Abstract
Mål
Kronisk fibrosing leverskade er en viktig risikofaktor for hepatocarcinogenesis i mennesker. Mus med målrettet sletting av Mdr2 (murine ortolog av MDR3) utvikle kronisk fibrosing leverskade. Leverkreft (HCC) kommer spontant i slike mus ved 50-60 ukers alder, noe som gir en modell av fibrose-assosiert hepatocarcinogenesis. Vi brukte Mdr2
– /- mus for å undersøke hypotesen om at aktivering av pinnsvin (Hh) signalveien fremmer utvikling av både leverfibrose og HCC
Metoder
Leverskade og fibrose. , Hh sti aktivisering, og lever stamceller populasjoner ble sammenlignet i Mdr2
– /- mus og alderstilpassede villtype kontroller. En dose funn eksperiment med Hh signaliserer antagonist GDC-0449 ble utført for å optimalisere Hh sti hemming. Musene ble deretter behandlet med GDC-0449 eller kjøretøy i 9 dager, og effekter på leverfibrose og tumorbelastning ble vurdert ved immunhistokjemi, QRT-PCR, Western blot, og magnetic resonance imaging.
Resultater
I motsetning til kontroller, Mdr2
– /- mus konsekvent uttrykt Hh ligander og gradvis opparbeidet Hh-responsive lever myofibroblasts og stamfedre med alderen. Behandling av alderen Mdr2-mangelfull mus med GDC-0449 betydelig hemmet lever Hh aktivitet, redusert lever myofibroblasts og stamceller, redusert leverfibrose, fremmet regresjon av intrahepatisk HCCs, og redusert antall metastatisk HCC uten å øke dødeligheten.
Konklusjoner
Hh pathway aktivering fremmer leverfibrose og hepatocarcinogenesis, og hemme Hh signale trygt reverserer begge prosessene selv når fibrose og HCC er avanserte
Citation. Philips GM, Chan IS, Swiderska M , Schroder VT, Guy C, Karaca GF, et al. (2011) Hedgehog Signa Antagonist Fremmer Regresjon av både leverfibrose og leverkreft i en murine modell av primær leverkreft. PLoS ONE 6 (9): e23943. doi: 10,1371 /journal.pone.0023943
Redaktør: Pranela Rameshwar, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 13 juni 2011; Godkjent: 27 juli 2011; Publisert: 02.09.2011
Copyright: © 2011 Philips et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet, delvis ved National Institutes of Health (NIH) RO1 DK077794, NIH RO1 AA010154, NIH T32 DK007568 og NIH T32 CA071341. En del av bilde ble utført ved Duke Senter for In Vivo Mikros, støttet, delvis ved National Center for Forskning Resources National Biomedical Research Center (P41 RR005959) og National Cancer Institute Small Animal Imaging Resource Program (U24 CA092656). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en snikende kreft som utgjør opptil 1 million dødsfall i året, og er den tredje største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Skrumplever, en konsekvens av progressiv leverskade og fibrose, er den største risikofaktoren for HCC [2]. En endret sårtilheling respons på kronisk leverskade, med resulterende feilregulert aktivering av myofibroblasts og stamcellepopulasjoner, har vært innblandet i skrumplever patogenesen og eventuell kreftutvikling [3].
Loss-of-funksjon mutasjoner i hepatocytter canalicular fosfolipid flippase MDR3 (ABCB4) har vært forbundet med et bredt spekter av menneskelige og gallesykdommer inkludert progressiv familiær intrahepatisk kolestase type 3 (PFIC3), kolestase av svangerskapet, legemiddelindusert kolestase og en voksen biliær cirrhose med funksjoner som ligner på primær skleroserende kolangitt (PSC) [4], [5], [6], [7]. Mus med en målrettet delesjon av Mdr2 (murin ortolog av MDR3) mangler den leverspesifikke P-glykoprotein som transporterer fosfatidylcholin (PC) over canalicular membranen. Fraværet av fosfolipider i galle resulterer i progressiv skleroserende kolangitt med tilhørende portal betennelse, ductular spredning og portal fibrose. Leverskade manifesterer kort tid etter fødselen og hepatocellulært karsinom oppstår spontant mellom 50 til 60 ukers alder [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. I motsetning xenograft modeller som er mye brukt til å undersøke mekanismer av- og behandlinger for- HCC, Mdr2
– /- mus gi en modell som paralleller den naturlige utviklingen av HCC på en bakgrunn av kronisk betennelse, leverskade og fibrose [15] .
Gene uttrykk analyser i Mdr2-mangelfull mus og heterozygote kontroller har vist robust og vedvarende induksjon av flere adaptive mekanismene som styrer cellulære responser knyttet til oksidativt stress, inflammasjon, lipidmetabolismen, og spredning, spørre spekulasjoner om at disse prosessene bidra til hepatocarcinogenesis [16]. Selv om ikke formelt vurdert av tidligere studier av Mdr2-mangelfull mus, en annen sti som kan spille en rolle i fibrose-assosiert hepatocarcinogenesis er Hedgehog (Hh), fordi Hh signale har vært innblandet i begge fibrogenic reparasjon av leverskade og HCC.
Hh veien er en evolusjonært konservert signalveien som aktiveres når Hh ligander (Sonic pinnsvin og indisk pinnsvin) binder seg til Lappet (PTC), et trans reseptor som er uttrykt på overflaten av Hh-responsive celler. Ved ligand binding, er Ptc inaktivert, lindrende sin undertrykkelse av glattet (Smo), en trans-membran protein som medierer Hh signale inne i cellen. Smo aktivering kulminerer i den kjernefysiske lokalisering av Gli-familien transkripsjonsfaktorer, Gli1, Gli2, og Gli3, som i sin tur regulerer nedstrøms genuttrykk. Den veien er hvile i normal lever [17], [18], men blir reaktivert som en reparasjonsmekanismen i kronisk leverskade [19], [20], [21], [22], [23]. Hh ligander fremme vekst og levedyktighet av myofibroblasts, akkumulering av noe som fører til unormal lever reparasjon, fibrose og cirrhose eventuell [24], [25]. Hh ligander også tjene som levedyktighet og proliferative faktorer for lever epiteliale progenitorer, og utvidelse av dette kammeret har vært knyttet til dannelse og opprettholdelse av hepatocellulært karsinom [26]. Muligheten for at Hh pathway aktivering bidrar til hepatocarcinogenesis er støttet av det faktum at Sonic hedgehog (Shh) ligand ekspresjon blir registrert hos omtrent 60% av humane HCCs, og ekspresjon av de Hh-regulerte gener, Gli1 og Ptc, forekommer hos 50% av humane tumorer [27], [28], [29], [30].
Basert på disse observasjonene, postulerte at vi Hh pathway aktivering bidrar til patogenesen av både leverfibrose og fibrose-assosierte HCC. For å teste denne hypotesen, behandlet vi i alderen Mdr2-mangelfull mus med Hh pathway inhibitor, GDC-0449, en liten molekyl inhibitor som binder seg til glattet (SMO). Dette middel ble valgt på grunn av dens human sikkerhetsprofil i fase 1-forsøk, så vel som dens effektivitet i organ tumorer som basalcellekreft (BCC) og medulloblastom [31], [32], [33]. Vårt mål var å bestemme hvorvidt mus med fremskreden leversykdom og HCCs ville tolerere Hh sti hemming og erfaring forbedringer i leverfibrose og /eller tumorbelastning.
Metoder
Mus
Mdr2
– /- mus var en gave fra Dr. Detlef Schuppan (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA). Alder matchet FVB /NJ villtype mus ble oppnådd fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alle mus ble plassert sammen med en 12-timers lys-mørke-cyklus og gitt vann og standard Chow
ad libitum
. På aldre, 2, 4, 12, 36 52 og 62-uker, ble musene avlivet under narkose. Levervekt og kroppsvekt ble registrert, serum og levervev ble samlet. Dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité som styres av National Institute of Health «Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr», Duke University Animal Welfare Assurance Antall A3195-01.
Serum AST /ALT besluttsomhet
Serum aspartataminotransferase (ASAT) og alaninaminotransferase (ALAT) ble målt ved hjelp av kits kommersielt tilgjengelige fra Biotron Diagnostics (66-D og 68-D henholdsvis Hemet, CA) i henhold til produsentens instruksjoner .
Western blot
Totalt protein ble hentet fra snap frosset hele levervev i RIPA buffer. Prøvene ble samlet etter alder (2-4 prøver per aldersgruppe), unntatt som angitt. Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet. Membraner ble analysert med følgende primære antistoffer: Sonic pinnsvinet (sc-9024, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), indisk pinnsvin (ab39634; Abcam), β-aktin (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), Gli2 (18 -732-292462, Genway, San Diego, California). Alle antistoffer ble fortynnet 1:1000 og ble inkubert ved 4 ° C over natten. Western blot bildene ble anskaffet ved hjelp av en FluorChem HD2 digitalt mørkerom system (Cell biovitenskap, Santa Clara, California).
Immunohistochemistry
4 mikrometer formalinfiksert, ble parafininnstøpte prøvene avvokset og vannes ut. For å evaluere vevsarkitektur, ble lysbilder farget med hematoxylin og eosin (H E) og Sirius rød per standard protokoll. For immunhistokjemi, ble objektglass inkubert i 3% hydrogenperoksid /metanol. Antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming i 10 mM natriumcitratbuffer eller 0,25% pepsin (K19; Invitrogen, Carlsbad, CA) i 10 minutter. Snittene ble blokkert (Dako Envision, Carpinteria, CA) og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C: glioblastom-2 (Gli-2; 18-732-292462, 1:2000, Genway, San Diego, CA); cytokeratin 19 (Troma-III, hybrid Bank, Iowa City, IA, 1:500); α-fetoprotein (AFP) (Dako, 1:1000); Indian pinnsvin (Abcam; 1:750, Cambridge, MA); Polymer-HRP anti-kanin (K4003, Dako) eller anti-mus (K40011, Dako) eller MACH3 mus AP polymer kit (MP530, Biocare Medical, Concord, California, USA) ble brukt som sekundære antistoffer. 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) Substrat kromogen System (K3466, Dako) og /eller Ferangi Blå (Biocare) ble ansatt i registreringsprosedyre. Utelatelse av primære antistoffer fra reaksjonene eliminert flekker som viste farging spesifisitet. Bilder ble ervervet på en Olympus IX71 (Tokyo, Japan) invertert mikroskop bruker DP2-BSW (Olympus) image oppkjøpet programvaresystem.
Kvantitativ Real-Time Reverse Transcription PCR
RNA ble isolert fra hele leveren, så vel som fra resekterte tumorprøvene hadde standard TRIzol ekstraksjon som er blitt tidligere beskrevet [24]. En tabell med primere har vært inkludert i de supplerende materialer.
morfometri
formalinfiksert lever og tumorsnitt ble farget for CD44 og osteopontin som beskrevet ovenfor, og ble kvantifisert ved morfometrisk analyse med MetaView programvare (Universal Imaging, Downington, PA). Et minimum av fem tilfeldig utvalgte 10 × eller 20 × felt /seksjon ble vurdert for hver mus.
Kvantitativ Immunhistokjemisk analyse
formalinfiksert lever og tumorsnitt ble costained for Gli2 og CK19. Minimum 5 ductular regioner, 20 × felt per avsnitt, ble evaluert for hver mus ved å telle antall celler co-merket.
Lever hydroxyproline analysen
hydroksyprolininnhold i hele leverprøver ble kvantifisert kolorimetrisk som tidligere rapportert [34]
GDC-0449 behandling
i den innledende dose finne kohort av dyr, 16 Mdr2
-. /- mus (alder 57- 68 uker) ble tildelt behandling med bærerkontroll (DMSO, n = 5), 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), eller 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6). Mann-kvinne forhold ble balansert mellom gruppene. GDC-0449 (Selleck Chemicals, Houston, Texas) ble nylig konstituert daglig i DMSO. Alle mus ble gitt en daglig intraperitoneal injeksjon i 9 dager. På dag 10 ble dyrene avlivet. Prøver ble oppsamlet som ovenfor. En andre kohort av 20 Mdr2
– /- mus (alder 51-59 uker gamle) ble utsatt for hele kroppen magnetisk resonansavbildning for å vurdere tumorbelastning og deretter par av mus med sammenlignbare tumorbelastninger ble tildelt til behandling med enten DMSO (kontroll, n = 10) eller 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10). Legemidler ble levert, som beskrevet ovenfor; MR-røntgen ble gjentatt etter 9
th dags behandling; Musene ble ofret for obduksjon og vev innhøsting
Patologi
H . E og sirius røde flekker av leversnitt ble evaluert av en bord-sertifisert patolog. Representative deler av svulsten og ikke-svulstvev ble undersøkt. Svulstvev ble definert som grovt synlige knuter som var minst 10 mm i størrelse og resectable.
Abdominal magnetic resonance imaging
Dyr ble tildelt en blendende kode, som ble opprettholdt under magnetisk resonans (MR ) datainnsamling og analyse. MR-avbildning muselever ble utført på en Bruker Biospec 70/30 7T horisontal boring-system (Billerica, Massachusetts). Dyrene ble lett bedøvet etter isofluorane med kontinuerlig overvåkning og vedlikehold av fysiologiske parametre hele bildebehandling økten (-60 min for hvert dyr). Aksiale og koronale 2D T2-vektet rask spin ekko bilder (TURBO-RARE, TE /TR = 11/4200 ms med 1 mm skive tykk, matrix = 256 × 256 og FOV på 2,4 cm x 2,4 cm, 5 gjennomsnitt, 0,0 mm interslice gap) bilder ble først innhentet for screening formål og supplerende anatomisk informasjon. For rettet svulst volumetrisk analyse, 64 sammenhengende 500 um tykke proton tetthet bilder 3D FSE forutinntatt mot T1 vekting (TURBO-RARE, TE /TR = 9/1500 ms, matrix = 256 × 256 × 64 og FOV 2,2 cm x 2,2 cm x 2,2 cm, ble 25 minutter varighet) ervervet. Alle bildesekvenser ble utført ved hjelp av luft gating.
ble utført volumetrisk analyse fra MR-datasett i Osirix programvare, åpen kildekode bildebehandlingsprogram utviklet og vedlikeholdt av Pixmeo (Genève, SUI). Leversvulster ble manuelt segmentert i hvert dyr ved et bord-sertifisert radiolog (blindet for behandling) etter behandling. Utvalgte områder ble anmeldt for konsistens på koronale og sagittal representasjoner, og kryss-korrelert med aksiale 2D FSE bilder. For volumetri, ble to separate volummålinger oppnådd for hver lesjon, med gjennomsnittlig volum deretter tatt. Pålitelighet mellom (kappa-verdi) var = 0,97. T1 og T2-vektede sekvenser ble utført.
Statistiske analyser
Resultatene uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Betydning etablert ved hjelp av t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant når p 0,05
Resultater
Progressive opphopning av Hh-responsive celler i Mdr2
– /- mus
Ulike former for akutt og kronisk. leverskade indusere lever uttrykk for Hh ligander og aktivering av Hh responsive celler. Serumnivåer av ASAT og ALAT var gjennomgående høyere i Mdr2
– /- mus enn alders matchet kontroller (Figur S1), bekrefter at knockout-mus hadde kronisk leverskade. Derfor undersøkte vi lever fra Mdr2
– /- mus for Hh pathway aktivering. Sammenlignet med leveren proteinlysatene fra villtype kontroller lysatene fra Mdr2
– /- mus viste en økning i Sonic pinnsvin (Shh) og indisk pinnsvin (Ihh) av Western blot analyse. Dette var tydelig ved det første tidspunkt undersøkes (2 uker etter fødsel) og opprettholdes gjennom hele levetiden av dyrene (opp til 64 uker gamle) (figur 1A). Immunhistokjemi for Hh-regulerte transkripsjonsfaktor, Gli2, viste progressiv, aldersrelatert akkumulering av celler med atom Gli2 farging i Mdr2
– /- mus. Slike Gli2-positive celler inkludert stromaceller, så vel som hepatocytic og ductular celler (figur 1B-C). Sammen tyder disse data på at Hh-veien aktiveres i kronisk skadet leveren hos Mdr2-manglende mus, noe som resulterer i progressiv utvidelse av forskjellige Hh-responderende cellepopulasjoner.
A. Western blot analyse for Sonic Hedgehog (SHH) og indisk Hedgehog (IHH) i hele lever ekstrakter samlet fra ung Mdr2
– /- mus (2-16 uker gamle), gamle (36-64 uker gamle) Mdr2
– /- mus og alder-matchet kontroller (n = 3-5 mus /gruppe /tidspunkt). En representant Western blot viser resultater fra unge mus er vist. Gjennomsnitt ± SEM data fra eldre mus fremstilles grafisk. B. Representant leversnitt farget for å demonstrere Gli2 fra ung (4 wk gamle), middelaldrende (36 wk gamle) og gamle (52 wk gamle) Mdr2
– /- mus. Lille Gli2 uttrykk ble notert i villtype mus i alle aldre, så resultatene fra en representant 36 wk gamle villtype mus er vist. (10 ×) C. Kvantitative Gli2 immunhistokjemiske data. Antallet atom Gli2 (+) celler ble talt i minst 5 høy effekt felt (HPF) per leveren delen i Mdr2
– /- mus og villtype kontroller på 4, 36 og 64 ukers alder (n = 3 -4 mus /gruppe /tidspunkt) og gjennomsnitt ± SEM fremstilles grafisk. * P 0,05, ** p 0,01 i Mdr2
– /- grupper vs. respektive kontroller
Behandling av Mdr2
– /- mus med glattes inhibitor, GDC-. 0449, er trygg og reduserer Hedgehog sti signaliserer
for å finne riktig dose av GDC-0449, en pilotstudie ble gjort med 16 aldrende (57-68 uker gamle) Mdr2
– /- mus. Dyrene ble gitt en daglig intraperitoneal injeksjon av 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6) eller DMSO bærerkontroll (n = 5) i 9 dager og deretter avlivet. Det var ingen statistisk forskjell i dødelighet mellom kontroll og høy dose (40 mg /kg) GDC-0449 grupper. På offer, lever /kroppsvektforhold av mus i de tre gruppene var også lik, noe som tyder på at en relativt kort løpet av systemisk behandling med GDC-0449 ved 40 mg /kg er godt tolerert av mus med fremskreden leversykdom og HCC (Tall S2A -B). Western blot analyse av leverlysatene fra denne kohorten av dyr viste at GDC-0449 behandling forårsaket en reduksjon i Shh ligand nivåer ved høyere dose, og Gli2 uttrykk demping i begge doser (Figur S2C).
Hedgehog signale hemming med GDC-0449 opphever virkningen av Hh signale på mål genuttrykk
Basert på data innhentet i vår dosefinnende studie, en andre kohort av Mdr2
– /- mus (51-59 ukers alder ) ble tildelt behandling med vehikkel (DMSO, n = 10) eller 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10) via daglig ip injeksjon i 9 dager. Total overlevelse mellom de to gruppene i andre kullet var like, med noen dødsfall i DMSO behandlingsgruppen og en død i GDC-0449 behandlingsgruppe sekundært til iatrogen skade. Både leveren parenchyma og tumorer i behandlede mus viste redusert ekspresjon av Hh pathway target Gli2 (figurene 2A-B). Sanntids-PCR-analyse av resekterte tumorer viste at GDC-0449 behandling utgitt de inhiberende virkninger av Hh signalering på PPARã, forårsaker en betydelig økning i genekspresjon (figur 2C). Behandling med GDC-0449 også forårsaket en signifikant reduksjon i ekspresjon av Gli1, en annen Hh mål-gen (figur 2D).
A. Leversnitt farget for Gli2 fra representative DMSO og GDC-0449- behandlede mus (40 ×). Kvantitative Gli2 immunhistokjemi data i ikke-tumor lever av mus behandlet med DMSO eller GDC-0449 (n = 9-10 /gruppe) fremstilles grafisk som gjennomsnitt ± SEM (
** p. 0,01
antall ductular celler med Gli2 positiv farging ble telt i hver portal veier /delen under 40 × forstørrelse. B. Tumor seksjoner fra de samme musene ble også farget å demonstrere Gli2. Resultater fra representative DMSO og GDC-0449-behandlede mus vises. Kvantitativ Gli2 immunhistokjemi data ble samlet inn ved å telle atom Gli2 positiv ductular og hepatocytic celler i tumorsnitt enn 40 × forstørrelse Resultatene fremstilles grafisk som gjennomsnitt ± SEM Gli2-positive celler /40 × høy effekt felt (** p 0,01). C-D Quantitative revers transkripsjons-PCR (QRT-PCR) analyse av hele leveren RNA fra DMSO (åpen bar) og GDC-0449 (sort strek) behandlet mus. C. PPAR-γ, et gen som normalt trykt av Hh signale. D. Gli1 ., et gen som er indusert av Hh signale Mean ± SEM fremstilles grafisk (** p 0,01)
Hedgehog signale hemming med GDC-0449 reduserer leverfibrose
Mdr2
– /- mus viste progressive aldersrelaterte økninger i lever uttrykk for alfa-glatt muskulatur aktin (α-SMA), en markør for myofibroblastic leverstel celler (figur 3A, topp panel). Dette ble fulgt av forsterket ekspresjon av pro-fibrogenic faktorer, slik som transformerende vekstfaktor TGF-β og blodplate-avledet vekstfaktor PDGF-β (fig S3A-B), og progressiv fibrose, som vist ved Sirius rød farging (figur 3A, bunn panel) og kvantifisering av den hepatiske hydroksyprolininnhold (figur 3B). Behandling med GDC-0449 redusert a-SMA-uttrykke myofibroblastic celler, lever uttrykk for TGF-β og PDGF-β, Sirius røde flekker, og hydroksyprolin innhold, viser at Hh pathway hemming redusert leverfibrose (Tall 3C-D og Tall S3C- D).
A. Immunhistokjemisk farging for α-SMA (top panel) og Sirius rød (nedre panel) i deler av ikke-svulst leveren fra representative alders matchet Mdr2
– /- og villtype mus (10 ×). B. Felles Lever hydroksyprolininnhold av 2-
52 wk gamle
villtype (WT) og alders matchet Mdr2
– /- mus (n = 3-5 /gruppe). Resultater i Mdr2
– /- mus ble normalisert til at av alderstilpassede WT mus og tegnes som ganger endring. Data er vist som gjennomsnitt +/- SD (* p 0,05) C. Ikke-tumor leversnitt farget for α-SMA (toppanelet, 20 ×) og Sirius rød (nederst panel, 10 ×) i representative DMSO og GDC – behandlet Mdr2
– /- mus. D. Heptic hydroxyproline innhold av DMSO og GDC- behandlet mus (n = 9 /gruppe). Resultater i GDC-0449-behandlede mus ble normalisert til at av DMSO kjøretøy-behandlede mus og tegnes som ganger endring. Data er vist som middelverdi +/- SEM (* p 0,05)
Hedgehog signale hemming med GDC-0449 reduserer opphopning av leverstamceller
Som svar til skade, stamfar. populasjoner i leveren sprer. Derfor immunhistokjemisk analyse for progenitor-markører, slik som cytokeratin-19 (CK-19) og α-fetoprotein (AFP), viste aldersrelaterte økninger i Mdr2
– /- mus (figur 4A). Co-farging for CK19 og Gli2 bekreftet at stamfar befolkningen var Hh responsive (figur 4B). Ved behandling med GDC-0449, progenitor markører redusert (figur 4C), som indikerer at Hh signalering er nødvendig for å opprettholde progenitor populasjoner under tumorgenese, og det Hh inhibering var tilstrekkelig til å forminske størrelsen av forløperceller populasjoner selv i mus med fremskreden HCC.
A. Immunhistokjemisk farging av lever seksjoner fra representative, alder-matchet Mdr2
– /- og villtype mus for progenitor markører, cytokeratin-19 (CK-19) (toppfeltene) og a -fetoprotein (AFP) (bunnpaneler) (20 ×). B. Representant mikrograf av en portal triaden i leveren av en Mdr2
– /- mus, viser samlokalisering av CK-19 (blå) og Gli2 (brun) i ductular rommet (40 ×). C. Kvantitativ Gli2 og CK19 immunhistokjemi i DMSO og GDC-0449-behandlet Mdr2
– /- mus (n = 9-10 /gruppe). Antallet Gli2 og CK19 dobbel-positive ductular-vises celler ble talt inn i kreftsvulster underkant av 20 × forstørrelse. Gjennomsnitt ± SEM doble (+) celler t per høy effekt felt (HPF) fremstilles grafisk (* p 0,05) D. QRT-PCR analyse av AFP i tumor RNA fra mus behandlet med DMSO (åpen bar) eller GDC-0449 (stengt bar) Resultater i GDC-0449-behandlede mus ble normalisert til at av mus behandlet med DMSO kjøretøy og grafer som gjennomsnitt ± SEM (* p. 0,05)
Avtagende Hedgehog signale reduserer uttrykk for osteopontin og hindrer ansamling av osteopontin-responsive (CD44-positive) celler
stem /stamcellepopulasjoner for mange typer kreft, inkludert HCC, antas å bli beriket med celler som uttrykker CD44, en reseptor for stammen cellevekstfaktor, osteopontin [35], [36]. Osteopontin uttrykk er regulert av Hh signale [37]. Derfor undersøkte vi effekten av GDC-0449 på osteopontin og dens reseptor, CD44. Immunhistokjemi og kvantitativ morfometri vist at hemming av Hh vei med GDC-0449 betydelig redusert osteopontin flekker innen primærleversvulster (figur 5A). Lignende behandlingsrelaterte fall i CD44 + tumorceller ble også registrert (Figur 5B). Genuttrykk analyse viste at uttrykk for både osteopontin og CD44 mRNA også en tendens til reduksjon i GDC-0449-behandlede mus (figur 5C). Sammen tyder disse resultater på at Hh signale kan regulere putative leverkreft stilk /stamceller ved modulering av tilgjengeligheten av osteopontin.
A. Tumor seksjoner fra representant DMSO og GDC-0449 behandlet Mdr2
– /- mus ble farget for å demonstrere osteopontin (OPN) Representative deler vises (
Høyre panel
). OPN farging ble kvantifisert ved morfometrisk analyse på minst 5 HPF per tumor delen ved å bruke 20 x forstørrelse (n = 5 mus /gruppe). Resultater i GDC-0449-behandlede gruppen ble normalisert til den av gruppen behandlet med DMSO kjøretøy og tegnes som ganger endring. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM (** p 0,01). B. Immunhistokjemisk farging for osteopontin reseptoren, CD44, i peri-tumorvevet representant DMSO og GDC-0449- behandlet Mdr2
– /- mus. (
Høyre panel
) CD44 farging ble kvantifisert ved morfometrisk analyse som beskrevet i A. Resultater i GDC-0449-behandlede mus ble normalisert til de av kjøretøy-behandlede kontroller og tegnes som Mean ± SEM (** p 0,01). C. QRT-PCR analyse av levertumor RNA fra DMSO (åpen bar) og GDC-0449- (lukket bar) behandlet Mdr2
– /- mus for OPN (til venstre) og CD44 (til høyre). Etter normalisering til resultater i DMSO-behandlede gruppen, Mean ± SEM ble fremstilt grafisk (* p 0,05)
MR og histologiske tegn på levertumor involution følgende GDC-0449 behandling
for å vurdere den potensielle effekten av endringer i matrise og stamceller på HCC, ble pre- og postbehandlingstumorvolum analysert ved hjelp av magnetisk resonanstomografi (6A-B). En analyse av svulster hos mus uten utilslørt metastaser påvist at tumorvolum redusert hos mus som fikk en ni dagers kur med GDC-0449-behandling, mens kjøretøy-behandlede dyr dokumentert vedvarende tumorvekst (figur 6C, -6,7% + /- 11,7% vs 22,7% +/- 9,1%, p = 0,03). Disse dataene korrelerte med obduksjonsfunn: Kun 56% av GDC-0449-behandlede mus hadde synlige lever tumornoduler, sammenlignet med 80% av DMSO mus (tabell 1). Videre har både MR og obduksjon viste et redusert antall metastaser i GDC-0449-behandlede mus sammenlignet med kjøretøy-behandlede kontroller (tabell 1). Histologisk analyse av H Figur 6D, topp panel), microvesicular steatose (40% vs 0%, figur 6D, midtre panelet), acidophilic nekrose og degenerative cytoplasma endringer (70% vs 40%, figur 6D, nedre panel) i forhold til svulster fra bæremiddelbehandlede dyr. Dermed funn på MR, obduksjon, og leverhistologi var konsekvent og viste at Hh pathway hemming forårsaket betydelig tilbakegang av primære og metastatisk HCC.
A. Representativt tverrsnitt bilde av intrahepatisk svulst som er identifisert av kontrastforsterket MRI følgende GDC-0449 behandling. B. Representant MR-bilder av sagittal, koronale og skrå perspektiver som brukes for volumetrisk analyse. C. Endring i tumorvolumet ble kvantifisert ved Computerize generert volumetriske målinger og tegnes som Mean ± SD (* p 0,05). D. mikrografer av representative histologiske endringer indusert av, GDC-0449, behandling. Topp panelet viser tumor nekrose; midtre panelet viser fettdegenerering; nederste panelet viser vacuolated tumorceller med pyknotic kjerner
Diskusjoner
Vi studerte Mdr2
-. /- mus for å bestemme hvorvidt aktivering av HH sti bidrar å hepatocarcinogenesis ved kronisk fibrosing leverskade. Mdr2-mangelfull mus mangler et fosfolipid flippase som er nødvendig for normal galle formasjon, og dermed vise leverskade og ductular spredning fra ung alder. Alle berørte mus etter hvert utvikle betydelig leverfibrose og metastatisk HCC. Våre resultater viser at denne patologi er ledsaget av progressiv aktivering av Hh pathway. Innføring av en spesifikk hemmer av nøkkelen Hh signale middels, glattet, redusert pathway aktivitet og beviste at vedvarende Hh signalering var nødvendig for å opprettholde den utvidede bestander av lever myofibroblasts og forfedre som hadde samlet seg i skadet lever. Videre behandling av alderen Mdr2-mangelfull mus (som allerede hadde avansert leverfibrose og HCC) med Hh pathway inhibitor betydelig redusert leverfibrose og tumorbelastning, viser for første gang at hemme Hh signale har klinisk relevant, terapeutisk verdi for både leveren fibrose og HCC. Enda mer spennende er bevis på at uoverkommelige effekt på levertumorvekst
in vivo
gjelder både intrahepatisk HCC og fjernmetastaser.
I tillegg er våre resultater gir innblikk i noen av de underliggende mekanismer involvert. Lever produksjon av Hh ligander ble økt i mus som utviklet progressiv leverfibrose og invasiv HCC. Disse musene viste også konsekvent høyere serum aminotransferasenivå, i tråd med andre bevis som Mdr2 mangel provoserer kronisk hepatocytter skade [38], [39]. Forskjellige stressfaktorer som reduserer hepatocytter levedyktighet har vist seg å indusere produksjon og frigjøring av Hh ligander av sårede hepatocytter [40], [41]. Dermed er hepatocytter skade sannsynligvis en av de faktorene som øker Hh ligand generasjon i mdr2 fattig lever. Myofibroblastic celler og ductular-type progenitorceller som gradvis akkumuleres i kronisk skadde lever også produsere Hh ligander, så vel som andre faktorer, slik som PDGF-β, som stimulerer autocrine-parakrin syntese av Hh ligander [20], [42].
