Abstract
Forhøyet uttrykk og aktivitet av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) /protein kinase B (Akt) signalveien er assosiert med utvikling, progresjon og behandling motstand på hode og hals kreft (HNC). Flere studier har vist at mikroRNA-7 (MIR-7) regulerer EGFR-ekspresjon og Akt-aktivitet i en rekke typer cancerceller via sin spesifikk interaksjon med EGFR mRNA 3′-utranslatert region (3′-UTR). I denne studien fant vi at Mir-7 regulert EGFR uttrykk og Akt aktivitet i HNC cellelinjer, og at dette var forbundet med redusert vekst
in vitro Hotell og
in vivo
av celler ( HN5) som var følsomme for EGFR-tyrosinkinase-inhibitor (TKI) erlotinib (Tarceva). MIR-7 handlet synergi med erlotinib å hemme veksten av erlotinib-resistente Fadu celler, en effekt assosiert med økt hemming av Akt aktivitet. Microarray analyse av HN5 og Fadu cellelinjer transfektert med MIR-7 identifisert et felles sett av downregulated MIR-7 mål gener, og gir innsikt i tumor suppressor funksjon av MIR-7. Videre identifiserte vi flere mål Mir-7 mRNA med en antatt rolle i sensibilisering av Fadu celler til erlotinib. Sammen utgjør disse dataene støtter koordinere regulering av Akt signalisering av MIR-7 i HNC celler og foreslå det terapeutiske potensialet i MIR-7 alene eller i kombinasjon med EGFR TKI i denne sykdommen
Citation. Kalinowski FC, Giles KM, Candy PA, Ali A, Ganda C, Epis MR, et al. (2012) Regulering av epidermal vekstfaktor reseptor signalisering og Erlotinib følsomhet i hode og nakke kreft celler av MIR-7. PLoS ONE 7 (10): e47067. doi: 10,1371 /journal.pone.0047067
Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA
mottatt: May 30, 2012; Godkjent: 07.09.2012; Publisert: 24 oktober 2012
Copyright: © 2012 Kalinowski et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Health and Medical Research Council of Australia og Medical Research Kommersialisering Fund of Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode- og halskreft (HNC) er den sjette vanligste kreftformen, med ca 600 000 nye tilfeller globalt per år [1]. Til tross for fremskritt innen behandlingsmetoder, prognosen for mange HNC pasienter som presenterer med avansert eller metastatisk sykdom er fortsatt dårlig [2]. Epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), et medlem av ErbB-reseptor-tyrosinkinase (RTK) familien, blir overuttrykt i mer enn 80% av alle HNCs og er en uavhengig prediktor for dårlig resultat [3]. EGFR-signale aktiverer et nettverk av nedstrøms reaksjonsveier, inkludert den fosfoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt [4], [5] og Ras /Raf /ERK1 /2 [6], [7] veier, som fremmer tumorcelleformering, invasjon, metastase, angiogenese og apoptose motstand. Følgelig har EGFR dukket opp som en viktig terapeutisk mål i HNC.
Cetuximab er et monoklonalt antistoff (mAb) rettet mot EGFR som bedret overlevelse av HNC pasienter behandlet i kombinasjon med strålebehandling eller cellegift [8], [ ,,,0],9]. Lite molekyl TKI, slik som gefitinib og erlotinib, har også blitt evaluert i avansert HNC og har hatt noen klinisk anti-tumor effekt i en liten undergruppe av pasienter [10], [11]. Kliniske studier i HNC evaluerer kombinasjonen av EGFR-hemmere med andre terapeutiske tilnærminger har også igangsatt, samt studier som undersøker ny generasjon anti-EGFR midler, som for eksempel anti-EGFR mAb panitumumab og dual EGFR /HER2 TKI lapatinib [12] . De fattige klinisk respons av HNC til anti-EGFR terapi er på grunn av den iboende og ervervet resistens av HNC celler til disse midlene, som er tenkt å skje via flere mekanismer, inkludert mutasjoner i EGFR og nedstrøms effektorer som aktiverer signal (f.eks. Tap av PTEN, PI3K mutasjon eller overekspresjon), kompenserende signale via andre RTK (f.eks. andre ErbB familiemedlemmer, insulin-like growth factor 1 reseptor (IGF1R), eller c-Met), og overgangen fra en epitelial til mesenchymale fenotype ( EMT) [12], [13], [14]. Derfor er nye tilnærminger kreves for å effektivt hemme nedstrøms onkogene signalveier som aktiveres i en EGFR-uavhengig måte i EGFR-hemmer bestandig HNC.
microRNAs (mirnas) er korte, endogene, ikke-kodende RNA som binde seg til det 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av spesifikke mål-mRNA for å undertrykke genekspresjon, enten via induserende translatorisk undertrykkelse eller karakter degradering [15]. mirnas kan regulere mange gen mål, ofte på en koordinert måte innen et mobil gangsti eller nettverk [16], og ved å gjøre det de kontrollerer ulike cellulære prosesser, herunder utvikling, differensiering, apoptose og cellesyklusprogresjon [17]. Avvik miRNA uttrykket er et kjennetegn på mange kreftformer, inkludert HNC, og disse mirnas kan fungere som tumor suppressors eller onkogener [18]. For eksempel, er la-7d ekspresjon redusert i mange HNCs, forårsaker forhøyet RAS uttrykk, økt tumorvekst og redusert pasientoverlevelse [19]. I kontrast er MIR-184 uttrykk oppregulert med tunge plateepitelkarsinom, som fører til økt uttrykk av
c-myc
onkogen, økt celledeling og tumorvekst [20]. Nyere rapporter tyder på at mirnas kan ha nytte som nye kreftbehandling eller diagnostiske /prognostiske biomarkører [18], [21], [22].
Vi og andre har vist at Mir-7 hemmer EGFR uttrykk og nedstrøms Akt og ERK1 /2-aktivitet i lunge, bryst, prostata cancer og glioblastom [23], [24], som fører til redusert celleproliferasjon og overlevelse. Reguleringen av EGFR uttrykk innebærer direkte, spesifikk interaksjon av MIR-7 med to MIR-7 målområder innen EGFR mRNA 3′-UTR. Videre MIR-7 regulerer uttrykket av andre molekyler nedstrøms av EGFR i et koordinatsystem mote, inkludert RAF1, IRS1, IRS2, PAK1 [23], [24], [25], som støtter en tumor suppressor funksjon for MIR-7 i disse og andre kreftformer. I denne studien undersøkte vi funksjonen til MIR-7 på EGFR signalisering og vekst i HNC
in vitro Hotell og
in vivo
, med fokus på cellelinjer som er følsomme eller resistente mot EGFR TKI erlotinib. Vi antok at Mir-7 ville hemme EGFR uttrykk og nedstrøms signalering, og evaluert synergien mellom erlotinib og MIR-7 i erlotinib-resistente HNC celler. Til slutt utførte vi microarray analyser av to HNC cellelinjer for å identifisere nye MIR-7 mål som ville belyser de molekylære mekanismene bak sin tumor suppressor handling i HNC. Våre funn har bred implikasjoner for behandling av HNC med EGFR-målrettet behandling og bruk av MIR-7 som en roman anti-HNC terapeutiske.
Resultater
Differensial følsomheten HNC cellelinjer til EGFR inhibitor erlotinib
for å etablere den relative sensitiviteten av HN5, Fadu, og SCC-25 HNC celler til EGFR-hemmer erlotinib, utførte vi celle titer analyser av celler behandlet med et bredt spekter av konsentrasjoner (fig. 1 ). Mens HN5 celler var svært følsomme for erlotinib (EF
50 = 0,6 mm), Fadu celler var resistente mot stoffet (EF
50 = 8,3 mm). SCC-25-celler viste mellomliggende følsomhet overfor erlotinib (EF
50 = 3,8 uM) HN5 celler er blitt rapportert å overuttrykke EGFR via en genamplifikasjon [26], og være meget følsomme for inhibering av EGFR
in vitro
og
in vivo product: [27]. Fadu og SCC-25-celler utviser moderat EGFR-ekspresjon og har blitt vist å utvise resistens mot EGFR-inhibitor gefitinib [28]. Våre resultater er konsistente med disse rapportene, hvor Fadu celler er ~ 10 ganger mer motstandsdyktig mot erlotinib enn HN5 celler. Til sammen HN5 celler er representative for EGFR-hemmer-sensitive HNC, Fadu celler representerer HNC som er motstandsdyktig mot EGFR hemming, og SCC-25 celler representerer HNC med mellom EGFR-hemmer motstand. Dermed kan vi undersøke tumor suppressor aktivitet av MIR-7 i hver av disse innstillingene.
HN5 (rød), Fadu (blå) og SCC-25 (grønn) celler ble sådd i 96-brønners plater og behandlet med EGFR-inhibitor erlotinib (sluttkonsentrasjon 0-100 uM). Den halve maksimale effektive konsentrasjon (EC
50) av erlotinib ble bestemt for hver cellelinje etter måling av det relative antallet levedyktige celler ved celle titer assay 3 d etter tilsetning av erlotinib. Dataene er normalisert til laveste konsentrasjon av erlotinib. Feilfelt representerer standardavvik. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
MIR-7 Regulerer EGFR Expression og Akt aktivitet i HNC cellelinjer
Tidligere har vi og andre identifisert EGFR mRNA 3′-UTR som et bestemt mål av MIR-7 i flere forskjellige kreftcellelinjer, og viste at MIR-7 er en potent inhibitor av EGFR-signalisering og cellelevedyktigheten [23], [24]. Interessant, MIR-7 svekket EGFR-signalering i EGFR-hemmer bestandig U87MG (glioblastom) og A549 (ikke-småcellet lungekreft) celler [23], [24]. Gitt den viktige rollen av EGFR-signalisering i HNC tumorgenese og behandling, undersøkte vi kapasiteten MIR-7 for å inhibere EGFR-ekspresjon og nedstrøms signalisering i HNC cellelinjer. Vi transfektert HN5, Fadu og SCC-25 cellelinjer med MIR-7 eller en negativ kontroll miRNA, MIR-NC, og utført western blotting for å fastslå effekten av MIR-7 på EGFR uttrykk og Akt aktivitet. MIR-7 hemmet EGFR-ekspresjon og aktivitet (P-EGFR), så vel som aktiviteten til Akt (P-Akt), en nøkkel nedstrøms effecter av EGFR (fig. 2A). Reduksjonen i Akt-aktivitet forårsaket av MIR-7 var assosiert med en økning i den relative nivåer av total Akt (fig. 2A), en effekt som muligens skyldes en tilbakekoplingsmekanisme kontrollerende Akt ekspresjon i hode- og halskreft celler. Vi observerte ikke hemming av ERK1 /2 signalisering i hode og nakke kreft cellelinjer av MIR-7 (data ikke vist). Revers transkriptase kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) analyse av HNC-celler transfektert med MIR-7 vist redusert EGFR mRNA ekspresjon (HN5-celler, figur 2B;. Fadu celler, data ikke vist), en finne i overensstemmelse med våre tidligere studier med mir -7 i glioblastom, lunge, bryst og prostata kreft celler [24]. Reduksjonen i EGFR mRNA av MIR-7 er også støttet av en fersk rapport tyder på at de fleste mirnas undertrykke genekspresjon ved å fremme mRNA råte [29]. Til slutt fikk vi bekreftet det direkte hemming av EGFR uttrykk ved MIR-7 via sin virkning på EGFR 3′-UTR hjelp reporter gen-analyser i HNC celler. Co-transfeksjon av HNC celler med MIR-7 og en ildflue luciferase reporter konstruksjon inneholdende full lengde EGFR mRNA 3′-UTR ga betydelig lavere reporter aktivitet enn med MIR-NC (Fadu celler, Fig 2C,. HN5 celler, data ikke vist ), som bekrefter at MIR-7 samhandler med spesifikke EGFR 3′-UTR målse [24] i HNC celler. Tatt sammen indikerer disse resultater at MIR-7 inhiberer EGFR mRNA og protein ekspresjon og nedstrøms signalisering i det minste delvis via direkte målretting av EGFR mRNA 3′-UTR.
(A) Western blotting-analyse av EGFR, P-EGFR, Akt og P-Akt nivåer i HN5 (venstre panel) og Fadu (midtparti) og SCC-25 (høyre panel) celler tre dager etter transfeksjon med MIR-7 eller MIR-NC forløper molekyler eller kjøretøy (LF2000) bare. β-aktin er inkludert som en lasting kontroll. (B) RT-qPCR analyse av EGFR mRNA uttrykk i HN5 cellene 24 timer etter transfeksjon med MIR-7 eller MIR-NC forløper molekyler. Data ble normalisert til GAPDH mRNA-ekspresjon og uttrykt i forhold til MIR-NC-transfekterte celler. (C) Luciferase reporter analysen med Fadu celler ko-transfektert med MIR-7 eller MIR-NC forløper molekyler, en ildflue luciferase helaftens EGFR mRNA 3′-UTR reporter plasmid, og en
Renilla
luciferase reporter plasmid . Firefly luciferase aktivitet ble målt 24 timer etter transfeksjon, normalisert til
Renilla
luciferasepreparater målinger og data ble uttrykt i forhold til kjøretøy (LF2000) bare-transfekterte celler. Feilfelt representerer standardavvik. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. *, P. 0,001, MIR-7 vs Mir-NC
MIR-7 hemmer veksten av Erlotinib følsomme HN5 Cells
in vitro Hotell og
in vivo
HN5 HNC celler er svært sensitive for erlotinib og dermed representere en utmerket modell for å vurdere den funksjonelle betydningen av EGFR hemming av MIR-7
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi undersøkte effekten av MIR-7 på erlotinib sensitive HN5 celler ved å måle cellenes levedyktighet med celle titer analyser 5 d etter transient transfeksjon av MIR-7. Sammenlignet med kjøretøy (LF2000) og MIR-NC, MIR-7 betydelig redusert HN5 cellevekst (Fig. 3A og fig. 3B).
(A) Colorimetric celle titer analyse av HN5 celler 5 d etter transfeksjon i 96-brønners plater med MIR-7 eller MIR-NC forløpermolekyler, eller bærer (LF2000) bare. (B) Grafisk fremstilling av celle titer assay fra (A). Data representerer det relative antallet levedyktige celler HN5 normalisert til LF2000-behandlede HN5 celler. (C) TaqMan RT-qPCR analyse av MIR-7 uttrykk i HN5 kloner med stabil uttrykk for MIR-7 (klone 39) eller MIR-NC (klone 2). Data ble normalisert til U44 snRNA uttrykk og uttrykt i forhold til HN5 MIR-NC klone 2. (D) Western blotting-analyse av EGFR, Akt og P-Akt nivåer i HN5 kloner med stabil uttrykk for MIR-7 (klone 39) eller speil NC (klon 2). β-aktin er inkludert som en lasting kontroll. (E) Manuell celle telling av HN5 celler med stabil uttrykk for MIR-7 (klone 39) eller MIR-NC (klone 2). Data blir uttrykt i forhold til MIR-NC. (F) Clonogenicity analyse av HN5 celler med stabil uttrykk for MIR-7 (klone 39) eller MIR-NC (klone 2) 10 d etter celler ble sådd i 10 cm retter. Feilfelt representerer standardavvik. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,01, MIR-7 vs Mir-NC; **, P 0,005, MIR-7 vs Mir-NC
For å vurdere effekten av MIR-7 på HN5 tumorvekst
in vivo
, brukte vi lentiviral levering til. generere HN5 celler med stabil overekspresjon av MIR-7 eller MIR-NC. Ved hjelp av TaqMan miRNA RT-qPCR vi observerte ~80 fold oppregulering av MIR-7 i HN5 celler med stabil MIR-7 uttrykk (HN5 stabil klone 39), sammenlignet med HN5 celler med stabil MIR-NC uttrykk (HN5 stabil klone 2) (fig . 3C). Analyse av EGFR uttrykk og signalering av western blotting viste en beskjeden reduksjon (~15%;
se Metoder 2,7
) i EGFR proteinnivået i HNC med MIR-7 stabil uttrykk (Fig 3D.), Men et større ( ~ 25%) reduksjon i nivåene av Akt fosforylert ved serin-473 (P-Akt). Vi skjermet flere HN5 /MIR-7 kloner og observert MIR-7 overekspresjon og lignende nivåer av EGFR og P-Akt i hver klon (fig. S1). Samlet utgjør disse funnene tyder på at nedgangen i Akt aktivitet mediert av MIR-7 er ikke bare på grunn av hemming av EGFR uttrykk og i stedet er trolig et resultat av et koordinatsystem reduksjon i uttrykk og aktivitet av flere molekyler som er ansvarlige for Akt aktivitet.
for å finne ut om stabil MIR-7 uttrykk hemmer HN5 vekst
in vitro
, utførte vi manuell celle telling av MIR-NC HN5 stabil klone 2 celler og MIR-7 HN5 stabil klone 39 celler. Disse eksperimentene viste en signifikant reduksjon i proliferasjon av MIR-7-stabile HN5-celler sammenlignet med MIR-NC stabile HN5-celler (fig. 3E). For å bekrefte dette funnet, vurdert vi clonogenicity av våre HN5 stabile cellelinjer. Stabil ekspresjon av MIR-7 betydelig redusert antall og størrelse av kolonier dannet etter 10 d sammenlignet med HN5 celler med stabil MIR-NC uttrykket (fig. 3F). Sammen utgjør disse resultatene er i samsvar med de vi oppnådd med forbigående MIR-7 transfeksjon og indikerer at ~80 ganger økning i MIR-7 uttrykk i HN5 MIR-7 stabile klone 39 fører til redusert Akt aktivitet og reduserer
i vitro
vekst av HN5 HNC celler.
neste søkt å undersøke effekten av stabil MIR-7 uttrykk på
in vivo
vekst av HN5 tumorxenotransplantater i nakne mus. Etter subkutan injeksjon av MIR-7 HN5 stabil klone 39 eller MIR-NC HN5 stabil klone 2 celler i flanken av kvinnelige nakne mus, ble tumorvolumer overvåkes i løpet av en 29 dagers periode. En betydelig reduksjon av tumorvekst ble observert for HN5 xenografter med stabil MIR-7 ekspresjon sammenlignet med MIR-NC stabile HN5 xenografter (fig. 4A og 4B fig.). Vi brukte TaqMan miRNA QRT-PCR analyse av MIR-7 nivåer for å bekrefte at MIR-7 overekspresjon vedvarte i HN5 /MIR-7 xenografter for varigheten av vår studie (fig. 4C), og vi har også observert en reduksjon i P- Akt nivåer i HN5 /MIR-7 klone 39 xenografter sammenlignet med HN5 /MIR-NC klone 2 xenografter av western blotting (fig. 4D og 4E fig.). Dette er den første demonstrasjon av at MIR-7 kan redusere HNC tumorvekst
in vivo
, og er i overensstemmelse med andre nylige studier som viser at MIR-7 reduserer veksten av leverkreft, lungekreft og schwannom transplantater i mus [ ,,,0],30], [31], [32]. For å bekrefte vår oppdagelse og for å utelukke muligheten for en klonal effekt, utførte vi en tumordannelse analyse hvor HN5 celler ble transient transfektert i kultur med MIR-7 eller MIR-NC, og etter 24 timer, injisert subkutant i flanken til hunn naken mus og svulstdannelse vurderes. Analyse av tumorvolumer på 10 d viste en signifikant hemning av tumordannelse hos mus injisert med HN5-celler transient transfektert med MIR-7 (HN5 /MIR-7), sammenlignet med mus injisert med bærer-behandlede eller MIR-NC-transfekterte HN5 cellene (HN5 /MIR-NC) (fig. S2). Disse data understøtter vår observasjon at stabil MIR-7 ekspresjon hemmer veksten av HN5 tumorxenografter (fig. 4A og 4B fig.) Og den hypotese at mir-7 er en potent inhibitor av EGFR-signalisering, Akt-aktivitet, og tumorgenisitet i HNC.
(A) HN5 svulst xenograft vekst etter subkutan injeksjon av stabil HN5 MIR-NC klone 2 (rød) eller MIR-7 klone 39 (blå) celler i nakne mus. Gjennomsnittlig tumorvolum (mm
3) er plottet over tid (d). (B) Representative bilder av tumorxenotransplantater for celler med stabil MIR-NC uttrykk (klone to, til venstre) og stabil MIR-7 uttrykk (klon 39, til høyre). (C) TaqMan RT-qPCR analyse av MIR-7 uttrykk i HN5 /MIR-7 og HN5 /MIR-NC stabil tumorxenotransplantater på eksperimentell endepunkt. Data ble normalisert til U44 snRNA uttrykk og MIR-7 nivåer er vist i forhold til HN5 /MIR-NC klone 2 svulster. (D) Western blotting analyse av Akt og P-Akt nivåer mellom HN5 /MIR-7 og HN5 /MIR-NC stabil tumorxenotransplantater. β-aktin og Akt inngår som lasting kontroller. (E) Densitometry analyse av P-Akt nivåer mellom HN5 /MIR-7 (klone 39) og HN5 /MIR-NC (klone 2) tumorxenotransplantater av western blotting. P-Akt nivåer ble normalisert til total Akt uttrykk. Feilfelt representerer standardavvik. *, P 8,0 × 10
-5, MIR-7 vs Mir-NC; **, P 1,0 × 10
-8, MIR-7 vs Mir-NC; ***, P = 0,06, MIR-7 vs MIR-NC.
Syngergistic Handling av MIR-7 og Erlotinib i Fadu og SCC-25 HNC Cells
in vitro
MIR-7 kan inhibere EGFR-ekspresjon, så vel som aktiviteten til Akt, vi en hypotese at det kan øke effekten av anti-EGFR-terapeutika med HNC-celler; det vil si, kan kombinasjonen av MIR-7 og erlotinib synergistisk hemme veksten av HNC celler. For å undersøke dette, benyttet vi Fadu celler som er resistente overfor erlotinib (EF
50 = 8,3 uM; ~ 10 ganger høyere enn HN5 celler). Fadu celler ble transient transfektert med MIR-7, MIR-NC, eller kjøretøy bare, og behandlet på tre d etter transfeksjon med en sub-EC
50 og klinisk relevant [33] dose (7,5 mm) av erlotinib ( eller bærer). Etter ytterligere 4 d, ble cellenes levedyktighet bestemt ved celle titer analysen (fig. 5A). MIR-7 alene (uten erlotinib) og erlotinib alene (kjøretøy bare; LF2000) hver produsert en liten, men statistisk signifikant hemming av Fadu cellevekst. Imidlertid er kombinasjonen av MIR-7 og erlotinib produsert en enda større reduksjon i cellevekst, en virkning som ble bestemt ved Bliss additivism modellen [34] for å være synergistisk, hvor E
Bliss = E
MIR-7 + E
erlotinib-E
MIR-7 × E
erlotinib = 0,15 + 0,18 til 0,15 x 0,18 = 0,30, og den eksperimentelt observerte brøk hemming (E
observert) med MIR-7 pluss erlotinib var 0,61. Vi har også observert synergi mellom MIR-7 og erlotinib i SCC-25 HNC celler (fig. S3), der E
Bliss = E
MIR-7 + E
erlotinib-E
MIR-7 × E
erlotinib = 0,61 + 0,35 til 0,6 × 0,35 = 0,75, og den eksperimentelt observerte brøk hemming (E
observert) med MIR-7 pluss erlotinib var 0,84.
(A) Cell titer analyse av Fadu celler som ble transfektert med bare bærer (LF2000), MIR-7, eller MIR-NC i 3 dager, og deretter behandlet med erlotinib (7,5 pM) eller bærer (DMSO) i ytterligere 4 d. Data blir uttrykt i forhold til kjøretøy-transfektert, behandlede Fadu celler (LF2000 minus erlotinib første spalte). (B) Western blotting-analyse av EGFR, P-EGFR, Akt og P-Akt nivåer i Fadu celler som ble transfektert med bare kjøretøy (LF2000), eller MIR-7 eller MIR-NC for 3 d og deretter behandlet ± erlotinib (7,5 uM) i 24 timer. β-aktin er inkludert som en lasting kontroll. (C) Densitometry analyse av P-Akt nivåer fra Western-blotting mellom Fadu celler transfektert med MIR-NC eller MIR-7 og deretter behandlet med erlotinib (7,5 pM) i 24 timer. Dataene er vist i forhold til MIR-NC-transfekterte celler. Feilfelt representerer standardavvik. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05, MIR-7 minus erlotinib vs Mir-NC minus erlotinib, og LF2000 pluss erlotinib vs LF2000 minus erlotinib; **, P 0,01, MIR-7 pluss erlotinib vs Mir-NC pluss erlotinib. † indikerer synergi mellom MIR-7 og erlotinib som definert av Bliss additivism modell [34].
I parallelle studier, vi brukte western blotting for å vurdere effekten av MIR-7, erlotinib, og kombinasjonen av MIR-7 og erlotinib på EGFR-ekspresjon /aktivitet, og aktiviteten av Akt i Fadu celler (fig. 5B). Vi observerte hemming av EGFR fosforylering (P-EGFR) med både erlotinib og MIR-7, mens MIR-7 også redusert basal EGFR uttrykk. Viktigere, kombinasjonen av MIR-7 og erlotinib produsert en større reduksjon i P-EGFR-ekspresjon enn det som ble observert med enten erlotinib eller MIR-7 alene, og densitometri bekreftet at P-Akt nivåene var lavere med en kombinasjon av MIR-7 og erlotinib enn med MIR-NC og erlotinib (
se Metoder 2,7
fig. 5C). Samlet utgjør disse dataene indikerer at kombinasjonen av MIR-7 og erlotinib jobber sammen i HNC celler, samtidig hemme EGFR uttrykk og aktivitet, Akt aktivitet, og cellevekst.
Mikromatrise Analyse av MIR-7-regulert gener i HN5 og Fadu HNC Cells
for å få ytterligere innsikt i virkningsmekanismen til MIR-7 i både HN5 og Fadu celler, utførte vi microarray analyser i parallell av total RNA isolert fra HN5 og Fadu celler som var transfektert med MIR-7 eller MIR-NC. Vi har valgt å høste RNA for microarray analyse på 24 timer etter transfeksjon med miRNA, for å maksimere spesifisitet og sensitivitet, basert på vår erfaring med MIR-7 transfeksjon av A549 celler [24] og en rapport tyder på at nedregulering av indirekte MIR-124 mål mRNA i HepG2 leverkreftceller startet ved ~32 timer etter transfeksjon [35]. Når dataene normalisering, tenkte vi at direkte MIR-7 målgener i HN5 og Fadu celler ville bli betydelig nedregulert etter MIR-7 transfeksjon. Vi har justert disse genet lister ved å tildele en cut off for nedregulering av minst -1,5 fold og med en betydning av p 0,05 (Fig. 6A), og utført cluster analyse av de resulterende gener som ble signifikant nedregulert av MIR-7 i forhold til MIR-NC i HN5 eller Fadu celler (fig. 6B). Dette avslørte overlapping i genene nedregulert av MIR-7 mellom de to cellelinjene. Ett hundre og sytti ni mRNA ble signifikant nedregulert av MIR-7 i HN5 celler (tabell S1), ble 357 mRNA signifikant nedregulert i Fadu celler ved MIR-7 (tabell S2), og 103 mRNA ble ofte nedregulert i både HN5 og Fadu celler (tabell S3). En Venn-diagram består av Mir-7 downregulated gener for hver cellelinje (Fig. 6C) fremhever i skjæringspunktet mellom MIR-7 downregulated mRNA mellom HN5 og Fadu celler, noe som representerer en MIR-syv mål signatur i HNC celler. Spredningsplott analyse indikerte en sterk korrelasjon (R
2 = 0,435, p 0,001) mellom fold-reduksjon i uttrykket av de 103 genene som svar på MIR-7 mellom HN5 og Fadu celler (Fig 6D.). Vi har også brukt RT-qPCR analyse for å bekrefte nedregulering av RAF1 og transformerende vekstfaktor alfa (TGFa) mRNA av MIR-7 i vår microarray analyser av både HN5 og Fadu celler (Fig. S4). Disse observasjonene tyder på MIR-7 har kapasitet til å målrette EGFR, nedstrøms stier og også en EGFR ligand, slik som TGFa.
(A) Volcano tomter representerer array-sonder mellom HN5 (til venstre) og Fadu (høyre ) celler 24 timer etter transfeksjon med MIR-7 eller MIR-NC forløper molekyler. Tildeling av en avskåret på ± 1,5 ganger endring (MIR-7 vs MIR-NC) og p 0,05, signifikant nedregulert sonder er i grønne og betydelig oppregulert prober er i rødt. (B) Cluster analyse av MIR-7-downregulated gener i HN5 og Fadu cellene, der grønn og rød skygge tilsvarer downregulated og oppregulert gener, henholdsvis. (C) Venn-diagram av MIR-7-downregulated gener i HN5 og Fadu celler. (D) Scatter tomt på MIR-7-downregulated gener felles for HN5 og Fadu celler (R
2 = 0,435, p 0,001).
For å validere vår tilnærming til å kombinere speil 7 downregulated gensettene for HN5 og Fadu celler for å identifisere felles mål mRNA, brukte vi Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) for å vurdere hvor stor andel av gener som var betydelig nedregulert av MIR-7 og var moderat eller høy tillit spådd, eller bevist, MIR -7 mål. IPA identifisert 91/179 (54%) downregulated HN5 mRNA som blir spådd eller bevist MIR-7 mål, 113/357 (32%) downregulated Fadu mRNA som blir spådd eller bevist MIR-7 mål og 57/103 (55%) downregulated mRNA er felles for begge HN5 og Fadu celler som mulige eller faktiske Mir-7 mål, understreker berikelse av den kombinerte MIR-7 downregulated genet satt med antatte eller validerte MIR-7 mål mRNA og foreslå at det representerer en MIR-syv mål signatur i HNC celler.
for å identifisere den funksjonelle betydningen av MIR-syv mål genet som er vanlig for HN5 og Fadu celler, brukte vi IPA å tilordne funksjoner til 103 gener som ble nedregulert av MIR-7 i både cellelinjer. En undergruppe av de 103 genene – hvorav mer enn halvparten ble spådd eller validerte MIR-7 mål – var assosiert med funksjoner som representerer et bredt spekter av prosessene som er involvert i tumorvekst og progresjon, blant annet «celledeling», «celle utvikling», «tumorgenese», «proteinsyntesen», «angiogenese», «celledøden», «cellesyklus», og «cellen bevegelse» (fig. 7). Dette funnet understreker kapasitet på MIR-7 til co-ordinately regulere flere onkogene prosesser i kreftceller.
MIR-7-downregulated gener som er felles for både HN5 og Fadu celler (103) ble tildelt kommentert kreft-assosiert prosesser ved hjelp av IPA programvare. Disse inkluderte «cellesyklus», «celle bevegelse», «celleproliferasjon», «celle utvikling», «tumorgenese», «proteinsyntesen», «angiogenese» og «celledød». Offisielle genet symboler brukes for hver MIR-7-downregulated genet og en blå sirkel indikerer at et gen er en spådd eller validert mål på MIR-7 av IPA analyse.
For å få ytterligere innsikt i funksjon av MIR-7 som en regulator av EGFR-signalering og Akt aktivitet – med kapasitet til å bevisstgjøre HNC celler til erlotinib – vi brukte IPA å tildele gruppen av gener nedregulert av MIR-7 i HN5 celler og Fadu celler til den kanoniske «PI3K /Akt signal «bane (fig. 8). Mens PIK3CD, PAK1, IKK og NF-kB ble nedregulert av MIR-7 i HN5 men ikke Fadu celler, de fleste av MIR-7 downregulated gener assosiert med PI3K /Akt veien ble redusert i både HN5 og Fadu celler, noe som tyder på at de representere en definitiv MIR-syv mål signatur forbundet med PI3K /Akt signaliserer nedstrøms av EGFR. Vi hypotese at synergien mellom MIR-7 og erlotinib er i det minste delvis på grunn av en MIR-7-mediert nedregulering av flere molekyler assosiert med Akt-aktivitet i HNC-celler.
Skjematisk fremstilling av molekyler i EGFR /Akt signalveien som er hemmet av MIR-7 i HNC. IPA programmet ble brukt til å kartlegge vanlige MIR-7-downregulated gener (vist i grønt) i Fadu og HN5 celler på den kanoniske PI3K /Akt veien. Tettheten av skyggelegging representerer fold-endring nedregulering av et gen av MIR-7. Blå sirkler indikerer at et gen er en spådd eller validert mål på MIR-7 av IPA analyse. Flere gener som hører til PI3K /Akt bane som ble nedregulert av MIR-7 i HN5 celler bare er skyggelagt i lyseblått.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at MIR-7 regulerer EGFR uttrykk og nedstrøms signalisering i HN5 og Fadu HNC cellelinjer som har forskjellig sensitivitet til EGFR TKI erlotinib. Vi fant ut at Mir-7 hemmer vekst av erlotinib-sensitive HN5 celler
in vitro Hotell og
in vivo
, og at MIR-7 kan bevisst erlotinib-resistente Fadu celler til erlotinib. Microarray analyse av MIR-7-transfektert HN5 og Fadu celler identifisert et felles mål gen signatur for MIR-7, som gir innsikt i sin tumor suppressor aktivitet i sammenheng med flere kreft-assosiert funksjoner, slik som celleproliferasjon og cellebevegelse. Endelig, analyse av våre microarray data antydet at Mir-7 sensitizes EGFR-hemmer resistente HNC celler som erlotinib ved koordinert regulere uttrykket av flere molekyler i forbindelse med aktiviteten til Akt, en kritisk nedstrøms effektor av EGFR og en voksende terapeutisk mål i kreft.
en viktig funn i vår studie er at MIR-7 har kapasitet til å bevisstgjøre erlotinib-resistente HNC celler til erlotinib, med kombinasjonen av erlotinib og MIR-7 viser en synergistisk nedgang i celleproliferasjon i forhold til erlotinib eller speil 7 alene. Denne observasjonen er viktig ettersom motstanden i HNC til EGFR-inhibitorer er vanlig og et større klinisk problem [12]. Våre data også bygger på en fersk rapport fra Rai og medarbeidere der levering av MIR-7 til EGFR-hemmer bestandig lungekreftceller trykt vekst
in vitro Hotell og
in vivo
, en Feilfelt representerer standardavvik. Feilfelt representerer standardavvik. Feilfelt representerer standardavvik.
