Abstract
Androgen reseptor (AR) varianter er assosiert med resistens mot antiandrogen terapi både i menneskelige prostata kreft cellelinjer og klinisk prøver. Disse observasjoner støtter hypotesen om at AR isoform akkumulering er en følge av selektiv terapeutisk trykk på hele lengden AR. PTEN mangel prostatakreft modellen fortsetter med veldefinerte kinetikk inkludert progresjon til kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Mens kirurgisk kastrering og enzalutamide behandlinger gi en initial behandlingsrespons,
PTEN
– /-
epithelia fortsetter å spre givende lokalt invasive primærtumor patologi. Det mest epitelet forblir AR positiv, men ligand uavhengig, antyder nærvær av onkogene AR varianter. For å møte denne hypotesen har vi brukt et panel av nylig beskrevet
PTEN
– /-
tumorcellelinjer avledet fra både fra hormon intakt (E4, E8) og kastrerte PTEN mutanter (CE1, CE2) etterfulgt av RACE PCR for å identifisere og karakterisere tre nye avkortede, aminoterminalen inneholder AR varianter (mAR-Va, b, c). Varianter vises ikke bare bevart gjennom progresjon, men er korrelert med nesten fullstendig tap av full lengde AR (AR-FL) ved kastrering androgen nivåer. Overekspresjon av variantene fører til økt transkripsjonen aktivitet av AR mens slå ned studier viser redusert transkripsjonen utgang. Kollektivt, identifisering av avkortede AR varianter i betingelses PTEN sletting modellen støtter en rolle for å opprettholde CRPC fenotype og gir ytterligere terapeutiske anvendelser av denne preklinisk modell
Citation. Liang M, Adisetiyo H, Liu X, Liu R, Gill P, Roy-Burman P, et al. (2015) Identifisering av androgen reseptor spleisevarianter i PTEN Mangel murine Prostate Cancer Model. PLoS ONE 10 (7): e0131232. doi: 10,1371 /journal.pone.0131232
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 1 april 2015; Godkjent: 29 mai 2015; Publisert: 21.07.2015
Copyright: © 2015 Liang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av NIH bevilgning RO1CA059705 til PR, PCF Young Investigator Award og Icahn School of Medicine kreftforskningsmidler tildelt DJM
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Introduksjon
prostata kreft celler har blitt antatt å utvikle seg til kastrering motstand gjennom et mangfold av androgen reseptor (AR) modifikasjoner. inkludert forsterkning, genet rearrangements eller mutasjoner, endret uttrykk av transkripsjons co-regulatorer og
de novo
steroidogenesis [1-6]. I den senere tid har undersøkelser med humane prostatacancercellelinjer og vev identifiseres nærværet av AR spleisevarianter (AR-Vs) som kan være opp-regulert som respons på kastrering og fremme resistens mot androgen reseptor-rettet terapi [7-9] [10 ] [11]. Androgen receptor tilhører steroid-reseptor-transkripsjonsfaktor familie og er sammensatt av en N-terminal transkripsjonen aktiveringsdomene (NTD, exon1), DNA-bindende domene (DBD, ekson 2 og 3), en hengselsregion (ekson 4), og den C-terminale ligandbindende domene (LBD, ekson 4-8) [12,13]. Hittil opp til 15 forskjellige AR-Vs mangler ulike deler av LBD er rapportert i menneskelige prostata kreft cellelinjer CWR-R1, 22rv1, Vcap og LuCaP xenoimplantater [14-21]. Til tross for dette, AR isoformer forbli vesentlig studerte i prekliniske musemodeller av prostata kreft vev blir begrenset til to AR-Vs som rapporteres ved hjelp av Myc-Cap cellelinje [15]. Til dags dato har ingen AR varianter blitt rapportert fra den primære organ i et preklinisk musemodell for prostatakreft.
PTEN
null musemodell for prostatakreft er dårlig respons på androgen ablasjon terapi inkludert kirurgisk kastrering og androgen reseptor målrettet terapi [22] [23] [24]. Selv om økt PI3K /Akt signalering har vist seg å gi betydelig overlevelses signaler i henhold til kastrerte betingelser forblir de fleste epitel androgen reseptor positiv. Denne observasjonen øker muligheten for at ligand uavhengige former av androgen-reseptoren kan eksistere tilrettelegge for overlevelse og videre progresjon. Vi har tatt en multi-kanter tilnærming for å løse denne hypotesen herunder karakterisering og anvendelse av flere roman, PTEN mangelfulle, murine prostatakreft cellelinjer [25] [26] og tilsvarende primærtumor modell.
Vi har identifisert tre nye varianter av androgen reseptor (kalt mar-Va, b, c). Disse AR varianter alle inneholder AR-NTD med bare en som inneholder en delsekvens overlapping med AR-LBD. Den relative ekspresjon av disse variantene øker ikke bare som reaksjon på kastrering, men i respons til AR-rettet terapi inkludert Casodex og enzalutamide. Bemerkelsesverdig, etter progresjon på lang sikt av kastrering androgennivåer, vi har observert en betydelig reduksjon i full lengde AR men vedlikehold av de identifiserte isoformer. Funksjonelle studier viste at overekspresjon eller slå ned på AR-Va og AR-Vc kunne regulere AR transkripsjonen utgang.
Sammen våre data støtter tilstedeværelsen av nye AR varianter som kan tjene som viktige bidragsytere i utviklingen til CRPC. Variant identifikasjon også øker betydelig nytten av PTEN null prostatakreft modell både i forhold til å forstå funksjonen av AR og som et system for å vurdere behandlingsformer rettet mot resistente former av androgen reseptoren.
Resultater
Identifisering av nye AR varianter i cellelinjer avledet fra PTEN null prostatakreft modell
Som en del av våre studier av androgen reseptor (AR) funksjon og mekanismer for CRPC progresjon, vi nylig preget fire nye muse prostatakreft cellelinjer avledet fra enten hormon intakt (E4, E8) eller kastrert (CE1, CE2)
PTEN
null mutante mus. Cellelinjer ble karakterisert som
PTEN
– /-
, etter å ha aktivert PI3K /Akt alarm og funksjoner av primærtumor modell [25] [26]. For å analysere for tilstedeværelsen av androgenreseptoren (AR) varianter, søkte vi 3 «RACE på cDNA generert fra E8 og CE1 linjer ved hjelp av forover primere forankret i exon1 av muse-AR (S1 tabell). Ved hjelp av denne objektiv tilnærming, forsterket vi AR mRNA med poly (A) haler inkludert de AR-Vs med potensielle nye 3-sekvensene. Etter med nestet PCR, observerte vi flere unike sekvens produkter (fig 1a, S1 fig). Som forventet, den lengste (~ 2 kb) bånd var i full lengde AR (AR-FL), inneholdende sekvenser oppstrøms av den poly (A) region som samsvarer med den 3’UTR av muse-AR (MAR) mRNA. Kloning og sekvensanalyser av de ~ 850 bp PCR produktene indikert at det finnes flere unike mus AR-Vs (MAR-Vs) i E8 og CE1 celler. Vi fokuserte på tre unike transkripsjoner. Først en kort AR isoform funnet i E8 linje, beholdt exoner 1-4 fra Mår mRNA, etterfulgt av et unikt 175 bp-sekvens funnet justeres til AR intron området tilstøtende til ekson 4 som vi betegnet exon 4a (m4a) eller variant AR-Va (fig 1a og 1b). Molekylstrukturen AR-Va er analog til 5′-beholder exoner 1-4, men forskjellige i preparatene ifølge 3»-sekvenser av tidligere beskrevne mus MAR-V4 [15] og human ARV
567es [27]. Deretter ble to nye AR-Vs med potensielt unike alternativ spleising nettsider påvist i CE1 celler. Når kartlegging sine sekvenser til musegenomet, fant vi at 442-bp og 495-bp sekvenser tilpasset intron 1 og skjøtes exon 1, som vi henvist til M1B og M1c varianter. For å unngå eventuelle misforståelser med nomenklatur av antiretrovirale medisiner rapportert i menneskelige prostata kreft modeller, oppkalt vi disse tre roman AR varianter som mus AR-Va, b, c (MAR-Va, b, c), hvorav Mar-Va ble først identifisert i E8, med mAR-Vb og mar-Vc i CE1 (S1 fig). Med de ovennevnte cellelinjer vi bestemt den relative uttrykk nivåer av hver variant. Interessant, Mar-Va uttrykk var høyest i de E4 og E8 linjer mens MAR-Vb og Mar-Vc viste høyere uttrykk i CE1 og CE2 linjer. Alle variantene var betydelig lavere i uttrykket enn AR-FL (S2 figur).
a) Identifisering av MAR varianter (a, b, c) i avledet cellelinjer visualisert ved hjelp av konvensjonell PCR. b) Real time PCR evaluering av AR-varianter forsterket fra E8 celle cDNA visualisert ved gel elektroforese. c, venstre) Påvisning av AR isoformer i mennesker og mus prostata kreft cellelinjer og c, til høyre) densitometry analyse av variant og AR-FL protein uttrykk normalisert p-aktin (*, p 0,05). d) Skjematisk struktur av MAR-varianter (a, b, c) og AR full lengde (AR-FL). Solid-fargede boksene representerer de vanlige eksoner av AR-FL og klekket kassetter indikerer kryptiske eksoner. Fet rette linjer viser til transkriberte sekvenser i sine mRNA. Den antatte aminosyresekvensen oversatt av m4a og M1c er oppført (lavere diagrammer).
Ved hjelp ApE plasmid editor software vi var i stand til å utlede molekylvektene til Mar-Va som ~ 80 kd og mar- Vb, Vc å være ~ 54 og 56 kDa som tilsvarer våre identifiserte transkripsjoner (fig 1d, S2 Table, S3 tabell). For å fastslå om AR-Vs kunne påvises på proteinnivået vi brukte et antistoff rettet mot animo endestasjonen på AR (Santa Cruz, N-20) og undersøkt lysater fra E8, CE1 og kastrerte androgen derivater (E8-CSS, CE1 -CSS). Vurderes sammen med de menneskelige linjer, LNCaP og PC3, vi har oppdaget AR-FL (~ 110 kDa) og tre store band som bor på ~ 75 kD, 85 kD og lavere arter på ~ 50kD og ~ 56 kD (fig 1c, S2 tabell).
androgen ablasjon øker den relative uttrykk for AR varianter
for å støtte en rolle for AR varianter under CRPC videre, vi vurderte effekten av anti-androgen behandling. For å gjøre dette, utfordret vi E8 og CE2 cellelinjer med enten kastrere androgen dyrkningsforhold (trekull-strippet serum, CSS) eller Casodex (10 mm) i 3 dager. Påfallende, i CSS dyrkningsforhold observerte vi økt transkripsjon uttrykk i alle tre varianter med størst ganger økning observert i Mar-Va i E8-celler (mar-Va, 3,5 fold, MAR-VB, 2,5 fold, MAR-Vc 2,2 fold, p 0,05) når normalisert til full lengde AR (fig 2a). Ved hjelp av Casodex, vi også observert en statistisk signifikant forbedring av alle AR-varianter ved hjelp av E8 og CE2 linjer (figur 2b).
a) Kultur for murine prostatakreft (E8) cellelinjer med antiandrogen behandling inkludert kull strippet serum (CSS) (3 dager) eller b) Casodex (10 uM, 3 dager) resulterer i betydelig forbedret ekspresjon av AR-isoformer normalisert til AR full lengde. c) Kirurgisk kastrering av PTEN mutanter (
C
+
; PTEN
L /L
, n = 7) resulterer i en betydelig økning i den relative ekspresjon av AR-isoformer som påvist ved western blotting. d) AR variant avskrift uttrykk fra
Vekt
, hormon intakte og kastrerte muterte musene normalisert til AR-FL nivåer (*, p 0,05; **, p. 0,01)
Vi deretter vurdert om AR isoformer eksistert
in vivo
bruker hormon intakte PTEN-null svulster (
C
+
; PTEN
L /L
; n = 6) og om progresjon på kastrat androgen nivåer kan endre deres uttrykk. Bruke resected fliker av prostata (ventral, rygg lateral, fremre) vurderte vi uttrykk for ARS i hormon intakte mutanter på 2, 13 og 23 måneder og oppdaget tilstedeværelsen av AR-FL (~ 110 kD) og tre store varianter av redusert størrelse på ca 45-50, 64 og 75 kD (figur 2c). Av de 6 mutanter analysert, observerte vi bare én i 13 måneder kohort med redusert AR-FL uttrykk (*, star). Påfallende, i PTEN mutanter som ble kirurgisk kastrert (
C
+
; PTEN
L /L
; n = 7) observerte vi 6/7 å ha betydelig tap av AR-FL, men opprettholdt uttrykk for AR isoformer (fig 2c, høyre). Kvantitativ RNA (q-PCR) måling av Mar-Va, b, og c bekreftet heving av isoformer i hormon intakte og CRPC PTEN mangelfulle kreftformer med hensyn til
Vekt
prostata og normalisert til AR-FL (Fig 2d ) (**, p 0,01). For ytterligere å knytte tilstedeværelsen av avkortede AR-Vs med kastrering motstandsdyktig progresjon, behandlet vi PTEN hormon intakte mutanter (
C
+
; PTEN
L /L
, n = 6) med enzalutamide (10 mg /kg,
via
mus chow
ad libitum
) i 10 uker, etterfulgt av immunhistokjemi hjelp antistoffer mot enten AR aminoenden (AR, N-20) eller AR c-terminus (AR, C-19). I samsvar med biokjemisk analyse, observerte vi svært lav påvisning av full lengde AR men robust farging for amino, som inneholder varianter (S3 fig). Disse observasjonene indikerer at progresjon på kastrat androgen nivåer kan velge mot full lengde AR men ikke AR varianter.
Den transkripsjonen aktivitet av full lengde androgen reseptor forsterkes av AR-varianter
in vivo
analysen antyder at den relative uttrykk for AR isoformer kan vedvare under CRPC og bedt oss om å undersøke virkningene av en relativ økning i ekspresjon av mAR-Vs i PTEN mangel prostatakreft. For å gjøre dette, har vi gjennomført en rekke transkripsjons analyser ved hjelp av PSA-luciferase reporter plasmid [28]. For det første, hver variant og AR-FL var sub klonet inn uttrykk konstruksjoner fulgt av uttrykket validering ved hjelp av western blotting og AR (N-20) antistoff (fig 3a).
a) Western blotting ved hjelp av AR ( N-20) antistoff bekrefter uttrykk av klonede AR varianter i COS-1 celler. b) Overuttrykte AR-varianter i E8 celler behandlet med kontroll, DHT (0,03, 0,3 nM) eller DHT + Casodex (BIC, 1 uM). (Kontroll
vs
Mar-Va = sammenligninger 1-4;.. Kontroll
vs
MAR-Vc = sammenligninger 5-6) (*, p 0,05, **, p 0,01 ). c) Co-immunoutfellinger fra COS-1 celler transfektert med AR-FL og enten AR-Va-myc (midten) eller AR-Vc-myc (til høyre).
Vi fant kontroll E8 celler til være responsive til DHT på en doseavhengig måte (0,03 til 0,3 nM) (fig 3b), mens de CE1 cellene ikke var responsive til DHT med mindre eksogent rotte AR-FL ble innført ved transfeksjon (S4 fig). Vi neste over-uttrykt Marva, b eller c til E8 og CE1 celler og observert at Mar-Va isoform betydelig økt transkripsjonen reporter aktivitet sammenlignet med kontroll plasmid transfections (søylediagram sammenligninger 1-4, *, p 0,05, ** , p 0,01). Interessant, MAR-Vc transfeksjon utvidet reporter nivåer bare i nærvær av androgener (sammenligninger 5-6, *, p 0,05), mens MAR-Vb hadde en statistisk ubetydelig effekt (p 0,05). (Fig 3b)
for å forstå en potensiell mekanisme som mAR-Vs aktivere funksjonen til AR-FL, utførte vi co-immunoutfellinger bestemmelse variant til AR-FL interaksjon. Plasmider som koder myc-merket Mar-Va og Mar-Vc ble generert for denne analysen bygger på funn at disse to antiretrovirale medisiner kan co-aktivere AR-FL i ett eller flere av cellelinjene som ble testet. AR negative, COS-1 celler ble transfektert med rotte AR alene (+ tom vektor) eller i kombinasjon med Mar-Va-myc (Va-myc) eller MAR-Vc-myc (Vc-myc) uttrykk konstruerer fulgt av immunoutfellinger for Mar -Va /Vc proteiner ved hjelp av myc epitop. Western blot analyser ble deretter utført ved å bruke et antistoff som er spesifikt for det C-terminale ende av AR som bare gjenkjenner AR-FL. Vi fant 110 kDa AR-FL band til å være til stede i Va-myc immunpresipitatene indikerer at MAR-Va kunne danne et kompleks med AR-FL. Imidlertid, siden en betydelig AR-FL bånd ikke ble påvist i VC-myc immunopresipitater, vi utledet at stabile kompleks var mindre effektiv eller ikke dannet mellom AR-FL og AR-Vc-en observasjon som er i overensstemmelse med vesentlig redusert AR-Vb og AR-Vc mediert co-aktivering av PSA reporter (fig 3c). Disse data tyder på at økt uttrykk av MAR-Vs kan forbedre stabiliteten av AR-FL dermed styrke androgen avhengige reporter analysen utgang. Disse observasjonene er også lik de som ble oppnådd med humant AR-V5, 6, 7es [27].
Vi deretter vurderes virkningene av varianten hemning på PSA transkripsjonen reporter utgang. For å gjøre dette designet vi dicer substrat sirnas (DsiRNAs) som spesifikt målretter seg mot Mar-Va eller c, men ikke full lengde AR. Ved transfeksjon av disse sirnas til E8 eller CE1-celler sammen med luciferase reporter-plasmidene, ble det observert at knockdown av enten MAR-Va og Vc redusert AR transkripsjonen aktivitet i begge cellelinjer (figur 4a). Variant sirnas var like potent i E8-celler, mens i CE1 celler, knockdown av MAR-Vc ga mest robuste effekt (data ikke vist). Effektiviteten av varianten slå ned er eksemplifisert ved q-PCR måling av MAR-Vc nivåer i kontroll og Mar-Vc-siRNA behandlet E8 celler (figur 4b).
a) E8 celler ble transfektert med sirnas rettet mot enten mAR-Va eller c og evalueres for PSA-Luc reporter aktivitet 48 timer senere (kontroll siRNA
vs
mar-Va siRNA = sammenligninger 1-3,.. kontrollere siRNA
vs
mAR-Vc siRNA = sammenligninger 4-7). b) Validering av siRNA knockdown av MAR-Vc målt ved q-PCR (*, p 0,05, **, p. 0,01)
Disse resultatene indikerer at MAR-Vs bidra til AR transcriptional aktivitet både E8 og CE1 celler og at deres hemming motsetter AR aktivitet. For ytterligere å undersøke hvordan aktiviteten til AR signale kan bli endret i løpet av CRPC, vi målte uttrykk nivåer av AR målet genet,
Fkbp5 product: [29], med to forskjellige
in vivo
manipulasjoner. Først kastrert vi
C
+
; PTEN
L /L
mutanter ved 6 uker og analysert mus ved 30 uker og andre vi slettet epitel AR i PTEN mangelfulle prostata (
C
+
; PTEN
L /L
, Ar
L
/Y
) -en modellen vi tidligere har preget (S5 figur) [30]. I likhet med våre enzalutamide behandlet mutanter (S3 Fig), observerte vi redusert /tap av uttrykk for distal AR målretting antistoff (AR-C19) og vedlikeholdes uttrykk for aminoterminal målretting antistoff (AR-N20). Sammenlignet med hormon intakte (AR +) regioner (S5b figur, øverst til venstre panel, AR + piler), ble FKBP5 uttrykk betydelig redusert i kastrat prøver. Som genetisk validering og kontroll for FKBP5 androgen avhengige modulering, vurdert vi AR og FKBP5 uttrykk i PTEN-null; AR-null regioner av
C
+
; PTEN
L /L
, AR
L
/Y
mutanter observere fullstendig tap av epitel AR (AR- region) og nær tap av FKBP5 protein uttrykk (S5b figur, øverst til venstre, Ar piler). Videre bruker CRPC linjer avledet fra PTEN null mus modell [30], validert vi androgen aktivering av
Fkbp5
ved tilsetning av eksogene androgen (S5c fig). Disse data indikerer at i løpet av kirurgisk eller genetisk induksjon av CRPC i PTEN-null tumorgenesis, er det AR-FKBP5 signale aksen svekket.
diskusjon
Overekspresjon av androgen-reseptorer (ARS) forekommer i en betydelig antall sent stadium prostatakreft inkludert de som går videre til kastrering motstand. Identifiseringen av AR-varianter i humane cellelinjer CRPC og kliniske prøver antyder at AR varianter kan lette forts AR onkogene funksjon tross for tilstedeværelsen av AR målrettet terapi [31]. Dette kan tilskrives det faktum at majoriteten av AR-Vs identifisert hittil er forutsagt å kode for proteiner som mangler LBD men beholder den N-terminale trans domene for derved å virke som konstitutivt aktiv transkripsjonsfaktorer. Dette indikerer at AR LBD er unnværlig for AR transkripsjonen aktivitet og fortsatte bidrag til progresjon av kreft [27] [32] [33]. Som følge av dette er å forstå prosessen som AR varianter oppstår og deres bidrag til fremveksten av CRPC blitt et område med intens undersøkelse.
Homologe systemer av prostatakreft (hormon avhengighet, kastrering motstand og avledede cellelinjer) som oppnås ved bruk av PTEN null-modellen, gir en utmerket plattform for å vurdere sykdoms initiering og progresjon [22]. Vår undersøkelse, for første gang, beskriver den naturlige forekomsten av disse AR ntd varianter i PTEN mangelfull mus prostatakreftceller og den primære organ området. Viktigere, viser vi at det identifiserte AR-Vs er ikke statisk, men endres i uttrykket under CRPC progresjon. De tre mus AR varianter som er identifisert i denne studien er sammensatt av nye molekylære strukturer. MAR-Va, som beholder de tilstøtende exoner 1-4, etterfulgt av gjennomlesning inn i intron 4 og er omtrent analog med den rapportert MAR-V4 [15] og AR
V567es [27] med unntak av den unike aminosyre sekvens kodet av 3′-enden. MAR-Vb og Mar-Vc er sammensatt av to forskjellige områder som ligger innenfor intron 1 skjøtes etter exon 1, som fører til den utledede AR-Vs proteinsekvens som bare inneholder NTD. Den såkalte AR-V8 identifisert i 22rv1 humane prostatakreftceller ser ut som den nærmeste humane motstykke inneholdende AR-NTD, etterfulgt av en lengre 33-aa tail kodet av et exon 3 «ligger innenfor intron 3 [19]. Likheten mellom identifiserte muse varianter og de som tidligere er identifisert i humane cellelinjer, tyder på at mobilnettet stress hormon ablasjon terapi kan fungere i vanlig måte under valget for varianter AR variant populasjoner
Nyere kliniske studier har vist Har-V7 å være forhøyet i CRPC, metastaser, tilknytning til biokjemisk tilbakefall og dårlig klinisk utfall [11] [17] [18] [34]. En av de mest betydningsfulle funn fra studien er evnen til kastrering eller AR målrettet terapi for å velge for mus AR isoformer. Disse dataene ikke bare demonstrere en ekstra mekanisme som
PTEN
mangelprostatakreftceller kan utvikle seg til CRPC men har også sterke implikasjoner for terapi ment å direkte målrette ligandbindende domene av androgen reseptoren. Interessant, mens vi observerte forbedret relativ ekspresjon av mARVs i avledede cellelinjer i kultur, ekspresjon av AR-FL ble opprettholdt som er forskjellig fra det som ble observert i mus primære svulster. Dette kan tilskrives det monoklonale natur av celle utledningen
versus
den svært heterogene natur av primære prøver. Det kan også være forbundet med generelt vedlikehold av cellelinjer i hormon intakte betingelser
versus
de lange kastrering betingelser som anvendes for å opprettholde primære svulster. Den slående observasjon at AR-FL redusert i progresjon på kastrat androgen nivåer eller i nærvær av kronisk enzalutamide eksponering, gir overbevisende støtte som AR-FL er valgt mot og at antiretrovirale medisiner kan lette fortsatt AR funksjon. Tidligere rapporter har vist at
PTEN
null mutanter er dårlig lydhør overfor både kastrering og enzalutamide terapi [23] [35] [24]. Våre data viser den relative økningen av AR-NTD varianter, både
in vitro Hotell og
in vivo
, som er konsistent med en manglende respons til AR målrettet terapi i denne modellen.
Vi har observert kapasitet for mAR-Va, men redusert for mAR-Vb og mar-Vc, for å øke aktiviteten av AR transkripsjons reporter analyser. Dette kan skyldes at MAR-Vb og Vc mangler en DNA-bindingsmotiv. Våre data kan imidlertid ikke utelukke muligheten for varianter som MAR-Vb og Vc å ha onkogene funksjon gjennom alternative mekanismer. Interessant, en ny AR variant av lignende struktur ble identifisert i flere humane prostatacancer-cellelinjer [19]. Den såkalte AR8 mangler også et DNA-bindende domene og dermed som MAR-Vb og Mar-Vc identifisert her, er usannsynlig å fungere som en transkripsjonsfaktor på egen hånd. Snarere AR8 ble vist å assosiere med Src og EGF reseptor og dermed fremme økt fosforylering av AR [19]. Det vil være interessant for fremtidige studier for å adressere om MAR-Vb og Vc er i stand til tilsvarende plasma membran foreninger og potensielle bidrag til CRPC.
AR-V slå ned studier, noe som resulterte i redusert AR transkripsjonen aktivitet , avsløre potensielle terapeutiske anvendelser av variant rettet mot under progresjon til CRPC. Tilstedeværelsen av trunkerte varianter i PTEN mangelfull mus er også i overensstemmelse med den kliniske observasjon opprettholdt AR uttrykk til tross for tilstedeværelsen av potente AR målrettede terapier slik enzalutamide. Men siden Mar-Va, b, og c viste differensialresponser i uttrykket endres til kastrering eller Casodex i våre studier, den eksakte bidraget (e) av individuelle varianter, og deres potensial cooperativity mot CRPC er ikke avklart og trolig avhenge av mobilnettet forbindelse [8]. Fremtidige progresjon studier kan vurdere MAR-V cellulære lokaliseringer, interaksjoner med andre onkogene trasé og påvirkning på
in vivo
progresjon.
Funnene som presenteres her gi bevis for tilstedeværelse av romanen varianter påvises i primær organ system av genmanipulerte PTEN null mus fremhevet av den forbedrede variant uttrykk i løpet av progresjon ved kastrering androgen nivåer. Fremtidige terapeutiske studier kan vurdere om tidlig målretting av disse identifiserte AR isoformer kan hindre eller forsinke progresjon til CRPC. At Mar-Va og Vc hemming førte til redusert AR transkripsjonen funksjon gir begrunnelsen for testing av farmakologiske målretting AR varianter. Gitt våre resultater, er det fristende å spekulere i at innføringen av AR-FL tilbake til visse PTEN mangel CRPC celler som inneholder AR Vs kan gjenopprette slike celler til androgen deprivasjon.
Metoder
Cell kultur og muse prostata prøver
E4, E8, CE1 ce2 [25] [26] og CaP8, P8 [36] cellelinje ble etablert fra den betingede
PTEN
-null musemodell. LNCaP og PC-3 celler ble kjøpt fra ATCC. C4-2B og COS-1 celler var en gave fra Dr. Baruch Frenkel (University of Southern California, LA, California) og Dr. Allen Epstein (University of Southern California, LA, CA), henholdsvis. Derivatene av foreldrecellelinjer ble generert gjennom kultur 10% CSS (Charcoal-strippet Serum, Cellgro) i inntil 18 dager. E8 og CE2-celler ble også behandlet i normale opprettholde media med tilsetning av 10 uM av anti-androgen, bikalutamid (Sigma-Aldrich) i 6 dager. Prostata vev ble samlet inn fra mus med ADCA eller CRPC svulster samt villtype seg på ulike aldersgrupper. Dissekert prostata ble behandlet av rask frysing i flytende nitrogen og lagret i -80 ° C for videre analyse.
Kloning og konstruerer
Totalt cellulære RNA ble isolert fra E8 og CE1 av RNAqueous-4PCR Kit (Life Technologies) som brukes som kilde. Påvisning av muse AR spleisevarianter fra dem ble oppnådd ved GeneRacer kit med Superscript III RT og TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Life-teknologi) som per produsentens protokoller. Kort, ekstraherte RNA var første revers transkribert ved hjelp av GeneRacer oligo (dT) primer og Super III RT modul fra settet. RACE-Ready cDNA ble underkastet 3 «hurtig amplifikasjon av cDNA-PCR-ende (3′ RACE-PCR) ved anvendelse av en frem-gen-spesifikke primer (GSP) og omvendt GeneRacer 3»-primer fra GeneRacer modulen. En annen runde av nestet PCR ble utført for ytterligere forsterkning ved hjelp av en fremover GSP nestet primer og revers GeneRacer 3 «Nøstet primer i settet. SuperTaq Plus Polymerase (Life-teknologi) ble brukt for både 3’RACE og nestet PCR. Forward GSP og nestede primere forankret innenfor exon1 (S1 tabell) for predikerte varianter (S2 Table) ved hjelp variant spesifikke RACE primere (S3 Table). 3 «RACE og nestet PCR produktene ble deretter undersøkt ved standard TA sub kloning og sekvensering ved hjelp av TOPO TA Cloning Module. ApE plasmid Editor ble brukt i denne studien å analysere sekvense resultater, spår proteinsekvenser og generere tekst kart for mARVs (S3 Table)
Plasmid konstruerer brukt i denne studien inkluderte. Rat AR full lengde (Dr. Robert Matusik, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee), human AR full lengde (Dr. Jeremy Jones, City of Hope, Duarte, California), og PSA-luciferase reporter og pcDNA3.1-myc (Dr. Parkash Gill, University of Southern California, LA, California). pCR4-TOPO ble kjøpt i TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Life Technologies).
CDS (kodesekvenser) for Marva, Vb og Vc ble forsterket av PCR fra cDNA av E8 og CE1 å bruke primer sett omsluttende hele den åpne leseramme (ORF), og sub-klonet inn i pcDNA3.1-myc-HISC. For å generere de Arva-myc og ARVc-myc konstruksjoner, reverse primere ble re-designet for å være forankret oppstrøms av sine egne stoppkodoner og in-innrammet med ORF uttrykk vektor. Hifi AccuStart Taq DNA-polymerase (Quanta Biosciences) og HotStar Taq DNA-polymerase (Qiagen) ble anvendt i PCR-kloning. Sekvenser av primer brukes til å klone Va, Vb, Vc, Va-myc og Vc-myc ble levert i S4 tabell.
PCR og kvantitativ real-time PCR
Totalt cellulære RNA ble ekstrahert fra alle foreldre og andre derivat cellelinjer og deretter revers transkribert ved hjelp av oligo (dT) primer og Super III First-Strand Synthesis (Life-teknologi). RNA prøver som brukes for forskjellige analyser ble isolert fra celler med forskjellige partier. Konvensjonell PCR ble utført på cDNA-er ved hjelp av den samme fremover primer forankret inne exon1 forbundet med revers primer spesifikk for MAR-Va, b, c og AR-FL, henholdsvis (tabell S5). Kvantitativ real-time PCR og dataanalyse er blitt beskrevet tidligere. De sanntid primersett utformet spesielt og utelukkende for å forsterke hver ARV og AR-FL ble oppført i S6 tabell.
Transfeksjon og luciferase reporter analysen
1-2 dager før transfeksjon, celler ble plassert i medier inneholdende trekull-strippet serum (CSS). For alle transfections, ble bassenger av celler transfektert hjelp Lipofectamine Plus (Invitrogen) med tom vektor kontroll plasmid, full-lengde AR plasmid, eller AR spleise variant plasmider sammen med androgen-responsive konstruksjoner MMTV-ildflue luciferase eller PSA-ildflue luciferase [28 ] og androgen-insensitive Renilla luciferase kontroll PRL-SV40 (Promega). Tom vektorkontroll plasmid ble brukt til å ekvilibrere total DNA i alle transfeksjoner. Den følgende dag ble cellene sådd ut i fire eksemplarer med legemidler i 96 brønners plater. 24 timer senere luciferasepreparater aktiviteter ble kvantifisert (Dual luciferase assay kit, Promega) på en plate-leser (Tecan) og firefly signal normalisert til Renilla signal å kontrollere for celle nummer.
Co-Immunpresipitasjon analysen
COS celler ble transfektert med Marva-myc eller mARVc-myc sammen med Rat AR-FL hjelp Lipofectamine 2000 (Life-teknologi) som per produksjon protokoll. Om 48 timer.
