Abstract
Eggstokkreft er den gynekologisk kreft stiller høyest sykelighet og forbedring av behandlinger er fortsatt nødvendig. Tidligere studier har vist at østrogen-reseptor beta (ERβ) nivåer redusert sammen med eggstokkreft kreftutvikling. Her presenterer vi bevis for at gjeninnføring av ERβ i BG-en epitelial eggstokkreft celler som uttrykker ERα, fører
in vitro
til en nedgang på basal og østradiol-forfremmet celleproliferasjon. ERβ reduserte hyppigheten av celler i S-fasen og øket den ene av celler i G2 /M-fasen. På molekylnivå, fant vi at ERβ downregulated total retinoblastom (RB), fosforylert Rb og fosfor-AKT cellular innhold samt cykliner D1 og A2. I tillegg ERβ hadde en direkte effekt på ERα, ved sterk inhibering av dets ekspresjon og aktivitet, noe som kan forklare en del av de anti-proliferative virkning av ERβ. Ved å utvikle en ny preklinisk modell av ovarialcancer basert på et selvlysende ortotopisk xenograft i atymiske nakne mus, vi videre avslørt at ERβ ekspresjon reduserer tumorvekst og tilstedeværelsen av tumorceller i områder av metastase derav som resulterer i forbedret overlevelse av mus. Til sammen disse funnene avsløre en potensiell tumor-suppressor rolle ERβ i eggstokkene karsinogenese, noe som kan være av potensiell klinisk relevans for valg av den mest hensiktsmessige behandlingen for pasienter
Citation. Bossard C, Busson M, Vindrieux D, Gaudin F, Machelon V, Brigitte M, et al. (2012) potensielle rolle Østrogen Reseptor Beta som en tumor suppressor av ovarialcancer. PLoS ONE 7 (9): e44787. doi: 10,1371 /journal.pone.0044787
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 02.11.2011; Godkjent: 13 august 2012; Publisert: 06.09.2012
Copyright: © Bossard et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra ARC (Association pour la Recherche contre le Cancer, Grant No. 3582) (https://www.arc-cancer.net), The Ligue Nationale contre le Cancer (http: //www.ligue-cancer .nett). Muriel Busson ble støttet av FRM (Fondation pour la Recherche MEDICALE) (https://www.frm.org). DV var en mottaker av Ligue Nationale contre le Cancer. CB ble støttet av en HFSP fellesskap (https://www.hfsp.org/). KB lab er støttet av Agence Nationale de la Recherche (ANR, gi nummer 2010 JCJC 1104 01) (https://www.agence-nationale-recherche.fr/), Université Paris-Sud, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM) og Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité Val d’Oise), og er medlem av Laboratory of Excellence LERMIT (Laboratorium for fremragende forskning på medisiner og nyskapende Therapeutics) støttet av en bevilgning fra ANR (Investissements d’Avenir). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den eneste epitelcellelaget som omgir eggstokkene er i dag antas å være en av kildene til preneoplastiske lesjoner fører opphav til epitelovarialcancer svulster, som representerer det store flertallet av eggstokkreft [1]. Ovarialcancer (EOC) er den syvende vanligste kreftformen. Imidlertid er det fortsatt den fjerde mest dødelige fordi det er vanskelig å diagnostisere på tidlige stadier og dermed til å behandle [2]. Enten klassifisert på morfologiske kategorier (dvs. serøs, mucinous, endometrioid og klare celler) basert på histologiske kriterier og likhet epitel komponenter av normal skjede, eller mer nylig, klassifisert som lav eller høy grad av svulster [2], EOC er en kompleks sykdom som etiologi er dårlig forstått. Nye markører og mål for behandling er derfor et presserende behov.
Eggstokk er det viktigste organ for produksjon av østrogen, som i hovedsak innvirkning på veksten, differensiering og funksjon av reproduktivt vev [3]. Gjennom sin mitogen handling, østrogener spille roller i eggstokkene kreftutvikling. Flere studier har markert økt risiko for eggstokkreft hos pasienter som får langtidsøstrogenbehandling [4], [5], [6], [7], mens pasienter behandlet med oral prevensjon kombinere østrogen og progestin viste en redusert risiko for utvikling av en eggstokkreft [8], [9]. Østrogen handling er mediert av to reseptorer, ERα og ERβ, to transkripsjonsfaktorer av en stor familie av nukleære reseptorer [10], [11]. Om 40 til 60% av eggstokkreft uttrykke ERα [12], men det er interessant å legge merke til at bare en liten andel av dem vil ha nytte av antiøstrogenbehandling [13]. Rollen ERβ i eggstokkene biologi er fortsatt dårlig forstått, men det synes å være forskjellig fra ERα [14].
ERβ
knock-out dyr (βERKO) er subfertile, produsere færre kull og valper på superovulation induksjon [15], [16]. Eggstokkene av βERKO dyrene inneholder færre store antrum follikler og corpus luteum i forhold til villtype kullsøsken, som er samtidig med lavere nivåer av østradiol produsert [17] og en redusert uttrykk av viktige gener involvert i eggstokk funksjon, for eksempel aromatase (
Cyp19a1
), LH reseptor (
Lhcgr
) og prostaglandin syntase 2 (
Ptgs2
) [18].
Flere studier har avslørt en potensiell rolle for ERβ i EOC. Spesielt ERβ nivåene var lavere i ovarietumorer sammenlignet med normalt vev [19], [20], [21], [22]. Videre kan tapet av ERβ uttrykk korrelerer med en kortere total overlevelse av ovarialcancer pasienter [23]. ERβ nivåer er også assosiert med metastatisk lymfeknute status [24]. En polymorfisme (rs127572) av
ERβ
genet har også nylig blitt identifisert og vist å være assosiert med økt risiko for å utvikle eggstokkreft [25]. Det er imidlertid fremdeles ukjent hvorvidt denne polymorfismen påvirker ekspresjonen av ERβ. Den intracellulære Plasseringen av ERβ i tumorceller synes å være viktig. Faktisk har en fersk studie vist at ERβ ble lokalisert i cytoplasma av kreftceller, mens det var hovedsakelig atom i normale epitelceller [26]. I tillegg ble cytoplasmisk ekspresjon av ERβ korrelert til et dårlig resultat for pasienter med langt fremskreden serøs eggstokk-kreft [14]. Disse funnene, kombinert med de nevnte kliniske sammenhenger mellom ERβ og pasient overlevelse, fører oss til hypoteser om at ERβ er en kritisk faktor i eggstokkene tumorprogresjon og å avgrense den nøyaktige bidrag denne reseptoren i molekylære stier liggende EOC kreftutvikling.
for dette formålet har vi brukt BG-1 celler som en mobil modell og tok fordel av en orthotopic xenograft mus modell vi har utviklet. BG-1-cellelinjen er en human EOC cellelinje avledet fra en fast primær tumorvev fra en pasient med stadium III, dårlig differensiert eggstokk-adenokarsinom [27]. Disse cellene uttrykker ERα og er følsomme for østrogen i form av spredning [21], [28]. Eksperimentelle modeller på ovarial karsinogenese er viktig å forstå de molekylære mekanismer som er involvert i utviklingen av sykdommen, men også for å evaluere effekten av nye terapeutiske legemidler [29]. Flere modeller har blitt utviklet, blant annet xenograft og transgene modeller, ingen å være helt tilfredsstillende. De xenograft modeller som brukes i dag er enten intraperitoneal, subkutant eller orthotopically intrabursal i eggstokken. Bare noen få rapporter beskriver orthotopic xenograft. Likevel kan ortotopisk celle implantasjon bli oppfattet som mer fysiologisk, som kreftcellene direkte inokulert i eggstokk miljø og kan føre til metastasering. Derfor, for å undersøke hvilken rolle ERβ i EOC karsinogenese, valgte vi å dra nytte av en orthotopic xenograft mus modell basert på bruk av luciferase (Luc) -expressing menneskelige ovarialcancer BG-1 celler.
viser her at gjeninnføring av ERβ i BG-1 celler ved hjelp av et adenovirus fører
in vitro
til en hemming av både basal og østradiol-indusert celleproliferasjon. ERβ utøver sin anti-proliferative virkning ved en reduksjon av frekvensen av celler i S-fasen, en økning av celler i G2-fasen, sammen med en endret ekspresjon av cellesyklus regulatorer. På molekylært nivå, ERβ var i stand til å undertrykke ekspresjon, aktiviteten og signalisering av ERα, og dermed å blokkere dens proliferativ virkning. Videre ERβ var i stand til sterkt å redusere utviklingen av ortotopisk ovarial xenograft, så vel som tilstedeværelse av tumorceller områder av metastasering, som fører til en økt overlevelse av musene. Til sammen disse funnene støtter en rolle for ERβ som tumor-suppressor i EOC kreftutvikling.
Resultater
Tidligere rapporter har vist at ERβ er svakt uttrykt i EOC vev og cellelinjer utvunnet i forhold til normalt vev [11]. Vi tok fordel av den menneskelige EOC cellelinje BG-1, som uttrykker endogene nivåer av ERα og er følsom for østrogen [27]. Her har vi først bekrefte at BG-1 celler viser lave steady-state nivåer av ERβ produkter, dvs. mRNA og proteiner (Fig. 1A, B). Det neste steget mot å vurdere rollen til ERβ i eggstokkene kreft var å gjenopprette sitt uttrykk i eggstokkreft celler. Dermed ble BG-1 celler infisert med en ryggrad (Ad5) eller menneskelig
ERβ plakater (Adβ) som koder for adenovirus [30], [31].
ERβ
overekspresjon ble faktisk oppnådd i Adβ-infiserte celler som validert av real-time PCR og Western blot analyser (Fig. 1A, B). Interessant, ERβ nivåene var sterkt nedregulert av østradiol (E2) både RNA og proteinnivåer. Videre, i fravær av ERβ, ERα nivåer var også nedregulert ved E2, selv om i mindre grad. Når ERβ ble introdusert i cellene, ble den basale ekspresjonsnivået av ERα i fravær av E2 redusert og til det halve. Tilstedeværelsen av ERβ sterkt redusert ERα nivåer i nærvær av E2 (mer enn 15 gangers nedgang i 3 timer), noe som tyder på at ERβ øker nedbrytningen av ERα. Dette skyldes sannsynligvis proteasome avhengig nedbrytning av ERα og ERβ proteiner [32]. Effekten av ERβ overekspresjon på østrogen respons ble deretter undersøkt. Vi analyserte evne ERβ til transactivate en syntetisk luciferase reporter følsom overfor østrogener i BG-1-celler. Endogen ERα var i stand til å aktivere reporter i nærvær av E2 (fig. 1C). ERβ trykt sterkt aktiviteten av ERα i respons til E2, noe som tyder på at i nærvær av ERα, ERβ oppfører seg heller som en repressor enn en aktivator av østrogensignalisering. For å sikre av funksjonaliteten til reseptoren produsert, vi også sjekket aktiviteten av ERβ i EOC-cellelinjen PEO14 [33] som er rapportert for å uttrykke lave nivåer av ERα (fig. 1E), og dermed ikke svare på østrogener [34] . Både ERα og ERβ var i stand til å stimulere en østrogen-sensitive reporter på E2 eksponering, selv om ERβ var litt mindre aktive enn ERα (Fig. 1 D). Derfor, i fravær av ERα, beholder ERβ evnen til å transactivate østrogensignalveier. Når ERα og ERβ ble koekspresjon i PEO-14-celler, aktiviteten av reporter i nærvær av E2 var lik den ene av ERα alene. Dette tyder på at i ER-negativ PEO-14 cellelinjen, kan ERβ ikke påvirke ERα aktivitet. Western blot eksperimenter i PEO-14-celler viser at når ERα og ERβ ble uttrykt hver for seg, deres nivåer var sterkt redusert i nærvær av E2 (fig. 1E). Når ERα og ERβ ble koekspresjon ble nedbrytningen av ERα i nærvær av E2 svakt øket, men ikke i forhold sett i BG-1-celler. For ERβ, den koekspresjon av ERα forbedret litt nedbrytning av ERβ. Samlet disse data tyder på at ERα nivåer ikke er regulert på samme måte i BG-1 og PEO-14-celler, noe som kan forklare hvorfor ERα aktivitet ikke er drastisk redusert ved nærvær av ERβ i PEO-14 i forhold til BG-1 celler.
BG-1 celler ble infisert med Ad5 eller Adβ adenovirus og behandlet for 24 timer med kontroll kjøretøy etanol (Control) eller E2 10
-8M (E2). Uttrykket av ERβ og rS9 referanse genet ble målt ved real-time PCR. Resultatene representerer gjennomsnittet ± SD av ERβ ekspresjon normalisert ved rS9 av 3 uavhengige eksperimenter. Målinger av Adβ og Adβ + E2 grupper ble sammenlignet med uparede Student
t
test. ** P 0,001. B. Proteiner ble ekstrahert fra celler infisert i samme forhold som i A og behandles for 0, 3, 6 eller 24 timer med E2 10
-8M (E2). Nivåene av ERα og ERβ ble analysert ved western blot. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Den øvre band av ERβ blot merket med en stjerne tilsvarer aspecific flekker. C. Transkripsjonell aktivitet ERβ. BG-1-celler ble infisert med Ad5 eller Adβ adenovirus og transfektert med ERE2-TK-Luc reporter sammen med β-galaktosidase reporter. Cellene ble behandlet med etanol som bærer (kontroll) eller E2 (10-8) i 24 timer. Resultatene viser relative Luc aktiviteter (% av verdiene av Ad5-infiserte celler uten E2) ± SD etter normalisering med β-gal aktivitet (3 uavhengige eksperimenter). Målinger av Ad5 + E2 og Adβ + E2 grupper ble sammenlignet med uparede Student
t
test. * P 0,05. D. PEO14-celler ble infisert med Ad5, Adα, Adβ eller en kombinasjon av Adα og Adβ adenovirus og transfektert med ERE2-TK-LUC reporter sammen med β-galaktosidase reporter. Celler ble behandlet med kontroll bærer (kontroll) eller E2 (10-8) i 24 timer. Resultatene viser relative luciferase-aktivitet (% av verdiene av Ad5-infiserte celler uten E2) ± SD etter normalisering med β-gal-aktivitet (3 uavhengige eksperimenter). Målinger av Adα, Adβ og Adα + beta grupper ble sammenlignet med uparede Student
t
test. *** P 0,001. NS: ikke-signifikant. E. Proteiner fra PEO14 celler infisert i samme forhold som i D og behandlet med kjøretøy etanol (Control) eller E2 10
-8M (E2) for 3, 6 eller 24 timer ble analysert ved western blot med antistoffer mot ERα og ERβ . Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Den øvre bandet merket med en stjerne i panelet til høyre tilsvarer aspecific flekker.
neste studert effekten av
ERβ
uttrykk på kreftcelle spredning. BG-1 celler infisert med Ad5 eller Adβ adenovirus ble dyrket
in vitro
i fravær eller tilstedeværelse av E2. Som forventet, E2 stimulert proliferasjon av styre BG-1-celler (Fig. 2A). Interessant, ERβ undertrykt med 50% i både basal og E2-avhengig proliferasjon av BG-1-celler. Vi observerte også anti-proliferativ virkning av ERβ i ERα- og ERβ-negative PEO14 celler. Men denne inhibering ble ikke påvirket av E2 (fig S2). Mens
in vitro
effekter av ERβ har blitt observert så langt, er svært lite kjent for sin
in vivo
aksjon i eggstokkreft modeller. Som en første tilnærming for å vurdere dette punkt, vi brukte en modell av subkutan injeksjon. For å aktivere en følsom, dynamisk og tidlig oppfølging av tumorvekst, vi stabilt transfektert BG-1 celler med et konstituerende Luc reporter. Ovariectomized atymiske nakne mus ble implantert en pellet av kolesterol eller E2 og injisert med BG-1 celler infisert med Ad5 eller Adβ adenovirus. BG-1 celler dannet tumorer bare i nærvær av E2 (fig. 2B).
ERβ
uttrykk signifikant redusert med 70% E2-fremmet veksten av BG-1 celler, og dermed støtter en potensiell anti-proliferativ rolle for ERβ i EOC.
Veksten av BG-1 celler , uttrykker eller ikke ERβ ble overvåket
in vitro
ved hjelp av en celleteller. BG-1-celler ble sådd ut i 24-brønners plater og dyrket i nærvær av kjøretøyet eller E2 (10
-8M). Spredning er uttrykt som% av kontrollceller dyrket på dag 0. Data representerer gjennomsnittet ± SD fra tre paralleller. Målinger av Ad5 + E2 og Adβ + E2 grupper ble sammenlignet med uparede Student
t
test. ** P 0,001. B. ERβ hemmer tumorvekst i en bioluminescent subkutan musemodell. BG-1-celler som stabilt uttrykker Luc og infisert med Ad5 eller Adβ adenovirus ble injisert subkutant i ovarieektomiserte hunn nakne mus. Luciferase-aktivitet ble overvåket i 25 dager. Resultatene er uttrykt i fotoner /s (Ph /s) og representerer gjennomsnitt ± SD fra 8 dyr. Målinger av Ad5 + E2 og Adβ + E2 grupper ble sammenlignet med uparede Student
t
test. * P. 0,05
Vi utforsket de mekanismene som er ansvarlig for den anti-tumor handling av ERβ. Cellesyklusfordeling, ble sammenlignet ved flowcytometri i kontroll og ERβ-uttrykk BG-1-celler (fig. 3A). Vi gjorde ikke oppdage eventuelle SubG0 topp, noe som tyder på at det ikke apoptose skjedd.
ERβ
uttrykk ikke endre andelen av BG-1 celler i G0-G1 fase, men det sterkt redusert at celler i S-fasen. Vi fant også at
ER
β uttrykk utløste et økt antall celler i G2-M fasen av cellesyklus. Ekspresjonen av cellesyklus markører var ved overvåket ved Western blot analyser (fig. 3B). Flere cellesyklus regulatorer som Cykliner A og D1, AKT og Rb er rapportert å være regulert av østrogener [35]. Vi observerte at fosforylering av AKT ble øket ved E2 behandling i Ad5-infiserte BG-1-celler (fig. 3B).
ERβ
uttrykk ført til en nedgang i fosfor-AKT innhold i både kjøretøy- og E2-teated celler og dette skjedde ved 3, 6 og 24. ERβ forårsaket tilsvarende endringer i cyclin D1, total Rb og fosforylert Rb uttrykk. Faktisk nivåene av cyklin D1, total Rb og fosforylert Rb ble oppregulert ved behandling E2 i Ad5-infiserte celler, og denne induksjon ble redusert med ERβ. Cyclin A2 vises en induksjons sen 24 etter E2-behandling, og denne ble redusert ved nærværet av ERβ.
BG-1-celler ble oppsamlet 24 timer etter infeksjon med Ad5 eller Adβ adenovirus og analysert med hensyn på cellesyklusfordeling. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av 3 eksperimenter. Ad5 og Adβ grupper ble sammenlignet med uparede Student
t
test. ** P 0,001. B. BG-1 celler ble infisert med Ad5 eller Adβ virus. Etter infeksjon ble cellene behandlet i 3, 6 eller 24 timer med bærer (ethanol, C) eller 10
-8M E2. 30 ug av proteinekstrakter ble benyttet for Western blot. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Med mindre spesifisert, er forholdet mellom target proteiner i løpet av β-aktin angitt under gels. Representant for 2 forsøk.
For ytterligere å undersøke
in vivo
rollen ERβ i eggstokkene karsinogenese, setter vi opp en mer fysiologisk modell av orthotopic implantasjon av tumorceller i eggstokken. Ad5- eller Adβ-infiserte BG-1-Luc celler ble injisert i venstre eggstokk og tumorvekst ble overvåket av bioluminesens. Som vist på fig. 4A,
ERβ
uttrykk vesentlig forhindret tumorvekst. Når avlives på dag 28 etter injeksjon, vises kontrollmusene en klar økning av peritoneal volum og av tumorvolum i venstre eggstokk (Fig. 4B). I skarp kontrast, opptrådte volumet av både peritoneum og eggstokk mye redusert i mus injisert med ERβ-uttrykkende BG-1-celler. Vi neste fastslått hvorvidt metastatisk prosessen ble påvirket av
ERβ
uttrykk. For å oppnå dette, ble lunger, lever og kontralaterale høyre eggstokk oppsamlet. Omfanget av tumorceller som er tilstede i disse organene ble anslått ved å måle Luc aktivitet i ortotopisk modell. Luciferase-aktivitet ble påvist i lunge, lever og kontralaterale eggstokk fra mus injisert med Ad5-infiserte BG-1-celler, (Fig. 5A). Interessant,
ERβ
uttrykk sterkt redusert tilstedeværelse av tumorceller og potensielt metastaser til alle disse organene, noe som tyder på at ERβ utøver en dobbeltrolle på tumorvekst og spredning. Dette ble bekreftet av
in vitro
sårheling eksperimenter viser at
ERβ
uttrykk reduserer bevegeligheten av BG-1 celler (data ikke vist). Siden ERβ påvirket både tumorvekst og cellespredning, lurte vi på om dette kan gjøre det mulig å forbedre mus overlevelse. Musene ble fulgt opp i 80 dager og daglig sjekket for eventuelle tegn på sykelighet.
ERβ
uttrykk betydelig forsinket død som to måneder etter injeksjon med Adβ-infiserte BG-1 celler, 50% av musene fortsatt overlevde (Fig. 5B). Dette er i sterk kontrast med 100% død av kontrollmusene, noe som skjer i løpet av mindre enn to måneder.
BG-1-Luc celler infisert med Ad5 eller Adβ adenovirus ble injisert i den venstre eggstokk på nakne mus. Luc-aktivitet ble overvåket i 35 dager som beskrevet i fig. 1C. Resultatene er uttrykt i fotoner /s (Ph /s) og representerer en representant eksperiment svarende til gjennomsnittet ± SD av minst 5 dyr per gruppe. Mann-Whitney-testen ble anvendt for sammenligning. * P 0,05 og ** p 0,01. Et representativt bilde av dag 35 er vist. B. Representative bilder av hele dyr og kjønnsorganer av dyr avlives på dag 35 vises.
Nude mus injisert med BG-1-Luc celler i samme forhold som i fig. 4. ble avlivet 28 dager etter injeksjon. Lunge, lever og høyre kontralaterale eggstokk ble tatt og Luc-aktiviteten ble analysert som nevnt ovenfor. Resultatene uttrykkes som fotoner /s /mg protein og representerer gjennomsnittet av 5 dyr ± SEM. Mann-Whitney-testen ble anvendt for sammenligning. * P 0,05 og ** p 0,01. B. Kaplan-Meier overlevelseskurve. 10 mus var orthotopically xenopodet med BG-1-celler som stabilt uttrykker Luc, infisert med Ad5 eller Adβ adenovirus, følges opp daglig for utvikling av åndenød, lem lammelse og vekttap, og avlives umiddelbart hvis bemerket. P-verdi er en oppnådd i log-rank tester.
Diskusjoner
Vi rapporterer her at innføringen av ERβ i eggstokkreft celler viser endogene nivåer av ERα fører til en sterk hemming av
in vivo
vekst og cellespredning, mediert gjennom kontroll av ERα uttrykk og signalering.
in vitro
spredningsforsøk viser en tydelig inhibering av E2-avhengige proliferasjon ved ERβ i ERα-positive eggstokkreft cellelinje BG-1. Dette er den første demonstrasjonen av en anti-proliferativ virkning av ERβ i en ERα-positive ovarian cancer cellelinje. Videre ERβ kan også hemme veksten av ERα-negativ ovarial cancer-cellelinje PEO-14. Disse resultatene er i samsvar med våre tidligere funn oppnådd med ERα-negative cellelinjer fra brystkreft [31] og prostata [30] kreftceller og med en annen studie utført i ERα-negative SKOV3 EOC-avledet cellelinje [36]. I celler blottet for østrogenreseptorer, er det sannsynlig at gjenopprettelse av ERα ikke kan aktivere en stimulering av proliferasjon på E2-behandling, ettersom det utløser et annet program for transkripsjonsregulering, sammenliknet med celler som uttrykker naturlig ERα, som tidligere vist i brystkreftceller [37 ]. Faktisk, observerte vi at endogene ERα nivåer i BG-1-celler ble sterkt redusert ved nærvær av ERβ, mens ERβ påvirkes mindre ERα nivåer i PEO-14-celler. Videre ERβ kunne hemme helt ERα aktivitet i BG-1-celler, men ikke i PEO-14-celler. Dette kan skyldes det faktum at i BG-1-celler, er endogen ERα under kontroll av sin egen promoter, mens det i PEO-14-celler, er eksogent ERα styres av en viral promoter. Videre kan man ikke utelukke at kofaktorer som kreves for ERα og ERβ aktivitet i de to celletypene er forskjellige, som står for deres differensial aktivitet i BG-1 og PEO-14 celler.
Det nye ved vår studie er å ha utvidet disse dataene til to
in vivo
modeller. Hvis kliniske bevis basert på ERβ nivåer i normalt vev og kreft tyder på at denne reseptoren kan fungere som en potensiell tumor suppressor, så langt, ingen preklinisk bevis har blitt brakt til bekrefte denne hypotesen. Vi først brukt en klassisk subkutan modell, for å svare på dette spørsmålet, og mer presist å avgjøre om østrogen var nødvendig eller ikke. BG-1
in vivo
vekst var tydelig avhengig av tilstedeværelse av østradiol og ERβ kunne motvirke tumorvekst. Vi har også brukt ortotopisk implantasjon av bioluminescerende celler i eggstokken. I overensstemmelse med
in vitro
forsøk, ble det observert en sterk reduksjon av tumorvekst når BG-1-celler uttrykker ERβ.
cellesyklusanalyse viste at ERβ hemmet celleproliferasjon, ved å redusere andelen celler i S-fasen og øke andelen av celler i G2-M-fase. Denne situasjon er lik den som er rapportert i brystkreftceller [38]. På molekylært nivå, kan ERβ redusere fosforylering av Akt og Rb. I tillegg ERβ også redusert ekspresjon av cyclin D1 og cyclin A. Cyclin D1 virker sammen med syklin-avhengig kinase-4 og -6, noe som fører til fosforylering av Rb og dissosiasjon fra Rb /E2F-komplekset, noe som fører til at progresjon gjennom G1 [35]. Cyklin A interagerer med syklin-avhengig kinase-2 for å fremme overgangen fra S til G2 fase [39]. Videre fosforyleringen av AKT favoriserer G1 /S overgang ved å blokkere den transkripsjonelle aktivitet av Foxo faktorer som regulerer Cyclin D1 og p21-ekspresjon [40]. Basert på disse funnene, foreslår vi at ERβ fører til en nedgang i AKT fosforylering, som igjen resulterer i en redusert uttrykk for cyclin D1 og fosforylering av Rb.
For å forklare hvordan ERβ kan påvirke cellevekst, har vi undersøkt om det kan direkte endre ERα uttrykk og signaler i BG-1 celler. Det er faktisk interessant å legge merke til at ERβ har også dyptgripende virkninger av ERα nivåer som det redusert med om lag 15 ganger ERα uttrykk i 3 timer. Selv om den eksakte molekylære mekanismer som står for den negative effekten av ERβ på ERα i BG-1 celler er ikke avklart, er omfanget og frekvensen av nedbrytning av ERα absolutt kritisk for sin aktivitet og disse parametrene endres hvis ERβ er til stede eller ikke. Faktisk, i paren BG-1-celler, uttrykker kun ERα, reseptoren er også utsatt for E2-avhengig nedbrytning. Dette er sannsynligvis på grunn av proteasomal degradering av reseptoren som er vist i en rekke celletyper med tidligere studier [41], [42]. Paradoksalt nok er det E2-avhengige proteasomal nedbrytning av ERα også nødvendig for full aktivitet gjennom regulering av interaksjoner av reseptorer med sine coactivators [42] og sykling av ERα på arrangøren av sine mål gener [43]. Situasjonen ser annerledes ut når ERβ er koekspresjon med ERα i BG-1 celler. Faktisk, rapporterer vi at ERβ kunne redusere raskere og sterkere ekspresjon av ERα i BG-1-celler i nærvær av E2, sammenlignet med celler hvor bare ERα er til stede. Dette er i samsvar med det som er observert i ERα-positiv brystkreft cellelinje T47-D transfektert med ERβ [44]. Dette tyder på at ERβ kan utløse en hurtig proteasomal degradering av ERα i nærvær av E2. Hvis vi antar at ERα og ERβ danner heterodimerer som tidligere beskrevet [45], [46], ERβ kan øke degraderingen av ERα til stede i komplekset, ved å endre dens konformasjon og hindre den fra å være aktiv. Følgelig ERα ville være mindre effektiv til å aktivere sine mål gener og kunne ikke spille sin proliferativ rolle.
Ja, i tillegg til dens virkninger på ERα uttrykk, kan vi ikke utelukke at ERβ reduserer også ERα aktivitet, som vist ved transfeksjon av et østrogen-responsive reporter i BG-1-celler. Dette er i samsvar med en tidligere studie utført i en ERα-positiv brystkreft cellelinjer som ERβ ble transfektert, noe som tyder på at ERα og ERβ har forskjellige roller [47]. I sin tur kan dette påvirke den E2-avhengig signalisering av ERα, som ikke kunne regulere nivåene av aktiviteten av viktige mål gener som er involvert i proliferasjon, slik som AKT, Rb, cyklin D1 eller cyclin A2. Videre har andre studier har rapportert en negativ virkning av ERβ på ERα signaliserer [44], [48]. Spesielt har ERβ vist seg å endre rekruttering av AP-1-komplekser til ERα målgener [44], som er kjent for å opptre i synergi med ERα. Når heterodimerized med ERα, kan ERβ også endre evne ERα å samhandle med coactivators. En tidligere studie har også foreslått en Ying Yang virkning av ERβ
in vivo
, som er en repressor av ERα signalering i nærvær av ERα, men kan også erstatte ERα i fravær av ERα [48]. Nedregulering av ekspresjon av ERα ERβ kan ikke være den eneste mekanisme for veksthemming av ERβ, som ERβ kan også redusere cellevekst av ERα-negative PEO-14-celler. Det er mulig at ERβ direkte påvirker faktorer involvert i celle-proliferasjon, så som transkripsjons coregulators, cellesyklus regulatorer, men også vekstfaktorer.
Vi rapporterer at ERβ kan ikke bare redusere veksten av den primære tumor, men kan også redusere omfanget av metastase, eller i det minste tilstedeværelsen av tumorceller i forskjellige organer. Vi har tidligere vist at ERβ kunne hemme
in vitro
kreft celle invasjon [31], som sikkert står for redusert spredning observert. Men vi kan ikke helt utelukke muligheten for at den reduserte veksten av primærtumor også fører til en redusert metastasering. Uansett effekten utøves av ERβ, denne reduksjonen av metastaser sikkert forklarer den økte overlevelsen av mus implantert med ERβ celler.
Til sammen våre funn gi bevis for et scenario der ERβ fungerer som en potensiell tumor-suppressor og representerer et potensielt mål for fremtidige behandlinger av EOC. Så vidt vi vet, er dette den første
in vivo
demonstrasjon av anti-proliferative og -metastatic handlinger ERβ i en preklinisk orthotopic modell av eggstokkreft kreftutvikling. Våre resultater linking ERβ og mestastasis prosessen er helt enige med kliniske studier avslører at ERβ ikke er uttrykt i metastatisk former for eggstokkreft [20] og tapet av sitt uttrykk korrelerer med en kortere total overlevelse [23]. Her har vi videre greie at ERβ direkte innvirkning på ERα uttrykk, cellesyklus og invasive egenskapene til kreftceller. Årsakene regnskap for svake uttrykk for ERβ i eggstokkreft forblir unnvikende. Nyere rapporter tyder på mulige epigenetiske modifikasjoner fører til
ERβ
stanse, som behandling av eggstokkreft celler med DNA metyltransferase eller histondeacetylase hemmere kan gjenopprette sin uttrykk [49], [50], [51]. En annen hypotese ville være en foretrukket degradering av ERβ protein ved proteasomet, noe som resulterer i lave nivåer av denne reseptoren i kreftceller [32]. Dette kan være spor å utforske i fremtiden for å kontrollere ERβ uttrykk og utvikle nye behandlingsformer i eggstokkreft.
Materialer og metoder
Tumor cellelinje
Den menneskelige eggstokkene celle
