN (figur 4).
Feilfelt skildre standardavvik. Det ble ikke observert signifikante forskjeller i telomerer kopiantall (TCN) mellom år 2006 og 2007 (P = 0,03) og 2006 og 2010 (p = 0,01), men ble ikke observert noen signifikant forskjell i TCN mellom årene 2007 og 2010 (P = 0,6). * Indikerer signifikante forskjeller
Vi har ikke imidlertid observere noen signifikant forskjell i TCN blant de tre geografiske regioner (East, Central, North-West) (Kruskal Wallis test. T = 1,75, P = 0,42, DF = 2), og heller ikke blant de fire forskjellige stammer (Kruskal Wallis test. T = 2.1, P = 0,56, DF = 3)
(d) TERT og TINF2 uttrykk
Devil
TERT Hotell og
TINF2
uttrykk var signifikant oppregulert i primære svulster i forhold til milten etter en gjennomsnittlig faktor på 14,63 P 0,0001 (. Std Error (SE) på mellom 4,5 og 37,8) og 37,86 P 0,0001 (SE i området mellom 4,6 til 272,9), henholdsvis (figur 5).
TERT Hotell og
TINF2
uttrykk viste betydelig variasjon mellom tumorprøver. Vi fikk imidlertid ikke observere noen signifikant sammenheng mellom TCN og
TERT
eller
TINF2
uttrykk i tumorprøver (Spearman rank korrelasjon, R = -0,31, p = 0,36, N = 11 R = -0,05, p = 0,88, N = 11, henholdsvis)
Antall prøver som brukes i analysen:. svulster N = 11 og milt N = 5. stiplede horisontale linjer viser gjennomsnittlig relativ genekspresjon, boksplott viser omfanget av standard feil og barer skildre 95% konfidensintervall.
i svulstene, uttrykket nivået av
TINF2
var betydelig lavere enn for
TERT
(tosidig Mann-Whitney U-test, U = 27, P = 0,03, median
TINF2
= 0,51, median
TERT
= 3,58). Til tross for forskjellen i uttrykket nivået vi observert en signifikant sammenheng mellom
TERT Hotell og
TINF2 plakater (Spearman rank korrelasjon R = 0,83, P = 0,0017, N = 11). Vi har også oppdaget en betydelig tidsmessig variasjon i
TERT Hotell og
TINF2
uttrykk nivåer som både
TERT Hotell og
TINF2
viste signifikant økt uttrykk nivåer i 2010 sammenlignet til 2007 (tosidig Mann-Whitney U-test, U = 28, P = 0,0173 og U = 28,5, P = 0,013, henholdsvis;
TERT
median 4,77 og 2,44, henholdsvis;
TINF2
median 2,84 og 0,47 henholdsvis figur 6).
Åpne barer skildre TERT uttrykk, svarte striper skildre TINF2 uttrykk. Antall prøver som brukes i analysen: svulster samlet inn i 2007: N = 5 og 2010: N = 6. * viser signifikante forskjeller (p = 0,0173 og p = 0,013, henholdsvis)
(e. ) Telomerase aktivitetsanalyse
Telomerase aktivitet ble påvist i fem av de DFT cellelinje prøver. Videre ble en positiv timelig skift observert i telomerase aktivitet (totalt produkt generert) 2003-2011 (Spearman rank korrelasjon, R = -0,9, p = 0,037, N = 5, figur 7).
De fem cellelinjer stammer fra tumorprøver innsamlet i 2003, 2006, 2007, 2010 og 2011. Søylene representerer standardfeil mellom tekniske rapporter (N = 3).
Diskusjoner
Som mange menneskers kreft [34], [35], Devil Facial Svulster har korte telomerer.
TERT
genuttrykk er oppregulert 15 ganger i DFT celler i forhold til miltceller, og telomerase aktivitet er til stede i DFT cellelinjer. Dette telomerase aktivitet hindrer DFT celler fra å komme inn replicative senescence, og tatt sammen med mangelen på ekstrakromosomalt telomeric DNA (Pearse pers. Com) i DFT Karyotyper, peker mot telomerase oppregulering, ikke alternativ forlengelse av telomerer (ALT), som den primære mekanisme for DFT udødelighet [31].
Høy uttrykk for
TINF2
, en negativ regulator av telomerase aktivitet [23], i DFT celler antyder at telomer-forlengelse er sterkt regulert i denne kreftformen. DFT-celler ser ut til å overvåke og regulere lengden av de enkelte telomerer dvs. kortere telomerer er forlenget med telomerase-aktivitet; lengre telomerer er beskyttet mot ytterligere forlengelse av shelterin komplekse [27].
Økt
TERT Hotell og
TINF2
uttrykk mest sannsynlig forklare mangelen på romlig variasjon i DFT TCN. Også gjør TCN ikke skiller mellom DFTD stammer. Men den timelige økningen i
TERT Hotell og
TINF2
genuttrykk og enzymaktivitet kan være knyttet til vekst fordel og økt tumorprogresjon i DFT, som det er i kreft hos mennesker [34], [ ,,,0],36], [37].
De korte telomerer og oppregulering av telomerase motvirke sannsynlig hverandre. De korte telomerer føre til økt genetisk ustabilitet men telomerase aktivering forenkler tumorvekst ved enten hemmer ytterligere kromosom ustabiliteter eller ved å omgå kontrollposter som gjenkjenner dysfunksjonelle telomerer [37]. Lengre telomer-lengden kan sikre suksess og overlevelse av DFT celler ved å stabil kromosomale rearrangements og hindre ytterligere genomisk ustabilitet.
DFT prøvene viste gjennomgående lavere TCN forhold til andre vev, men en betydelig (16 ganger) blant-prøven variasjon av TCN ble observert. Metodiske utfordringer, mest sannsynlig forårsaket av avbrudd i telomeric rapporter med restriksjonsseter (Felles for pungdyr kromosomer) [38], hindret oss fra å korrelere variasjon i kopiantall til variasjon i telomerlengde.
TERT Hotell og
TINF2
RNA-nivåer ikke forbinder med TCN, et funn også observert i andre menneskelige kreftcellelinjer [39].
Fremtidig forskning bør undersøke effekten av telomerlengde variasjon på tumor fitness. Er det en evolusjonær optimal rundt telomerlengde? Har selektive krefter opprett telomerlengde likevekt eller velg for tumorceller med lengre telomerer? Vil økt
TERT
,
TINF2
genekspresjon, telomerase aktivitet og lengre telomerer føre til utvikling av en mer stabil DFT skjema med høyere vekst og proliferativ potensial?
Siden første opptreden for 15 år siden, DFTD har gått gjennom tusenvis av djevler, og drepte nærmere 80% av dyrene, uten å gjennomgå replicative alderdom. DFTD representerer således en av de eldste naturlig levende, og kontinuerlig passert cellelinjer i naturen. Vi har vist at det dynamiske samspillet mellom telomerase og shelterin kompleks er avgjørende for å lykkes med denne parasitt, smittsom kreft. Utvalg har fremmet utviklingen av DFT celler med økt telomere kopiantall samt økt genekspresjon og telomerase aktivitet, som begge kan til slutt føre til en raskere voksende svulst. DFTD gir en kraftig modellsystem for å forstå tumorgenesen ikke bare i dyrelivet, men også i kreft hos mennesker. Videre studier som fokuserer på å forstå den eksakte mekanismen for telomerer vedlikehold og regulering i DFT cellene vil føre til bedre forståelse av de evolusjonære strategier og mekanismer som ligger til grunn og vedlikeholde ubegrenset proliferativ potensialet av kreftceller.
Materialer og metoder
(a) prøver
Vevsprøver ble samlet inn fra 17 steder over Tasmania (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, Mt William, Narawntapu, Railton, Ravenswood, Reedy Marsh, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale og West Pencil Pine, figur 1) av medlemmer av Institutt for Primary Industries, Parker, Vann og miljø (DPIPWE) fra avlivet DFTD påvirket djevler og lagret på Animal Health Laboratories (DPIPWE) . Forskningen ble utført med godkjenning fra DPIPWE (Department of Primary Industries, Parker, Vann og Miljø, Tasmania) dyr etikk comitte, dyreetikk No: 101 2010/11. Vi har innhentet vevsprøver fra 48 djevler. Vi hadde tilgang til milt og primærtumor, samt metastase prøver fra fire djevler. 51 primære svulster, fem metastaser, fire lunge og fem milt DNA-prøver ble brukt i analysene (figur 2).
For å undersøke geografisk /romlig variasjon i telomere kopiantall, prøvene ble delt inn i tre geografiske regioner (Øst = fordeling før 2003, Central = fordeling mellom 2003-2005 og Nordvest-= fordeling mellom 2005-2007) basert på time /romlig progresjon av DFTD over Tasmania [40]. Vi hadde informasjon om de spesifikke stammer av 45 tumorprøver og brukt disse prøvene for å undersøke telomerer kopi nummer variasjon mellom DFT stammer.
Oral variasjon i telomere frafallsrater var basert på kopiantall observert i prøver samlet inn i 2006, 2007 og 2010 (N = 51). På grunn av prøveinnsamlingsprosedyrer vi var bare i stand til å trekke RNA fra fem milt og 11 (5 fra 2007 og 6 fra 2010) primærtumorprøver som senere ble analysert med kvantitativ real-time PCR.
telomerase aktivitet Assayene ble utført på fem lyserte DFT-cellelinje eksempler hentet fra DPIPWE. Tumorcellelinjer ble samlet og holdt ved DPIPWE i henhold til beskrivelsene av Pearse et al 2012 [11]. De fem cellelinjer stammer fra tumorprøver innsamlet i 2003, 2006, 2007, 2010 og 2011.
(b) DNA-ekstraksjon, telomer-fragment lengde målinger og telomer-kopi nummer kvantifisering
Genomisk DNA ble isolert fra vevsprøver av fenol-kloroform ekstraksjon. Eksempel DNA kvantitet og kvalitet ble målt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE).
(c) telomere Restriction Fragment Length analyser (TRFL)
telomere restriksjonsfragment (TRF) lengde ble kvantifisert ved Southern blot hybridisering følge protokollen som er beskrevet i Telo TAGGG TL Assay Kit (Roche, Indianapolis, iN), ved hjelp av konstant felt elektroforese. Etter oppslutning genomisk DNA med en blanding av
Hinf
I og
Rsa
restriksjonsenzymer for å fjerne sekvens-DNA varierte fra centromeric side av telomerer, ble telomerlengde analysert på agarosegeler, hvilken ble kjørt i 4 timer ved 5 V /cm. TRF fragmenter ble merket med en digoxigen merket probe, og TRF bildene ble senere utviklet på høy ytelse chemiluminescence film (Amersham Bioscience, Waukesha, WI).
(d) Kvantitativ PCR av relativ telomerer kopiantall
Relativ telomerer gjenta kopiantall ble analysert ved kvantitativ PCR (Q-PCR) som beskrevet av Cawthon [41]. Telomere spesifikke primere ble adoptert fra Cawthon [41], Tel1: 5’GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT -3 «; Tlf2, 5»-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA -3 «.
RPLP0 plakater (også kalt
36B4
) genet ble valgt som ett eksemplar gen etter metodikken i Cawthon [41], og løssalgs tilstedeværelse av dette genet i Tasmanian Devil genomet [42] ble bekreftet ved å søke genomet for alternative kopier av genet. Ingen alternativ
RPLP0
kopier eller pseudo ble funnet.
RPLP0
genet spesifikke primere ble utformet basert på Tasmanian Devil genomsekvens [42], bruker nettstedet Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi),
RPLP0_F
: 5’CTTCCCGTTCACCAAAGAAG -3 «og
RPLP0_R
: 5’TGTTCTGGACTGGCAAAGTG -3′. Q-PCR reaksjoner ble utført på RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) i 15 ul samlet volum, som inneholder 7,5 mL av Qiagen 2xQuantifast SYBR Grønn PCR Master Mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 mikrometer forover og bakover primere (den optimale primer konsentrasjoner) og 1 mL av gDNA (1 ng /mL konsentrasjon). Q-PCR-betingelsene ble etablert i henhold til produsentens protokoll: 95 ° C i 5 minutter denaturering etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 s (annealing-temperatur). Fluorescens signalet ble kjøpt til glødetemperaturen. Standardkurver ble generert ved hjelp av serie 01:05 (
RPLP0
) og 1:10 (telomerer) fortynninger av en sammensatt prøve som inneholder like deler av DNA fra milt og tumor vev ekstrakter. Alle fortynninger ble kjørt i triplikat. Standardkurver hadde en R
2 0,985 (
RPLP0
reaksjon: R
2 = 0,985 og telomere reaksjon R
2 = 0,997) og inneholdt minst fire (telomere reaksjon) eller fem (
RPLP0
reaksjon) fortynninger fra fortynningsrekke med et lineært dynamisk område på minst 3 størrelsesordener, og hadde PCR-effektivitet mellom 1,3 og 1,1 (henholdsvis). Alle prøver ble kjørt i fire eksemplarer, og alle CQ verdier for ukjente falt innenfor det lineære kvantifiserbar utvalg av de passende standardkurver. Programmet Rest [43] ble brukt til å beregne den normaliserte gangers endring av mål-genet sammenlignet med referanse genet. Denne programpakken korrigerer også for forskjellige reaksjons effektivitet. Statistisk signifikans (P 0,05).. Ble bestemt av en Pair Wise Fast Omdisponering Randomisering Test © som beskrevet av Pfaffl
et al product: [43]
(e) RNA ekstraksjon og kvantifisering av telomerase uttrykk ved kvantitativ RT-PCR
RNA ble ekstrahert fra vevsprøver ved hjelp av en kombinasjon av Trizol (Sigma, St. Louis, MO) og Qiagen RNeasy mini kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA kvalitet og kvantitet ble kvantifisert på en Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Genomisk DNA ble fjernet fra RNA prøver ved DNAse I AMPD1 kit (Sigma, St. Louis, MO) og cDNA ble syntetisert med den QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Germantown, MD). Telomerase genet spesifikke primere spenner ekson grenser ble utformet i den katalytiske protein underenhet av djevelen
TERT
genet, ved hjelp av Primer3Plus nettsted (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)
TERT
-F: 5’TGCTGTAGTCCAGAAGAATGC -3 «, og
TERT
-R: 5’TGCAGGGAAGAGGTTTCTTG -3′.
TRF1
-interacting nukleær faktor 2 (
TINF2
) primere ble utformet over eksoner 6 og 7
TINF2
-F: 5’TTGCCCTGACTCAGTATTGC -3 «, og
TINF2
-R: 5’GGATCCTGGAAAACTTGCTC -3 «. To gener,
GAPDH product: (
qGAPDH
) og
GUSB product: (
qGUSB
) ble brukt som Normaliser gener etter beskrivelsen av Murchison et al. [ ,,,0],10], [14]:
qGAPDHf
: 5’GACTCAACCACGTATTCGGCTC -3’and
qGAPDHr
: 5’ATATGATTCCACCCATGGCAAGTTCAA -3 «;
qGUSBf
: 5’CTGCTGCCTATTATTTCAAGAC -3’and
qGUSBr
: 5′-CAAGATCCAATTCAGGCTTAG -3 «. Q-PCR reaksjoner ble utført på RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) i 15 ul samlet volum, som inneholder 7,5 mL av Qiagen 2xQuantifast SYBR Grønn PCR Master Mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 mikrometer forover og bakover primere (den optimale primer konsentrasjoner) og 1 pl av cDNA (5 ng /mL konsentrasjon). Revers transkriptase negative og cDNA negative prøver ble kjørt sammen med cDNA prøvene som kontroller for å oppdage genomisk DNA forurensning og primer-dimer formasjoner. Q-PCR-betingelsene ble etablert i henhold til produsentens protokoll: 95 ° C i 5 minutter denaturering etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 s (glødetemperatur, AT). Fluorescens signal ble kjøpt på AT. For å evaluere den spesifikke amplifikasjon et endelig smeltekurve analyse (fra AT opp til 99 ° C) ble tilsatt under kontinuerlig fluorescensmålinger. Standardkurver ble generert ved å bruke serielle fortynninger av 1:5 en sammensatt prøve inneholdende like deler av cDNA-prøvene ble generert fra milt og vev RNA-tumor-ekstrakter. Alle fortynninger ble kjørt i triplikat. Standardkurver hadde en R
2 0,99 (
GUSB
reaksjon: R
2 = 0,998,
TERT
reaksjon: R
2 = 0,990 og
TINF2
reaksjon: R
2 = 0,993) og inneholdt minst fire (
TERT
reaksjon) eller fem (
GUSB Hotell og
TINF2
reaksjoner) fortynninger fra fortynning serien med en lineær dynamisk område på minst 3 størrelsesordener og hadde PCR effektivitet mellom 0,98 og 1,4 (
GUSB
: 1.1,
TERT
: 1,4 og
TINF2
: 0,98). Alle prøver ble kjørt i fire eksemplarer, og alle CQ verdier for ukjente falt innenfor det lineære kvantifiserbar utvalg av de passende standardkurver. Programmet Rest [43] ble brukt til å beregne den normaliserte gangers endring av mål-genet sammenlignet med referanse genet. Denne programpakken korrigerer også for de forskjellige reaksjons effektivitet. Statistisk signifikans (P 0,05) ble bestemt ved en Pair Wise Fast Omdisponering Randomisering Test © som beskrevet av Pfaffl
et al product: [43]
(f) Telomerase analysen
telomerase-aktiviteten ble målt ved anvendelse av trapes-RT telomerase deteksjon kit (Millipore, Bedford, MA). Celler ble lysert i 200 ul av CHAPS-buffer, og proteininnholdet ble kvantifisert ved hjelp av Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Aliquoter av cellelysat (250 ng protein /brønn) ble analysert i triplikat. Standarder, inaktiverte prøver, og ikke-mal reaksjoner ble også inkludert i analysen som kvalitetskontroller. Sanntids presiseringer ble utført med en RotorGene6000 flerfarget real-time PCR deteksjon system (Qiagen, Germantown, MD). Standardkurve ble generert fra TSR8 kontroll mal å følge produsentens instruksjoner.
