Abstract
Bakgrunn
Somatostatin (SST) har anti-proliferative og pro-apoptotiske effekter. Vårt mål var å analysere og sammenligne SST uttrykk under normal aldring og kolorektal kreftutvikling ved mRNA og proteinnivåer. Videre, testet vi metylering status av
SST
i biopsiprøver, og celleveksthemmende virkning av SST analoge oktreotid i human kolorektal adenokarsinom-cellelinje.
Måter
colonic prøver ble samlet fra friske barn (n1 = 6), friske voksne (n2 = 41) og pasienter med kolorektal kreft (CRC) (n
3 = 34) for
SST
mRNA uttrykk analyse, med HGU133 Plus2.0 mikromatriser. Resultatene ble validert både på original (n
1 = 6; n
2 = 6; n
3 = 6) og uavhengige utvalg ((n
1 = 6; n
2 = 6; n
3 = 6) ved real-time PCR SST uttrykker celler ble oppdaget av immunhistokjemi på colonic biopsiprøver (n
1 = 14, n.
2 = 20; n
3 = . 23) virkningen av oktreotid på cellevekst ble testet på Caco-2-cellelinjen SST metylering prosentandel i biopsiprøver (n
1 = 5;. n
2 = 5; n
3 = 9) ble definert ved hjelp metylering følsomme restriksjonsenzymdigestion
Resultater
Ved normal aldring SST mRNA uttrykk endret ikke, men redusert i kreft (p 0,05). forholdet mellom SST immunoreactive. celler var signifikant høyere hos barn (0,70% ± 0,79%) sammenlignet med CRC (0% ± 0%) (p 0,05). Oktreotid betydelig økt andelen av apoptotiske Caco-2 celler
SST
viste signifikant. høyere metylering nivå i tumorprøver (30,2% ± 11,6%) sammenlignet med friske unge individer (3,5% ± 1,9%) (p 0,05).
Konklusjoner
i kreft i kolon mukosa den reduserte SST produksjon kan bidra til ukontrollert celleformering. Vår observasjon at i tykktarmskreftceller oktreotid betydelig forbedret celledød og svekkede celleproliferasjon antyder at SST kan opptre som en regulator av epiteliale cellekinetikk. Hemming av SST uttrykk i CRC kan epigenetiske regulert av arrangøren hypermethylation
Citation. Leiszter K, Sipos F, Galamb O, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et al. (2015) Arrangøren Hypermethylation-Related Redusert Somatostatin Produksjon Fremmer Ukontrollert celleproliferasjon i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (2): e0118332. doi: 10,1371 /journal.pone.0118332
Academic Redaktør: Robert Dante, Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE, FRANCE
mottatt: 04.08.2014; Godkjent: 13 januar 2015; Publisert: 27 februar 2015
Copyright: © 2015 Leiszter et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Mest relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Microarray datafiler er tilgjengelig i Gene Expession Omnibus database (GSE10714, GSE37364, og GSE37267)
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Somatostatin (SST), et regulatorisk-hemmende peptid, har bemerkelsesverdig effekt på gastrointestinal funksjon. Det undertrykker gastrointestinal motilitet og galleblæren sammentrekning, hemmer gut eksokrin sekresjon, regulerer tarmnæringsopptak og blodstrøm, og reduserer epitelproliferasjon [1-5]. I tillegg SST hemmer hormon utgivelse (f.eks GH, TSH, insulin, gut hormoner), fungerer som nevrotransmitter og neuromodulator, og bidrar til vannbalansen [1,4,6]. Utover disse fysiologiske endokrine og parakrine /autokrine effekter, kan SST direkte hemme celleproliferasjon og indusere apoptose via somatostatin reseptor (SSTR) signaliserer [4,7]. Derfor kan reduserte somatostatin nivåer, som vi fant i en pilotstudie har relevans i gastrointestinal tumorigenesis inkludert tykktarmskreft som er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall [8].
Somatostatin er hovedsakelig produsert i sentrale og perifere nervesystem, i det endokrine pankreas og i tarmen; dessuten mindre SST sekresjon er også blitt påvist i skjoldbruskkjertelen, binyrene, submandibulære kjertler, nyrer, prostata, placenta og cellene i immunsystemet. SST er syntetisert fra en stor forløper molekyl kalt preprosomatostatin (preproSST) som er behandlet enzymatisk å modne produkter. To bioaktive peptid produkter av SST-kodende genet er kjent, SST-14 og SST-28 [1]. SST-28 blir syntetisert i tarmslimhinnen, som er den største ytre kilde for peptidet og den store SST-produserende celler i mage-tarmkanalen er slimhinne S-celler i tarmepitelet, D-celler i gastrisk antrum og bukspyttkjertel, og iboende nevroner i myentericus og submukøse plexuses langs fordøyelseskanalen [3]. Somatostatin frigivelse kan stimuleres og hemmes av en rekke hormoner, neurotransmittere, neuropeptider, cytokiner, vekstfaktorer og næringsstoffer. For eksempel, veksthormon-frigjørende hormon (GHRH), kortikotropin-frigivende hormon (CRH), neurotensin, bombesin, IL-1, IL-6 og TNF-α kan stimulere SST sekresjon i flere vev. På den annen side, γ aminobutiric syre (GABA), opiater, TGF-β og leptin er potensielle inhibitorer av SST frigivelse. Næringsstoffer har vev-spesifikk effekt på SST produksjon, og gut SST sekresjon er utløst av luminal men ikke sirkulerer næringsstoffer [1].
De fem kjente somatostatinreseptorer (SSTR1-, SSTR2 /SSTR2A, SSTR2B /, SSTR3, SSTR4 , SSTR5) kodet av fem menneskelige gener er typiske G-protein-koblede reseptorer (GPCR) med sju a-heliks transmembrane segmenter. Ved binding av SST på dens reseptorer, er en rekke cellefunksjoner modulert gjennom flere G-proteinavhengige signalveier. Forskjellige signalveier blir aktivert avhengig av reseptor subtype og vev lokalisering. Alle SSTR subtyper hemme adenylatsyklase og cAMP produksjon, regulere protein fosfataser og aktiverer G-protein reguleres innover likeretter K
+ kanal (GIRK) familie på ligandbindende [1,2,5,9,10].
manifestasjon av antiproliferative og pro-apoptotiske virkninger av SST på normale og tumorceller er avhengig av typen av ligand binding SSTR. SST og dens analoger har indirekte virkninger på celleveksten ved å hemme angiogenese, modulering av immunsystemet og å inhibere vekstfaktorer (for eksempel IGF-1) og trofiske hormoner frigivelse. Videre kan det indusere apoptose, inhibere cellesyklus og modulerer virkningen av vekstfaktorer direkte [11-14].
I våre tidligere undersøkelser har vi oppsummert de makroskopiske, mikroskopiske og molekylære endringer som påvirker den gastrointestinale traktus, særlig i tykktarmen under normal aldring [15-17]. Vi har vist at frisk juvenil kolonepitelet og kolorektal kreft kan karakteriseres med økt celleproliferasjon og apoptose ble redusert sammenlignet med den friske voksne kolon mukosa. Men mens celleproliferasjon er strengt regulert og velbalansert hos barn, det blir ukontrollert i CRC. Vi har også vist at endringer i mRNA-ekspresjon under normal aldring og tykktarmskreftutvikling kan være relatert til økt, men på en annen måte regulert cellevekst [18]. Hensikten med denne studien var å analysere lokal somatostatin produksjon i humant kolonepitelet under normal aldring og tykktarmskreftutvikling, både på mRNA og protein ekspresjonsnivåene. Vi undersøkte også effekten av somatostatinanalog oktreotid på human kolorektal adenokarsinom-cellelinje (Caco-2). Siden arrangøren hypermethylation kan epigenetiske endre gentranskripsjon både under aldring og kreftutvikling, testet vi metylering status for
SST
genet.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Etter informert samtykke ble colorectal biopsiprøver tatt under rutinemessig endoskopisk inngrep på andre Department of Internal Medicine og ved første Institutt for pediatri, Semmelweis University, Budapest, Ungarn. Skriftlig informert samtykke ble innhentet på forhånd fra alle voksne deltakere og fra pårørende, vaktmester, eller foresatte på vegne av mindreårige /barn godkjent av etiske komiteer. Til sammen ble 81 biopsiprøver analysert i microarray analyse (6 friske barn, 41 friske voksne og 34 CRC fra voksne) og 36 biopsiprøver var involvert i real-time PCR validering (12 friske barn, 12 friske voksne og 12 CRC fra voksne) . Femti-syv vevsprøver ble analysert ved immunhistokjemi (14 friske barn, 20 friske voksne og 23 CRC fra voksne) og 15 colonic biopsier ble undersøkt ved hjelp av metylering følsomme restriksjonsenzym metylering rekke analyse (5 friske barn, 5 friske voksne og 9 CRC fra voksne). Syttifem mikromatriser (som inneholder de voksne prøver) hadde blitt hybridisert tidligere; sine datafiler ble brukt i tidligere publiserte studier ved hjelp av ulike sammenligninger [19-21] og er tilgjengelig i Gene Expression Omnibus database (serie tiltredelse Nummer: GSE10714 og GSE37364). Datasettene av de nylig hybridiserte 6 mikromatriser er registrert på GSE37267 seriesjonsnummer. Kontroll barn ble henvist til poliklinikken med forstoppelse, rektal blødning eller kroniske magesmerter. Ileocolonoscopy var en del av deres diagnostiske prosedyren (for å utelukke organisk sykdom) og lige snitt viste normal makroskopisk utseende og histologi. Hver prøve ble verifisert av histopatologer. For mRNA-studier (mikromatriseanalyse, Taqman RT-PCR) og metylering rekke analyse, ble colonic prøvene lagret i RNAlater Reagent (Qiagen Inc., Germantown, USA) ved -80 ° C før nukleinsyre-ekstraksjon. Kolorektal biopsiprøver ble rutinemessig fast i formaldehyd og innebygd i parafinvoks for immunhistokjemi eksperimenter.
Etiske godkjenninger (Nr .: 69/2008 og 202/2009) for denne studien ble utstedt av Regional and Institutional Committee of Science og forskningsetikk av Semmelweis University (Budapest, Ungarn). Detaljert clinicopathological spesifikasjon av pasientprøvene er oppsummert i
Tabell 1
.
mRNA uttrykk microarray analyse
I henhold til produsentens instruksjoner, total RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, USA). Mengden av isolert RNA ble karakterisert ved å måle absorbans (Nanodrop ND-1000 spektrofotometer, Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, USA) og kvaliteten av isolert RNA ble testet med kapillær gelelektroforese (2100 Bioanalyzer og RNA 6000 Pico Sett /Agilent Inc ., Santa Clara, CA, USA /). Ifølge Affymetrix beskrivelse, ble biotinylerte Crna prober syntetisert 1-8 mikrogram total RNA med RIN (RNA Integrity Number) mellom 7-10 og fragmentert hjelp av One-Cycle Target Merking og kontroll Kit (http: //www.affymetrix. com /support /nedlastinger /manualer /expression_s2_manual.pdf). Ti mikrogram av hvert fragmentert cRNA prøve ble hybridisert til HGU133 Plus2.0 matrise (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ved 45 ° C i 16 timer. De mikromatriser ble vasket ved hjelp av lufthåndtering Station 450-enheten, og farget med antistoff forsterkning farging metode i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescente signaler ble detektert av Genechip Scanner 3000 (Affymetrix).
TaqMan sanntids-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) validerings
TaqMan PCR ble anvendt for å måle mRNA-ekspresjon av SST koding gen på originale (6 histologisk intakte barn, seks histologisk intakt voksen og 6 voksne CRC prøver) og uavhengige sett med prøver (6 histologisk intakte barn, seks histologisk intakt voksne, seks voksne CRC prøver). 18S ribosomalt RNA (Hs03928990_g1 *) og GAPDH (Hs03929097_g1 *) ble brukt som referanse genet.
Totalt RNA ekstraksjon, kvalitet og kvantitet kontroller ble utført som beskrevet tidligere. Bruke High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit med RNase Inhibitor, 1 ug total RNA per prøve ble reverstranskribert (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Kvaliteten på cDNA ble sjekket av SDHA real-time PCR (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Sveits). Da 16,7 ng cDNA mal per prøve ble brukt for
SST plakater (Hs00174949_m1 *) mRNA uttrykk analyse med TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies). Målingene ble utført på LightCycler 480 (Roche) med Mono Color Hydrolyse Probe /UPL Probe deteksjon format. Etter denaturering ved 95 ° C i 10 minutter ble 40 PCR-sykluser utført (amplifisering ved 95 ° C i 15 sek, og ved 60 ° C i 1 min).
Immunhistokjemi for påvisning av somatostatin-produserende celler
kjerner 2 mm diameter ble samlet inn fra utvalgte områder av formalinfiksert, parafininnstøpte vevsblokker fremstilt av 20 normale kolon prøver og 23 kolorektal kreft i voksne pasienter og satt inn i vevet microarray (TMA) mottaker blokker. Videre 14 histologisk intakte colonic biopsiprøver fra barn ble også undersøkt på proteinnivå. 5 mikrometer tykke vevssnitt ble kuttet fra TMA blokker og fra biopsiprøver, og ble immunostained. Endogen peroksidase blokkering (0,5% hydrogenperoksid og metanol blanding, 30 min, romtemperatur) og antigen gjenfinning (Target Retrieval Solution, Dako, Glostrup, Danmark, kode: S1699, i pH 6 buffer, utført i en mikrobølgeovn på 900 W for 10 minutter og ved 370 W i 40 min) ble utført på avvokset prøver. Ikke-spesifikk blokkering med 1% bovint serumalbumin ble anvendt. Immunohistokjemisk påvisning av somatostatin ble utført i et fuktet kammer ved hjelp av kanin-anti-humant polyklonalt antistoff (1:50 fortynning, over natten, Thermo Scientific, California, USA, Kode: RB-038-A). EnVision + HRP system (merket Polymer-anti-kanin, 40 min, Dako, kode: K4003) og diaminobenzidin-hydrogenperoksidase-kromogen-substrat-system (Cytomation flytende DAB + Substrat kromogen System, 10 min, Dako, kode: K3468) ble benyttet for signalkonvertering. Endelig hematoksylin co-farging ble utført.
Opptelling av somatostatin produserende celler på digitale lysbildene
Stained biopsiprøver og vev microarray (TMA) lysbilder var digitalisert med et høyoppløselig digitalt skanner (Pannoramic Skann, 3DHISTECH Ltd. Budapest, Ungarn) med flerlags fluorescerende skanning med høy numerisk apertur (0.8) x20 objektiv og et stort dynamisk område AxioCam MRM Rev.3 svart-hvitt kamera koblet til skanneren. Digitale lysbilder ble tilgjengelig via en dataskjerm og analysert ved hjelp av Pannoramic Viewer-programvaren (versjon 1.11.43.0). Marker Counter programvaremodul som resulterer i permanente markeringer på de telte celler ble brukt til å estimere det relative forholdet SST produsere og andre epitelceller. Epitel SST positivitet dukket opp alt som sterk brun cytoplasma merking i lysbildene. Avhengig av utvalgsstørrelse, ble 500-1000 epitelceller telles i langsgående godt orientert krypter.
Behandling av Caco-2 celler med somatostatin analog oktreotid og måling av Sub-G1 befolkningen bruker flowcytometri
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og behandling. Cellekultur eksperiment ble opprettholdt i en spesifikk patogen cellekultur laboratorium. Caco-2 human epitelial adenokarsinom-cellelinje ble oppnådd fra DSMZ (Braunschweig, Tyskland, Cat No. ACC-169.). Celler ble dyrket til konfluens i MEM-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA;. Cat No. M 2279), supplementert med 20% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, nr. F Cat 24 429) og 160 mikrogram /ml gentamycin (Sandoz GmbH, Schaftenau, Østerrike). Deretter ble 70.000 Caco-2 celler avgjort for l tillegg til en 24-brønnbehandling plate i MEM supplert med gentamycin og FCS. Etter 24 timer ble mediet endret: MEM ble tilsatt med gentamycin og med 0,1, 1,0, 2,5, 5,0 og 10,0 nmol /l av oktreotid (Sandoz GmbH) uten FCS. Målingen ble utført i tre paralleller for hver konsentrasjon. Etter 24, 48 og 72 timers behandling ble cellene høstet, vasket to ganger i 0,5 ml steril PBS og til slutt resuspendert i 1,0 ml iskald 70% etanol og lagret ved -20 ° C.
Strømningscytometri og sub-G1 befolkningen gjenkjenning. Prøvene ble sentrifugert i 3 minutter ved 1300 rpm, da cellene ble resuspendert i 300 μ1 av utvinning buffer og 3 pl RNase (RNase A /T1 Mix, Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Vilnius, Litauen) ble tilsatt. Etter 15 min inkubasjon ved romtemperatur ble 3 pl av propidium jodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; Cat. No. 81845) ble tilsatt. Den FACS Målingen ble utført på Becton Dickinson Immunocytometry Systems (Mountain View, California, USA, Serienummer 81313).
Metylering følsomme restriksjonsenzym metylering rekke analyse
Biopsi Prøvene ble homogenisert i to % natriumdodecylsulfat for DNA-ekstraksjon, og deretter inkubert i Proteinase K fordøyelse buffer (4 mg /ml) ved 60 ° C i 16 timer. DNA-ekstraksjon ble utført med høy Pure PCR mal Preparation Kit (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) som beskrevet av produsenten. DNA ble eluert i 2×100 mL RNase- og DNase-fri vann og lagret ved -20 ° C. DNA metylering profiler ble undersøkt ved hjelp av EpiTect Methyl qPCR Array System (Qiagen, Hilden, Tyskland). Det isolerte DNA ble inkubert med enten DNA-metylering avhengig eller DNA-sensitive restriksjonsenzymene i 16 timer ved 37 ° C, og deretter inkubert ved 65 ° C for å stanse metylase aktivitet. Hver 120 pl reaksjon inneholdt 500 ng genomisk DNA. Etter enzym fordøyelsen, ble prøvene analysert ved fluorescens-basert, kvantitativ PCR LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Basel, Sveits). PCR ble utført ved følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser (97 ° C i 15 sekunder; og 72 ° C i 1 min-med real-time data acquisition). For å sikre amplifikasjon av ønskede produkter, smelter kurve analyse utført ved å følge real-time PCR-reaksjonen. Smeltekurven datainnsamling utvalg var 65 ° -95 ° C, holder for 1 s på trinn på 0,04 ° C for PCR produkt deteksjon.
Statistisk evaluering
For mRNA expression profilering, den Affymetrix uttrykk arrays ble hovedsakelig pre-behandlet av GCRMA bakgrunn korreksjonsmetode med quantile normalisering og median polsk samandrag. Uttrykket av
SST
gen mellom ulike utvalgsgrupper ble analysert ved ANOVA og post-test Tukey HSD. Datasettene er tilgjengelig i Gene Expression Omnibus databank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), serien deponeringsnummer:. GSE10714, GSE37364 og GSE37267
For real-time PCR validering av SST uttrykk 12 prøver ble analysert i følgende grupper: barn, friske /normale voksne og voksne CRC. For normalisering, ble 18S ribosomalt RNA brukes som rengjøring internkontroll og DCT verdier var representert på boksplott. Derav data var normalt fordelt for statistisk analyse ANOVA test og Tukey HSD post-test ble anvendt for å bestemme signifikans. Følgende kriterier ble brukt: Brett change≤0.5 eller Fold change≥2 og p-verdi 0,05
For statistisk analyse av SST farging resultater ANOVA test og Tukey HSD post-test ble brukt.. I begge metoder vesentlige kriterier var p. 0,05
Mann-Whitney test ble brukt for å sammenligne andelen Caco-2 celler i ulike cellesyklus stadier (Sub-G1, G1, S, G2 og M) av oktreotid-behandlede grupper og i kontrollgruppen. p 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultatene av metylering rekke analyse ble evaluert av ANOVA og Tukey HSD post-test for å bestemme og sammenligne proporsjonene av
SST
promoter metylering i. tre utvalgsgrupper.
For statistisk analyse R 3.1.0 statistisk miljø ble brukt. Boksplott representerer median og standardavvik data med uteliggere.
Resultater
Somatostatin uttrykk endringer i hyperproliferative tilstander av tykktarmen
Somatostatin mRNA uttrykk nivåer i kolorektal biopsiprøver fra friske juvenile, voksen og kolorektal kreft ble oppdaget ved hjelp 213921_at Affymetrix probeset ID (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). mRNA uttrykk for SST endret ikke under normal aldring i forhold sunn juvenile (Ch) og voksne (N) prøver imidlertid genekspresjon betydelig redusert i tykk- og endetarmskreft (CRC) (p 0,05) sammenlignet med normal voksen (N) prøver
(fig. 1)
.
real-time PCR validering på originalen, den uavhengige og de kombinerte sett av prøvene bekreftet betydelig redusert
SST
uttrykk i CRC (p . 0,05)
(fig 2)
, og økt SST produksjon hos friske prøver, uavhengig av alder. Immunhistokjemisk analyse bekreftet nesten fraværende somatostatin produksjon i tykktarmskreft prøvene i forhold til unge og voksne sunne tarmslimhinnen på proteinnivå (p 0,05)
(fig 3, 4).
mRNA. uttrykk microarray analyse av somatostatin (SST) genet i mikroskopisk normal colonic biopsiprøver fra barn (CH) og voksne (N) og i kolorektal kreft biopsiprøve (CRC). Røde prikker er de normaliserte mRNA uttrykk verdier, boksplott, er median og standardavvik.
SST
uttrykk betydelig redusert i CRC.
Validering av mRNA uttrykk endringer av somatostatin (
SST
) genet i histologiske normal colonic biopsiprøver fra barn (Ch) og voksne (N) og i kolorektal kreft biopsiprøve (CRC) ved hjelp av sanntids-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) på kombinerte prøvesettene. Røde prikker er de normaliserte RT-PCR uttrykk verdier, boksplott, er median og standardavvik. RT-PCR-analyse bekreftet betydelig redusert
SST
uttrykk i CRC.
Påvisning av SST produserende celler (brun cytoplasma) under normal aldring og i tykk- og endetarmskreft (CRC). Bilder ble tatt med digitalt mikroskop: normalt barn vev (Ch) (80 gangers forstørrelse), normalt voksent vev (N) (55 gangers forstørrelse) og karsinom (CRC) i voksen (20 gangers forstørrelse). Bare meget lav SST proteinnivå kunne påvises i CRC-prøver.
Deteksjon av somatostatin (SST) produserende celler i det humane normal kolonepitelet fra barn (CH) og fra voksne (N) og i kolorektal kreft (CRC). Røde prikker er forholdet mellom den SST produserende cellene i forhold til den totale epiteliale celletall (%); boksplott, er median og standardavvik av dataene. SST produksjon betydelig redusert i CRC.
De anti-proliferative effekter av somatostatin analog på kolorektal kreft celler
Somatostatin analog oktreotid ble lagt til kolorektal adenokarcinomceller (Caco-2) i forskjellige konsentrasjoner. Betydelig økt DNA-fragmentering (Sub-G1-populasjon) ble målt ved flow-cytometri etter 48 timer sammenlignet med kontrollceller, på en konsentrasjonsavhengig måte. I tilfelle av somatostatinanalog behandling ved høyere konsentrasjoner enn 0,1 nmol /l, andelen av apoptotiske under G1 fraksjonene var signifikant høyere (p 0,05) enn i kontrollgruppen, mens den andel av cellene i andre cellesyklusfaser ( G1, S, G2, M) var betydelig lavere. Den høyeste apoptotiske fraksjon (Sub-G1) og den laveste G1, S, G2, M populasjon ble målt ved 5,0 nmol /l oktreotid konsentrasjon. Flowcytometri Resultatene er oppsummert i
tabell 2, tabell 3 og
fig. 5
.
Prosent av celler i kontroll og Octreotide behandlede grupper med gjennomsnitt og standardavvik verdier. Blå søylene representerer cellene i under G1 fase og andelene av celler i G1 + S + G2 + M-fasen er illustrert av røde kolonner. Ved høyere konsentrasjoner enn 0,1 nmol /l tilsatt oktreotid, andelen av apoptotiske under G1 fraksjon var signifikant høyere (p 0,05) enn i kontrollgruppen, mens den andel av cellene i andre cellesyklusfaser (G1 + S + G2 + M) var betydelig lavere. Den høyeste apoptotiske fraksjonen (Sub-G1) og den laveste (G1 + S + G2 + M) befolkning ble målt til 5,0 nmol /l oktreotid konsentrasjon.
SST promoter DNA metylering endringer i hyperproliferative tilstander av tykktarmen
Arrangøren metylering av somatostatin genet økte under normal aldring og kreftutvikling. Det laveste
SST
promoter metylering ble funnet i juvenil kolonepitelet (3,5% ± 1,9%), som kan karakteriseres ved regulert, øket celleproliferasjon. Men i tykktarmskreft, hvor økt cellevekst er feilregulert,
SST
metylering var signifikant høyere (30,2% ± 11,6%) (p 0,05). Den høyeste metylering status ble oppdaget i CRC
(Fig. 6)
.
Evaluering av arrangøren metylering av
SST
genet i normale kolorektal biopsiprøver fra barn (Ch) og fra voksne (N) og i kolorektal kreft (CRC) ved hjelp av metylering følsomme restriksjonsenzym metylering rekke analyse. Røde prikker er arrangøren metylering verdier av
SST product: (%); boksplott, er median og standardavvik. Arrangøren metylering øker under normal aldring og kreftutvikling, og den høyeste metylering hastigheten ble oppdaget i tumorprøver.
Diskusjoner
Tykktarmskreft er en av de hyppigste maligne svulster med dårlig utfallet i avanserte tilfeller. Dens forekomst er lavt under 50 år, men det øker raskt i eldre aldersgrupper. I utviklede land median alder ved diagnose er ca 70 år [8] og i de fleste CRC tilfeller er diagnostisert over 65 år [22]. Derfor kan alder betraktes som en dominerende risikofaktor for tykktarmskreft [23]. Vi har tidligere demonstrert at øket celleproliferasjon er et felles trekk ved kolorektal epitel både i barndom og i kreft med den betydelige forskjell i kontrollen av celleproliferasjon i kreft [18]. I denne studien demonstrerte vi både på mRNA og proteinnivåene som somatostatin-ekspresjon ikke signifikant forskjellig hos eldre friske kolonepitelet sammenlignet med juvenile prøver, er det imidlertid nesten fraværende i tykktarmskreft. Promoterregionen av
SST
-genet ble funnet å være hypermethylated i CRC-biopsier, som kan være delvis reversert ved demetylering i kreftcellelinjer. Etter behandling med den somatostatinanalog oktreotid resulterte i redusert celleproliferasjon og apoptose forhøyet i en human kolorektal adenokarsinom-cellelinje, antydet våre resultater at den manglende lokal SST produksjon kan bidra til forhøyet og ukontrollert celleproliferasjon i CRC.
gastrointestinale (GI) hormoner (for eksempel somatostatin, cholecystokinin (CCK), gastrin, bombesin (BBS) /gastrin-frigjørende peptid (GRP), neurotensin (NT), peptid YY (PYY), glukagon-lignende peptid-2 (GLP-2) ) utskilles av endokrine celler, som er plassert i tarmslimhinnen og i bukspyttkjertelen. Disse kjemiske budbringere regulere tarm og pankreatisk sekresjon, fordøyelse, absorpsjon, motilitet og celleproliferasjon. Somatostatin er et regulatorisk-inhiberende peptid, som kan betraktes som et universelt utkobling hormon og i tillegg kan det hemme celleveksten i normale og neoplastiske vev. SST har endokrine og parakrin /autokrine effekter, og kan binde seg til sin celleoverflate G-protein-koblede reseptorer (SSTR1-5) initierende signaltransduksjonsveier [24].
I denne studien vi har funnet at andelen somatostatin produserende celler er mindre enn 1% i histologisk normale unge og voksne kolonepitelet, og betydelig redusert i tumorprøver. Tidligere immunhistokjemiske studier har vist dobbel lokalisering av somatostatin blir både i endokrine D-celler og nerver i tykktarmen [25]. Videre
Parsons m.fl.
. Det er også funnet relativt lavt antall SST-positive celler i det kolonepitelet [26]. I vår arbeidsgruppe
Galamb et al
. tidligere identifisert gener (f.eks
AMN, PTGDR
) med avtagende uttrykk under tykktarms tumorigenesis [20,27]. Tilsvarende til disse markørene, betydelig redusert SST produksjon kan også bidra til tykktarmskreft formasjon.
På grunn av virkningene av SST på mage-tarmkanalen, kan SST-analoger anvendes effektivt i ikke-neoplastiske intestinale sykdommer slik som akutt variceal blødning, bukspyttkjertel fistula, dumping syndrom, eller i noen tilfeller av kronisk diaré og tarm pseudoobstruction [28].
Anvendelse av SST-analoger er utbredt med hensyn til diagnose og terapi av nevroendokrine tumorer [29-31]. Diagnose av disse svulstene kan være vanskelig og tidkrevende, som kan forverre sjansen for effektiv terapeutisk intervensjon [30]. Radiomerkede somatostatinanaloger kan evince lokalisering av primære og metastatiske svulster uttrykker somatostatinreseptorer som ikke kan oppdages med vanlige bildeteknikker grunn av sin lille størrelse [32]. Videre, somatostatin og dets derivater har flere positive effekter ved behandling av neuroendokrine neoplasmer. Hemming av hormonelle hypersekresjon kan gi symptomlindring og tumor krymping [7]. SST-analoger kan inhibere produksjonen av GH og IGF, fremme faktorer av kreftvekst [33]. De kan hemme angiogenese [34,35], kan spille en immunemodulatory rolle [36,37], og kan føre til cellesyklus arrest og indusere apoptose via somatostatinreseptorer [11,14]. SST-analoger kan være tryggere medisiner for langvarig bruk enn cytotoksiske chemotherapies, fordi de har færre og mildere bivirkninger som gastrointestinale plager, gallestein og effekter på glukosemetabolismen [30].
SST analog scintigrafi kan søkes om diagnostisering immunmedierte sykdommer (f.eks lymfomer, granulomatøs sykdom eller revmatoid artritt) [38-41] og ikke-nevroendokrine svulster, samt [42]. Det er flere cellekultur eksperimenter, dyremodeller og kliniske studier som undersøker de positive effektene av SST-analoger i ondartede svulster, inkludert lymfomer, brystkreft og prostatakreft [43-47].
I en klinisk studie effekten av oktreotid ble undersøkt i kjemoterapi-ildfast pasienter med magekreft. Betydelig forbedring i overlevelse ble observert i den behandlede gruppen, sammenlignet med den best supportive care gruppe [48]. Den positive effekten av SST analog terapi på leverkreft (HCC) er ikke klart. I samme tilfeller oktreotid administrasjon forbedret median overlevelse sammenlignet med ubehandlede pasienter [49,50], men senere studie i større befolkning ikke viser overlevelsesgevinst for avanserte HCC pasienter som behandles med langtidsvirkende oktreotid sammenlignet med placebo [51].
