Abstract
p53 og kalsiumsignalisering er gjensidig avhengige, og er kjent for å vise både synergistiske og antagonistiske virkninger på hverandre i det cellulære miljø. Det er imidlertid ingen molekylære mekanismen eller mobil sti kjent som viser direkte regulering mellom disse viktige cellulære signalmolekyler. Her har vi vist at i kreftceller behandlet med anti-neoplastisk legemiddel gaq
3, p53, er det en økning i intracellulære kalsiumnivåer av transkripsjonsregulering av en ny kalsiumkanal-genet TRPC6. p53 binder direkte til et 22 bp responselement i TRPC6 genpromoteren og øke dets mRNA og protein ekspresjon. Over-ekspresjon av TRPC6 resulterer i kalsiumavhengig apoptotisk død og aktivering av apoptotiske gener i forskjellige kreftceller. Denne forskningsarbeid viser at p53 og dens transkripsjonelle aktivitet er kritisk for regulering av kalsiumsignalisering og en økning i den intracellulære kalsiumnivå kan være en av de anti-kreft strategier for å indusere apoptose i kreftceller
Citation:. Madan E, Gogna R, Keppler B, Pati U (2013) p53 øker intracellulært kalsium versjonen av Transkripsjonell Regulering av kalsiumkanal TRPC6 i gaq
3-Behandlet kreftceller. PLoS ONE åtte (8): e71016. doi: 10,1371 /journal.pone.0071016
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 30 juni 2013; Publisert: 16 august 2013
Copyright: © 2013 Madan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Swiss Cancer League, Josheph Steiner tilskudd award og indiske rådet av Mecical forskning (ICMR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gallium og dets organiske derivater har vist høy konsistens og effektivitet som anti-kreft narkotika [1] – [5]. Vi har nylig vist et nytt organisk derivat av gallium «gaq
3″ [tris (8-quinolinolato) gallium (III)] (KP46) som et effektivt anti-kreft legemiddel i kreftceller med vill-type p53 eller Mt-p53 protein [6]. Vi observerte at gaq
3 induserer kalsium signalisering i kreftceller ved å øke intracellulære kalsiumnivåer. Økning i mobilnettet Ca
2 + aktiverer p53 protein og øker p53 cellenivå. Gaq
3-indusert intracellulær kalsium-frigjøring var signifikant høyere i kreftceller med vill-type p53 enn i kreftceller med mutant p53 eller p53 genet delesjon [6]. Interessant, ble det observert at økningen i intracellulær Ca
2+ utgivelse var p53-avhengig og hemming av p53 transkripsjonen aktivitet ved hjelp pifithrin-α avskaffet den intracellulære Ca
2+ utgivelse. Denne observasjonen antydet at p53 kan transcriptionally regulere intracellulært Ca
2 + utgivelsen og Ca
2 + signalering i gaq
3-behandlede kreftceller. p53 og kalsium er kjent for å virke i synergi, men ingen direkte forbindelse har blitt etablert mellom p53-aktivering og p53-avhengig regulering av kalsiumsignalisering på celle, biokjemiske eller molekylært nivå. I enkelte rapporter Ca
2 + indusert signaler som Ca
2 + -aktiverte RAF /MEK /ERK stier mediert p53-uavhengige apoptose [7]. Det er også forutsett at p53 arbeider i nær relasjon med cellulære kalsiumsignalering, siden intracellulært kalsium frigivelse spiller en viktig rolle ved indusering Bcl-2, ROS og mitokondrielle vei av apoptose [8]. Det gis imidlertid ingen molekylær mekanisme eller bane av p53-medited regulering av intracellulært kalsium frigivelse kjent.
I dette studiet har vi vist at den cellulære kalsiumsignalisering og intracellulært kalsium frigivelse er under transkripsjonen kontroll av p53 protein. p53 transcriptionally regulerer en roman kalsiumkanal TRPC6 ved direkte binding til en 22 basepar p53-RE nåværende 400 basepar oppstrøms for en transcriptional starte hotellet (TSS) på TRPC6 promoter. Vi har observert at gaq
3 induserer apoptose via p53-avhengig oppregulering av TRPC6 genet i cancerceller med wt p53. Over-ekspresjon av TRPC6 medfører betydelig apoptose i kreftceller. Videre TRPC6 uttrykk initierer en kalsiumavhengig regulering av uttrykket av gener involvert i apoptose.
Materialer og metoder
Cell kultur
MCF-7, U2OS, HCT, A -431, PC3 og H1299 celler ble hentet fra Nasjonalt senter for Cell Science, Pune (India) og ble opprettholdt i DMEM medium. Cellene ble dyrket som monolag i DMEM-medium supplert med 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum og antibiotika og inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 Alle de transfections ble utført ved hjelp av effectene transfeksjon reagens (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. For tiden selvfølgelig analyse 5 petriskåler for hvert tidspunkt ble brukt.
plasmider og reagenser
p53-TRPC6 full lengde promoter, p53-TRPC6 minimal promoter og p53-TRPC6 mutant minimal promoter ble klonet i pGL3 luciferase vektor. p53 si-RNA ble også anvendt som tidligere beskrevet av [9] -. [11]
Analyse for Ca
2 + mobilisering
Ca
2 + ble målt under anvendelse av celle gjennomtrengelig Ca
2 + sensitive fluorescerende fargestoff Fluo- 3 acetoksymetylester. Hvor angitt, ble BAPTA acetoksymetylester (10 uM) tilsatt til kulturmediet av celler i 10-cm plast vevskulturplater for en 1-timers eksponering før ladeprosedyren med Fluo-3-acetoksymetyl-ester. Mediet ble fjernet fra vevskulturplater og erstattet med 4 uM Fluo-3-acetoksymetyl-ester fortynnet i Krebs-Ringer buffer (KRB) (10 mM D-glukose, 120 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4, 1,5 mM NaH2PO4 og 0,5 mM MgCl2 (pH 7,4 ved 37 ° C)) (Sigma) i 20 min. Rettene ble vasket en gang med 5 ml KRB å fjerne rest fargestoff. Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket i 5 ml Ca
2 + fri PBS ved 37 ° C, pelletert ved sentrifugering, resuspendert i 1 ml av Ca
2 + fri PBS ved 37 ° C, og analyseres umiddelbart for Fluo-3 fluorescens intensitet ved flow-cytometri.
Vennligst referer til fil S1 for full beskrivelse av materiale og metoder.
Resultater
gaq
3 induserer TRPC6 genuttrykk i kreftceller med vill-type p53
Vi hadde tidligere observert at gaq
3 induserer høy intracellulær kalsium utgivelse selektivt i kreftceller med vill-type p53 protein [6]. Stanse av p53-genet ved hjelp av p53 siRNA og hemming av p53 transkripsjonen aktivitet ved hjelp pifithrin-α både avskaffet gaq
3-indusert økning i den intracellulære kalsium meldingen [6]. Denne informasjonen antydet at intracellulær økning av kalsiumnivåer i kreftcellene ble regulert av p53 og var avhengig av p53 transkripsjonen aktivitet. Men mekanismen som er involvert i reguleringen av dette observerte fenomen er ukjent [6]. Siden gaq
3-induserte signifikant økning i kalsiumopptak, ved hjelp av qPCR vi analyserte ekspresjonen av et stort antall kjente kalsiumkanaler i gaq
3-behandlede MCF-7-celler. Vi observerte betydelig høy uttrykk for TRPC6 genet i gaq
3-behandlede celler. Siden uttrykk for TRPC6 kalsium kanal var høy, vi spurte om TRPC6 kan være involvert i økningen i mobilnettet kalsium nivåer i gaq
3-behandlede kreftceller. Ekspresjonen av TRPC6 mRNA og protein ble observert i gaq
3-behandlede MCF-7, H1299 og PC3-celler (figur 1 A). QPCR analyse viser at TRPC6 mRNA ble betydelig økt i gaq
3-behandlet MCF-7 (p53 Wt) celler (figur 1A). Økningen i p53 mRNA nivået ble ikke observert i H1299 (p53 null) og PC3 (p53 mut) celler (Bars 3-6, figur 1A). Tilsvar p53-protein-nivå ble analysert i ovennevnte kreftceller og bare MCF-7 viste signifikant økning i p53-protein-nivå på gaq
3 behandling (figur 1A). Denne informasjonen antydet at p53 spilte viktig rolle i gaq
3-mediert oppregulering av TRPC6. Ytterligere forholdet mellom p53-ekspresjon og TRPC6 ekspresjon observeres. Tidsforløpet analyse av TRPC6 mRNA nivå (real-time PCR) i gaq
3-behandlede MCF-7, H1299 og PC3-celler viser at TRPC6 mRNA var signifikant høy i p53 (+ /+) MCF-7-celler ( Figur 1B, svart linje). Tidsforløpet analyse viser at gaq
3 induserer ekspresjon av TRPC6 innen 6 timer fra sin inkubering og de TRPC6 uttrykk øker fra 6
th til 24
th time i et lignende mønster som p53-ekspresjon økning gaq
3-behandlede celler [6] dommeren er nå plassert. Disse dataene tyder på at p53 og TRPC6 viser tidsmessig sammenheng i sin mRNA uttrykk profilering. Den direkte rolle av p53 i ekspresjonen av TRPC6 i gaq
3-behandlede MCF-7-celler blir observert ved stanse p53-genet i gaq
3-behandlede MCF-7-celler (figur 1C). Resultatene viser at TRPC6 protein ekspresjon ble betydelig høy ved gaq
3 behandling (kolonne 2); men dette gaq
3-indusert økning i TRPC6 ble fullstendig snudd på p53 lyddemping (spor 3). Disse dataene tyder på at p53 har en viktig rolle i reguleringen av TRPC6 genet. Vi analyserte ytterligere effektivisering av TRPC6 siRNA og TRPC6 cDNA (2 uM) i MCF-7-celler.
A) Virkningen av gaq
3 ved ekspresjon av TRPC6 mRNA i p53 (+ /+) MCF-7, p53 (- /-) H1299 og p53 (mt /tonn) PC3 cellene er observert ved hjelp av qPCR. Resultatene viser at gaq
3 kan indusere oppregulering av TRPC6 bare i MCF-7-celler med wt p53 (kolonne 2). Tilsvar gaq
3 kan indusere ekspresjon av TRPC6 protein bare i MCF-7-celler (n = 5). B) Real-time PCR viser tidsforløpet analyse av TRPC6 mRNA uttrykk i GaQ3-behandlet MCF-7 (svart linje), H1299 (grønn linje) og PC3 (rød linje) celler. Resultatene viser at TRPC6 mRNA blir oppregulert bare i MCF-7-celler og ikke i H1299 og PC3-celler. Videre er økningen i TRPC6 mRNA observert ved 6
th time av GaQ3 inkubasjon. Økningen i TRPC6 mRNA tidsmessig med økningen i p53 mRNA i GaQ3-behandlede MCF-7 celler (* (rød) representerer betydelig forskjell i resultatene mellom rødt, grønt og svart linje på 9
th hr tidspunkt , p 0,028), n = 5, Anova, feilfelt representerer SD). C) Rollen til p53 i gaq
3-indusert oppregulering av TRPC6 er observert. p53-genet Slå ved hjelp av p53 siRNA i gaq
3-behandlede celler reversere økningen i TRPC6 proteinnivå (felt 3) (* (rød) representerer betydelig forskjell i resultatene mellom felt 1 og 2,, p 0,036 og felt 2 3, p 0,042). Effektiviteten av TRPC6 siRNA og TRPC6 cDNA er vist i spor 4 og 5.
p53 aktiverer transcriptionally TRPC6 arrangøren
TRPC6 (kromosom 11q22.1, reverse tråd) og p53 viste temp relasjoner i deres uttrykk profil i gaq
3-behandlede kreftceller, derfor var det av interesse å definere rollen til p53 i regulering av TRPC6. Den TRPC6 promoter regionen ble identifisert som 650 bp DNA sekvens oppstrøms for en transkripsjon start stedet, ved hjelp av matrise kampene bestemmes av Mat Inspector (Genomatix). TRPC6 promoter ble gitt locus ID GXP_193240 av Mat Inspector. Denne regionen ligger mellom regioner 101,374,672-101,375,321 (TSS ref punkt representert av Mat Inspector er 101 374 772) og er representert ved ENST00000527240 og AK027769. Bioinformatikk analyse av TRPC6 arrangøren hjelp Mat Inspector modul av genomatix database viste antatte p53 DNA bindingssetet (matrise sim; poengsum 0,9) (figur 2A) som tyder på at p53 kan være en potensiell TRPC6 regulator. For å etablere denne, klonet vi en 0,65 kb antatt TRPC6 promoter bærer p53 respons element (p53RE) i en pGL3 basisvektoren å generere pTRPC6p-luc1. Den pTRPC6p-luc1 ble transfektert i ubehandlet og gaq
3-behandlet MCF-7, H1299 og PC3 celler. Gaq
3 behandling induserte 5-gangers økning i TRPC6 promoter-aktivitet i MCF-7-celler i forhold til ubehandlede celler (figur 2B, stangen 2 og 3). Økningen i TRPC6 promoter aktivitet var p53 avhengig siden p53 genet Slå bruker p53 siRNA snudd gaq
3-indusert økning i TRPC6 promoter aktivitet. Gaq
3 behandling var ikke i stand til å indusere TRPC6 promoteraktivitet i H1299 og PC3-celler (bar 5, 6, 8 9). TRPC6 promoter ble aktivert i gaq
3-behandlet H1299 celler som ble transfektert med p53 cDNA (bar 7). Disse dataene viste at TRPC6 ble regulert av p53 i gaq
3-behandlede celler. For å bekrefte den rolle p53RE i p53-medierte regulering av TRPC6 promoter ytterligere, ble området mellom basepar -74 til -99 (med referanse til TSS seq (101,374,772) av TRPC6 promoteren som bærer p53RE klonet inn i en vektor til pGL3 generere den minimale pTRPC6p-luc2. denne TRPC6 minimal promoter ble indusert ved GaQ3-behandling i MCF-7-celler og p53 lyddemping avskaffet denne økningen i den promoter-aktivitet (figur 2C, bar 2-4). for å fastslå rollen til nylig identifiserte p53RE i p53-mediert regulering av TRPC6 genet ble p53RE sekvensen mutert og klonet i PGL3 vektor for å generere mutant minimal mmpTRPC63p-luc2. Transfeksjon av mmpTRPC63p-luc2 i gaq
3-behandlet MCF-7, PC3 og H1299 celler viste ingen økning i TRPC6 promoter aktivitet (figur 2D). Denne informasjonen fast at p53 transcriptionally regulerer TRPC6 i gaq
3-behandlede kreftceller.
A) En antatt p53 bindingssetet er observert i den TRPC6 arrangøren hjelp Genomatix, Matinspector modul. TRPC6-p53RE ligger mellom -422 til -400 bp på 0,6 kb TRPC6 promoter. DNA seq av TRPC6 arrangøren sammen med plasseringen av p53 RE (vist i rødt) er skjematisk representert. B) pTRPC6p-luc1 (TRPC6 0,6 kb promoter luciferase konstruksjon) er transfektert i gaq
3-behandlet MCF-7 celler og effekten av p53 på luciferase aktivitet er målt. Gaq
3-indusert p53-genet aktivering induserer 8 ganger økning i pTRPC6p-luc1 luciferase aktivitet (bar 3). p53 genet Slå bruker p53 siRNA reverserer denne effekten og TRPC6 promoter aktivering er avskaffet (bar 4). Transfeksjon av pTRPC6p-luc1 i H1299 og PC3 celler i fravær eller nærvær av gaq
3 har ingen effekt på aktiviteten til TRPC6 promoter. Ved eksogen tilførsel av Wt p53 cDNA i gaq
3-behandlet H1299 celler TRPC6 arrangøren viser 9-dobling i luciferase aktivitet (bar 7). Disse dataene viser at p53 regulerer TRPC6 promoter transcriptionally. (C) pTRPC63p-luc2, den TRPC6-p53RE (-422 til -400) klonet i luciferase-vektoren transfekteres i gaq
3-behandlede MCF-7-celler. Resultatene viser at p53 induserer en seks-dobling i TRPC6-p53RE luciferase aktivitet (bar 3). p53 genet Slå bruker p53 siRNA opphever økning i luciferase aktivitet (bar 4). Økningen i TRPC6 promoter aktivitet er fraværende i H1299 og PC3 celler. Dataene viser at p53 regulerer TRPC6 arrangøren via TRPC6-p53RE. (D) Den mmpTRPC6p-luc2 konstruere med mutert sekvens av TRPC6-p53RE transfekteres i gaq
3-behandlede MCF-7-celler. Ingen økning i luciferase aktiviteten er observert, viser spesifisitet TRPC6-p53RE. For figur 2b-2d, (* (rød) representerer betydelig forskjell i resultatene alle verdiene p 0,05), n = 7, Anova, feilfelt representerer SD)
WT p53 binder direkte til. sitt svar element på TRPC6 arrangøren
bindingen av p53 på 22 basepar region på TRPC6 arrangøren ble analysert under
in vitro
forhold ved hjelp av EMSA (figur 3A). Dataene viste binding av p53 ved TRPC6-p53-RE-sekvensen som en klar forskyvning og super-forskyvning av komplekset ble observert (kolonne 2). Bindingen mellom p53 og dets responselement som gikk tapt ved varme denaturering p53-protein (spor 3). Bindingen mellom p53 og dens respons element var svært spesifikke siden mutasjon av 22 basepar p53 RE sekvens avskaffet binding mellom p53 og dens RE (kolonne 5-8). Bindingen mellom p53 og dets responselement på p21 5′-promotorelementet tjener som positiv kontroll (spor 9-12). Å definere rollen TRPC6-p53RE i p53-mediert TRPC6 induksjon under nærmere
in vivo
forhold, utførte vi kromatin immunoprecipitation (chip) analyser i gaq
3-behandlede MCF-7 celler. I samsvar med luciferase resultater, vi har oppdaget en spesifikk PCR produkt fra TRPC6-p53RE (figur 3B, øvre panel). Innmatingen tjener som kontroll, i fravær av gaq
3 behandling p53 viste ingen binding til p53RE ved TRPC6 promoteren. Ved behandling av MCF-7-celler med gaq
3, viser p53 binding til dens RE ved TRPC6 promoteren, PCR med egge primere tjener som negativ kontroll. På den annen side ingen binding mellom p53 og p53RE ved TRPC6 promoteren er observert i H1299 og PC3-celler (figur 3B, nedre panel). Disse resultatene fastslått at det TRPC6-p53RE var ansvarlig for p53-mediert induksjon av TRPC6 promoter aktivitet og at p53 transcriptionally induserer TRPC6 gjennom promoter bindende i gaq
3-behandlede celler. Siden gaq
3 induserer en eksponensiell økning i den intracellulære kalsium-frigjøring i kreftceller med wt p53 og p53 vises nå til transkripsjonelt regulere kalsiumkanal TRPC6 i gaq
3-behandlede celler, rollen TRPC6 i p53-mediert kalsium utgivelsen er observert. Flow-cytometrisk analyse av intracellulært kalsium frigivelse viser at gaq
3 behandling induserer en eksponensiell økning i frigivelsen av intracellulært kalsium på 8
th time av dens inkubasjon (figur 3D, rød linje), på tie TRPC6 gen ved hjelp av TRPC6 siRNA vi observert at 8 timers eksponensiell økning i de intracellulære kalsiumnivåer ble reversert, og den økning i kalsiumnivået ble lineær som tidligere er observert i p53 null (H1299) og p53-mutant (PC3) celler. Disse data viser at gaq
3-induserte og p53-mediert økning i intracellulært kalsium frigivelse er på grunn av det p53-avhengig transkripsjonen oppregulering av TRPC6 protein i de behandlede kreftceller.
A) EMSA er gjennomført for å studere bindingen mellom p53 og dens respons element på TRPC6 arrangøren under
in vitro
forhold. En omlegging og en super-forskyvning av p53, p53AB og p53-RE er observert i kjørefelt 2. Bindingen mellom p53 og dens RE er tapt etter en mutant p53 RE sekvens brukes for EMSA, viser høy spesifisitet for denne interaksjonen ( felt 6), Binding mellom p53 og dets kjente p215’RE anvendes som en kontroll (kolonne 9-12). (B) Chromatin immunoutfelling gjennomføres i gaq
3-behandlede MCF-7-celler for å bekrefte
in-vivo
bindingen av p53 til p53RE ved TRPC6 promoteren. p53 viser positiv TRPC6-p53RE bindende utelukkende i gaq
3-behandlede celler. Innmatingen tjener som positiv kontroll og egge primere for PCR ble anvendt som negativ kontroll (n = 5). (C) Bindingen mellom TRPC6 og p53 RE er ikke observert i H1299 og PC3-celler selv i nærvær av gaq
3 (n = 5). (D) Tid løpet analyse av intracellulært kalsium utgivelsen er observert i gaq
3-behandlet MCF-7 celler (rød linje) og gaq
3-behandlede MCF-7 celler hvor TRPC6 genet er forstummet bruker TRPC6 siRNA ( svart linje). Resultatene viser at gaq
3 induserer den kraftige økningen i intracellulær kalsium utgivelse i p53 (+ /+) MCF-7 celler med 6
th time av sin inkubasjon. Taushet av TRPC6 opphever dette 6
th hr økning i intracellulær kalsium utgivelse (* (rød) representerer betydelig forskjell i resultatene mellom rødt og svart linje på 8
th hr tidspunkt, p 0,029) , n = 5, Anova, feilfelt representerer SD).
TRPC6 induserer kalsiumavhengig apoptose i kreftceller
Vi analyserte fysiologiske betydningen av dette p53 avhengig regulering av ytterligere TRPC6 uttrykk og intracellulære kalsiumnivåer. Siden p53 er en sentral aktør i styrende cellulære apoptotiske strategier i kreftceller. Vi antok at p53-avhengig ekspresjon av TRPC6 kan være en annen cellulær vei gjennom hvilken p53 kan indusere apoptose i kreftceller. Således kan effekten av TRPC6 uttrykk på cellulær apoptose ble analysert på p53 villtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutante celler (A-43, PC3) og p53 null (H1299) celler . Disse cellelinjer ble ectopically uttrykt med TRPC6 cDNA (figur 4a) og den cellulære apoptose ble sammenlignet med kontrollgruppen (un-transfekterte celler) celler ved anvendelse av annexin-V-farging og strømningscytometri. Resultatene viste en signifikant økning i den apoptotiske fraksjon av TRPC6 overekspresjon kreftceller, uavhengig av statusen til p53-genet. Neste vi observerte rollen av intracellulært kalsium i TRPC6-mediert apoptose ved bråkjøling intracellulært kalsium frigivelse via TMB-8. Resultatene viste at bråkjøling av det intracellulære kalsium frigivelse via TMB-8 opphevet TRPC6-mediert apoptose i kreftceller. Disse data antydet at TRPC6 avhengig økning i den intracellulære kalsium-frigjøring var avgjørende for apoptose, således p53-avhengig økning i TRPC6 ekspresjon i kreftceller kan bli en strategi for å indusere apoptose via kalsium-mediert veier. Dette kan være en annen mobil vei vedtatt av p53 å fremkalle apoptotisk respons og funksjon som den viktigste tumor suppressor molekyl i kreftceller. Disse data etablerer TRPC6 som en potensiell apoptotisk protein som i fremtiden måtte sår potensiale til å virke som en anti-kreft-gen-terapi molekyl. For å forstå TRPC6-indusert apoptose i detaljer observerte vi aktivering og undertrykkelse av en nøkkel sett av 84 gener (SA-Bio Sciences, PAHS012) er involvert i både induksjon og hemming av apoptose. ble gjennomført mRNA-ekspresjon analyse av disse genene i p53 villtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutante celler (A-43, PC3) og p53 null (H1299) celler (figur 4b). I den eksperimentelle oppstilling disse cellene ble overuttrykt med den apoptotiske TRPC6 cDNA. Resultatene var konsistente i alle cellelinjer, og viste at TRPC6 overekspresjon resulterte i nedregulering av de som er involvert i hemming av apoptose gener og oppregulert gener som er involvert i indusering av cellulær apoptose (figur 4b (felt 1, 5, 7, 8, 11 12)). Interessant, ved ektopisk ekspresjon av TRPC6 cDNA i kreftceller, hvor intracellulært kalsium ble bråkjølt gjennom TMB-8 behandling ble genuttrykksmønstrene forandres og uttrykkene som er involvert i cellulær apoptose gener var konsekvent lavt (figur 4b (spor 17, 18 , 19, 20, 22 24)). Behandling med doxorubicin, anvendt som positiv kontroll, resulterte i oppregulering av gener som er involvert i apoptose (figur 4b (spor 2, 3, 4, 6, 9 10)). Ubehandlede kreftceller tjene som kontroller (figur 4b (spor 13, 14, 15, 16, 21 23)). Disse dataene antyder at TRPC6 induserer apoptose via økning av intracellulære kalsiumnivåer og gjennom denne veien det endrer uttrykket av gener involvert i apoptose, noe som tyder på at TRPC6 er en potensiell kandidat for pro-apoptotiske anti-kreft strategier. Denne nye molekylære vei gjennom hvilken p53 ved aktivering av gaq
3 transkripsjonelt regulerer ekspresjonen av de pro-apoptotiske TRPC6 kalsiumkanal, som i sin tur påfører kalsium-mediert apoptose er en interessant strategi som ble vedtatt av p53 til å fungere som en tumor suppressor. Videre denne veien kan utnyttes til å oppnå anti-kreft fordeler i fremtiden.
A) Virkningen av TRPC6 over-ekspresjon observeres ved cellulær apoptose i p53 villtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutante celler (A-431, PC3) og p53 null-celler (H1299) ved hjelp av annexin-V-farging og flow-cytometri. Betydelig økning i apoptotiske fraksjon av TRPC6 over-uttrykkende celler som er sett uavhengig av p53-genet status. Intracellulært kalsium slukke via TMB-8 opphever TRPC6-mediert apoptose; ubehandlede celler tjener som negativ kontroll, doksorubicin tjener som positiv kontroll (* indikerer signifikant forskjell mellom TRPC6-behandlede celler og TRPC6-behandlede og TMB-8-behandlede celler; alle p-verdiene og 0,05, n = 7, S.D, Anova). (B) TRPC6 induserer ekspresjon av apoptotiske gener i kreftceller. PCR gen matrise for gener som er involvert i regulering av cellulær apoptose gjennomføres i TRPC6 cDNA transfekterte p53 villtypeceller (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutante celler (A-431, PC3) og p53- null-celler (H1299) celler. Over-ekspresjon av TRPC6 fører til nedregulering av gener som inhiberer apoptose og oppregulering av pro-apoptotiske gener (felt 1, 5, 7, 8, 11 12). Intracellulært kalsium bråkjøling i TRPC6 overuttrykkende celle resulterer i hemming av apoptotiske gens og økning i ekspresjon av anti-apoptotiske gener (kolonne 17, 18, 19, 20, 22 24). Ubehandlede celler også tjene som kontroller (felt 13, 14, 15, 16, 21 23); doksorubicin behandling tjener som positiv kontroll og som fører til oppregulering av gener som er involvert i apoptose (spor 2, 3, 4, 6, 9 10). (n = 10)
diskusjon
i dette forskningsarbeide har vi vist at den intracellulære kalsium-frigjøring er under transkripsjonen kontroll av p53 tumor suppressor, via p53-avhengig transkripsjonsregulering av genet TRPC6. Genom bred analyse av p53-bindingsseter i promotorområdene av kalsiumkanaler viste nærvær av p53 RE i TRPC6 genet. Vi har vist at GaQ3 induserer ekspresjon av TRPC6 bare i kreftceller med vill-type p53 og p53 genet Slå reverserer GaQ3-induserte økning i TRPC6 uttrykk. Disse data fastslår også at TRPC6 er et direkte mål transkripsjonen av p53 og p53 bindes til sin responselement i TRPC6 promoteren. Vi har funnet p53 bindingssetet i 0,6 Kb TRPC6 genet promoter som ligger 400 basepar oppstrøms av en transkripsjon start stedet. Den plutselige økningen i intracellulær kalsium utgivelse og kalsium-mediert cellulær apoptose i gaq
3-behandlede kreftceller skyldes p53 avhengig transkripsjonen aktivering av TRPC6 genet. I dette forskningsarbeidet har vi vist en direkte forbindelse mellom p53 transkripsjonelle evne og kalsiumsignalisering.
forstå forholdet mellom kalsiumsignalisering og p53 er viktig i kreft perspektiv ettersom begge disse faktorene regulere cellevekst, differensiering, aldring , spredning på fysiologiske, cellulære og molekylære nivå [12], [13]. I forbi en Ca
2 + -permeable TRPC kanal har vist seg å delta i et variert utvalg av cellulære funksjoner ved å regulere intracellulært Ca
2 + signalering [14]. TRPC6-mediert Ca
2+ signale aktiverer celle-proliferasjon genet som kalmodulin-avhengig proteinkinase og mitogen-aktivert protein kinase [15]. Rollen TRPC6 i kreft vekst og utvikling er ikke klart; imidlertid flere mekanismer er involvert i TRPC6 kanal aktivering og regulering i kreftceller. De fysiologiske og cellulære faktorer som er involvert i kreft progresjon av sykdommen er også kjent for å regulere den cellulære TRPC6 uttrykk [16] – [20]. De cellulære faktorer som membran reseptor aktivering via TFN-α og celle Ca
2 + butikken uttynning involvert i kreft progresjon har vært kjent for å indusere TRPC6 uttrykk [16] – [20]. Nylig rollen som en viktig signalmolekyl ROS i TRPC6 aktivering er observert [18]. Siden ROS er involvert i både progresjon av kreft og dens regulering, og dermed er det viktig å identifisere den rolle TRPC6 protein i kreftsykdomsutvikling eller regulering. Nyere studier har vist at flere pro-apoptotiske faktorer, inkludert medlemmer av BCL-2 familien proteiner og reaktive oksygenforbindelser (ROS) regulere Ca
2 + følsomhet for begge de Ca
2 + utgivelsen kanaler i ER og mitokondrier [21]. Videre finnes det ikke noen data relatert til forholdet mellom den tumor suppressor p53 og regulering av kalsiumsignalisering transkripsjonsregulering av TRPC6 genet i cancerceller er tilgjengelig. Det er viktig å identifisere forholdet mellom p53 og dens kontroll av intracellulært kalsium frigivelse og den rollen som TRPC6 genet i gaq
3-behandlede kreftceller. Den p53 og TRPC6 indusert siden endringer i cytosoliske konsentrasjoner av Ca
2+ kan indusere signalveier som regulerer en rekke cellulære hendelser, inkludert de viktige i tumorigenesis [21].
Videre en ny relasjon mellom den intracellulære Ca
2+ frigivelse og p53 ble observert hvor Ca
2+ frigivelse stabilisert bindingen av p53 til sin transkripsjonen ko-aktivator P300 og også stabiliseres bindingen av p53-P300 transkripsjonen komplekset til p53-DNA bindingssetet på p53-minimal promoter [22]. I dette forskningsarbeidet har vi belyst nærvær av et cellulært krysstale mellom p53 og kalsiumsignalering, hvor kalsiumsignalisering aktiverer p53 transkripsjonelt [6], og den aktive p53 øke den intracellulære kalsium frigivelse av transkripsjonelt regulere promotoren av TRPC6 genet. Således kalsium-avhengig apoptose kan være mediert av p53 og kalsiumsignalisering kan spille en avgjørende rolle i p53-mediert apoptose. Nylig TRPC6 genet har vist avgjørende rolle i patologiske hjertehypertrofi og ombygging som svar på stress [23], [24]. Sletting av TRPC6 hindrer stressinduserte overdrevet hjerte ombygging og overekspresjon av TRPC6 utvikle spontan hjertehypertrofi i mus modell, noe som tyder i retning av en mulig kobling mellom TRPC6 uttrykk og celle-død og divisjon, siden hjerte ombygging involverer begge disse prosessene. TRPC6 uttrykk er også kjent for å indusere podocyte cytoskeletal remodellering [25], human keratinocytt-differensieringen [26], og hippocampus neuron differensiering [27]. En viktig rolle TRPC6 har også blitt oppdaget i sårheling hvor et genom-wide screen identifisert TRPC6 viktig for myofibroblast transformasjon og TRPC6 gen-slettet mus viste nedsatt dermal og hjerte sårheling etter skade. De tidligere rapportene tyder i retning av en kobling mellom TRPC6 uttrykk og regulering av celle-divisjon og celledødsrelaterte prosesser, i denne rapporten er vi foreslå en sterk rolle TRPC6 som en p53-regulert pro-apoptotiske proteiner i kreft modell. Som konklusjon, her vi har klarlagt en ny rolle TRPC6 kalsiumkanal for å fungere som en p53 nedstrøms effektor-protein som induserer apoptose ved å regulere cellulære kalsiumnivåer i kreftceller. Denne veien ser ut til å være en strategi vedtatt av p53 protein for å utnytte kalsium signalisering som en effektiv pro-apoptotiske anti-kreft mener med transcriptionally regulere TRPC6 kalsium kanal, og dermed bruke TRPC6 som en mulig mekanisme for å fungere som en tumor suppressor.
Hjelpemiddel Informasjon
fil S1.
Supplerende materiale og metoder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071016.s001 plakater (DOC)
