Abstract
Bakgrunn
Wnt5a er en ikke-kanoniske utskilt glykoprotein av Wnt familien som spiller en viktig rolle i kreftutvikling og progresjon. Tidligere studier rapporterer at Wnt5a er oppregulert i prostatakreft og foreslo at Wnt5a påvirker migrasjon og invasjon av prostata svulst celle. Denne studien hadde som mål å evaluere den prognostiske verdien av Wnt5a protein uttrykk i prostata kreft vev og dens potensial for å forutsi utfallet etter radikal prostatektomi hos pasienter med lokalisert prostatakreft.
Metode og resultater
Immunhistokjemisk analyse av en vev microarray som inneholder prostata eksemplarer av 503 pasienter med lokalisert prostatakreft viste signifikant høyere Wnt5a protein uttrykk i kreft sammenlignet med godartede kjerner fra de samme pasientene (p 0,0001). Pasienter med høyt uttrykk for Wnt5a protein hadde signifikant bedre resultat i form av tid til biokjemisk tilbakefall sammenlignet med pasienter med lave nivåer (p = 0,001, 95% KI 1,361 til 3,570, Hazard Dekningen 2,204). En kombinasjon av høy Wnt5a uttrykk med lave nivåer av Ki-67 eller androgen reseptor ekspresjon hadde enda bedre resultat sammenlignet med alle andre grupper. Videre fant vi at Wnt5a uttrykk signifikant korrelert med VEGF og med Ki-67 og androgen reseptor uttrykk, men ikke stor betydning. In vitro, viste vi at rekombinant Wnt5a redusert invasjon av 22Rv1 og DU145 cellene og at siRNA knockdown av endogen Wnt5a protein ført til økt invasjon av 22Rv1 og LNCaP celler.
Konklusjon
Vi viser at bevart overekspresjon av Wnt5a protein hos pasienter med lokalisert prostatakreft spår et positivt resultat etter operasjonen. Dette funnet sammen med våre in vitro data som viser evne Wnt5a å svekke de invasive egenskaper av prostatakreftceller, antyder en svulst supressoreffekten Wnt5a i lokalisert prostatakreft. Disse resultatene indikerer at Wnt5a kan brukes som en prediktiv markør, og at det også er en plausibel terapeutisk mål for behandlingen av prostatakreft
relasjon:. Syed Khaja AS, Helczynski L, Edsjö A, Ehrnström R, Lindgren A, Ulmert D, et al. (2011) forhøyet nivå av Wnt5a Protein i lokalisert prostatakreft Tissue er assosiert med bedre resultat. PLoS ONE 6 (10): e26539. doi: 10,1371 /journal.pone.0026539
Redaktør: Alana L. Welm, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, USA
mottatt: 17 april 2011; Godkjent: 28 september 2011; Publisert: 24 oktober 2011
Copyright: © 2011 Syed Khaja et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av den svenske Cancer Foundation (AB og TA), det svenske forskningsrådet (AB og TA), Søderberg stiftelser (TA), Malmö universitetssykehus forskningsstiftelser (AB og TA), Gunnar Nilsson Cancer Foundation (AB og TA ) og EU 6. rammeprogram (P-Mark), Grant antall LSHC-CT-2004-503011. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: en patentsøknad har er sendt med Anders Bjartell og Tommy Andersson som oppfinnere der de, basert på de foreliggende resultatene, foreslår å behandle pasienter med prostatakreft med svulster med en lav endogen Wnt5a uttrykk med et stoff som rekonstruerer Wnt5a signalering i prostata svulster i slike pasienter. Dette programmet endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den ledende kreft påvirker menn av alle raser og nest største dødsårsaken i utviklede land [1]. Androgener og androgen reseptor (AR) spiller viktige roller, ikke bare i normal utvikling, vekst og funksjon av prostatakjertelen, men også i kreftutvikling og progresjon av PCa [2]. Til å begynne med PCA-celler er vanligvis AR avhenger for sin vekst og overlevelse, og følgelig svare på androgen deprivasjon (ADT), men i senere stadier PCA celler blir androgen-ufølsom, og fatal kastrering resistent prostatakreft (CRPC) utvikler [3] . De molekylære mekanismene som er ansvarlige for overgang til CRPC er dårlig forstått, men den mest konsekvente endringen i forbindelse med kastrering-resistente vekst i global genekspresjonsprofiler av PCA-xenografter ble en økning i AR mRNA-nivåer [4]. Øket ekspresjon av AR er ansett for å være en viktig funksjon i CRPC, og det har vist seg som et resultat av enten mutasjon eller forsterkning av AR eller ved øket ekspresjon forårsaket av deregulerte vekstfaktorer eller flere ko-regulatorer [5]. Selv om vi har tilgang til prognostiske faktorer i PCA inkludert Gleason grad, TNM stadium, kirurgisk margin status og serum PSA nivå, det er et presserende behov for å identifisere nye biomarkører, som i betydelig grad kan forbedre, enten alene eller i kombinasjon med andre biomarkører, vår evne til å forutsi utfallet i PCA-pasienter. Tidligere studier har antydet en mulig sammenheng mellom AR og Wnt-β-catenin signalveier under utvikling og progresjon av PCa [6], [7].
Nylig oppmerksomhet har blitt trukket til rollen Wnt proteiner og Wnt signalering ved PCA. Navnet Wnt kommer fra «vingeløse relaterte MMTV integrering site» og ble opprinnelig foreslått av Nusse og medarbeidere i 1991 [8]. Wnt proteinene utgjør en familie av nitten utskilte glykoproteiner som spiller viktige roller i løpet av utvikling og i celle skjebne spesifikasjon, cellemigrering og celle polaritet [9], [10]. Wnt proteiner kan deles inn i minst to underfamilier; kanoniske Wnts som fremmer β-catenin-mediert transkripsjon og ikke-kanoniske Wnts. Wnt signalering forekomme i en auto- eller parakrin måte gjennom binding av utskilt wnt molekyler til syv transmembrane frizzled reseptorproteiner (FZ) i fravær eller nærvær av ko-reseptorer så som LRP 5/6 og ROR [10]. Flere Wnt signalkomponenter har også vært innblandet i dannelsen av kreft hos mennesker; overekspresjon av Wnt-1 ble observert i melke epitelial adenokarsinom [11] og i flere PCA cellelinjer og PCA vev. Wnt-1 uttrykk positivt korrelert med Gleason score, β-catenin og med serum PSA nivå [12]. I tillegg, basert på bestemmelsen av Wnt5a mRNA-nivåer i prostata tumorer har det blitt foreslått at unormal ekspresjon av ikke-kanonisk Wnt5a er involvert i PCa [13].
Wnt5a, en av de mest studerte ikke- kanoniske Wnts, er en essensiell Wnt protein ved indusering og styring av Wnt /plane celle polaritet (PCP) og Wnt /Ca
2 + trasé [14], [15]. I tillegg Wnt5a har ikke bare vist seg å motvirke den Wnt /β-catenin veien, men også, i bestemte sammenhenger, for å aktivere denne veien [16]. Muligheten for Wnt5a å indusere forskjellige nedstrøms signaleringshendelser kan i det minste delvis forklare tilstedeværelsen av rapporter som tyder på en tvetydig natur Wnt5a; ha enten en tumor suppressor eller svulst fremme funksjon avhengig av kontekst og tumortype [16]. Tidligere studier har vist at Wnt5a er nedregulert i visse maligniteter, inkludert kolorektal cancer (proteinekspresjon) [17], neuroblastom (mRNA-nivåer) [18], invasive ductal brystcarsinomer (proteinekspresjon) [19], [20] og leukemier (mRNA nivåer) [21], noe som indikerer en tumor undertrykkende effekt av Wnt5a. Interessant, har andre rapporter i stedet foreslått en onkogen effekt av Wnt5a hovedsak basert på en oppregulering i brystkreftceller (mRNA nivåer) [22], magekreft (protein uttrykk) [23], melanom (protein uttrykk) [24], lungekreft og prostatakreft (mRNA-ekspresjon) [13]. Avvikende genet og protein ekspresjon av Wnt5a i PCa og eventuelle underliggende molekylære mekanismer er blitt beskrevet i tidligere rapporter [13], [25], [26], [27]. I en fersk undersøkelse, basert på Affymetrix studier av normal prostata epitelceller og kreft cellelinjer, Wang et al viste at økt transkripsjon av Wnt5a genet ved PCA skyldtes hypometylering; noe som antyder at epigenetisk regulering av Wnt5a ekspresjon kan være av betydning i PCa progresjon [28]. Noen konklusjon laget av data fra Affymetrix analyse uten en samtidig analyse av Wnt5a protein uttrykk er farlig siden Wnt5a mRNA har en lang untranscribed 3′-regionen åpen for translasjonell regulering. Data som støtter en slik translasjonell regulering av Wnt5a protein uttrykk har tidligere blitt rapportert [19], [29].
Nyere studier har vist økt Wnt5a og proteinnivåer ved PCA forhold til godartet vev [25], [26] . Yamamoto et al demonstrerte
in vitro Hotell som knockdown av Wnt5a redusert invasive egenskapene til DU145, og over-uttrykk for Wnt5a stimulert invasjon av PC3 celler [25]. I motsetning til dette, Wang Q og medarbeidere viste at rekombinant Wnt5a induserte ikke en øket bevegelighet i de samme PC3-celler [26]. I tillegg har det blitt vist ved immunhistokjemi (IHC) som Wnt5a ekspresjon korrelerte med Gleason ballen ≥8 i 24 pasienter fra en kohort av 98 PCA-pasienter som hadde gjennomgått radikal prostatektomi. Dette kan tyde på at Wnt5a fremmer aggressivitet, siden pasienter med lave Wnt5a nivåer hadde en bedre tilbakefall overlevelse sammenlignet med pasienter med høye Wnt5a nivåer [25].
Motstridende rapporter om rollen Wnt5a ved PCA progresjon og sparsom informasjon om Wnt5a uttrykk i forhold til klinisk utfall, oppfordret oss til å undersøke protein uttrykk for Wnt5a i en stor populasjonsbasert kohort og dens mulige rolle å spå utfallet etter kirurgi for lokaliserte og overveiende lav grad (91%) PCa. Denne undersøkelsen ble supplert med
in vitro
eksperimenter for å utforske mulige årsaker til evnen til Wnt5a å fungere som en prediktiv biomarkør for denne pasientkategori. I denne studien fikk vi bekreftet at Wnt5a proteinnivåene ble oppregulert ved PCA forhold til godartet vev, men vi fant at økt Wnt5a protein uttrykk hatt en positiv effekt på resultatet i PCA pasienter, som pasienter med høye Wnt5a proteinnivåer hadde et bedre resultat sammenlignet med pasienter med lave Wnt5a nivåer etter radikal prostatektomi. I god avtale, også fant vi ut at denne evnen Wnt5a å positivt påvirke utfallet i PCA pasienter kan være på grunn av sin evne til å hemme invasjon av PCA celler uten å begynne å påvirke deres spredning
in vitro
. Tilsetting av Foxy5 (en Wnt5a ligne peptid) også redusert invasjon, men ikke spredning av disse cellene.
Resultater
Immunhistokjemisk evaluering av Wnt5a, AR, Ki-67 og VEGF
En vev microarray (TMA) konstruere med like kjerner av både godartede og ondartede vev fra 503 pasienter (pasienter enes egenskaper i tabell 1) som hadde gjennomgått radikal prostatektomi, ble immunfarget for Wnt5a, AR, Ki-67 og VEGF (fig. 1A- F). Wnt5a protein ekspresjon ble påvist i det cytoplasmatiske rommet av epitelceller og noen ganger i stromale celler av både kreft og prøver godartede vev. Cancer vev fra de fleste pasientene (82%) viste en homogen sterk cytoplasmatisk farging, mens et flertall av godartede vev (65%) viste svak immunoreaksjon som støtter at en oppregulering av Wnt5a protein forekommer i kreftvevet. Resultater fra manuell scoring av cytoplasmatisk fargeintensitetene i maligne og benigne epiteliale celler er illustrert i fig. 1G-I. Forskjellen mellom Wnt5a fargingsintensitet i kreft og godartede prøvene ble funnet å være signifikant (p 0,0001) når paret Wilcoxon rank sum test ble utført. I nesten 80% av pasientene fant vi sterke Wnt5a fargeintensitet (vilkårlig enhet 2 eller 3) i kreft kjerner, mens bare 35% av pasientene viste sterk farging i godartede vevsprøver. Nærmere om scorings data fra Wnt5a, AR, Ki-67 og VEGF farget kjerner er gitt i tabell 2.
A B) Panelene viser representative Wnt5a immunostainings i godartede og kreftvev områder fra samme pasient C D) Panelene viser representative atom AR immunostainings i godartet og kreft vev områder E F) Panelene disposisjon VEGF farging i gunstige og kreftvev områder fra samme pasient. Alle innlegg i panelene avbilder forstørrelse (40 ×) bilder av området som er angitt av pilen i den store bilde sett på 15 × forstørrelse. G, H I) Panelene skissere grafiske illustrasjoner av Wnt5a, AR og VEGF protein uttrykk i gunstige og kreftprøver i PCA pasienter. Baren i hvert panel skisserer 100 mikrometer.
Androgen reseptor farging var overveiende kjernekraft som forventet og generelt mer intens i kreft sammenlignet med godartede vevsprøver som beskrevet i tabell 2. sytti prosent av tumor kjernene ble intenst farget sammenlignet med 53% av benigne kjerner.
Nuclear Ki-67-ekspresjon ble anvendt som en markør spredning (figur S1 A, B, C, D). Det var signifikante forskjeller i Ki-67-farging mellom kreft og godartede kjerner, som 14% av godartet kjernene var negative for Ki-67, mens bare 5% av kreft kjernene ble Ki-67 negativ. Når det gjelder positive Ki-67 atom flekker, nesten 9% av kreft kjernene hadde en flekker score mer enn to, mens det tilsvarende tallet for de godartede kjernene var bare 2,5% (tabell 2).
VEGF uttrykk, som en surrogatmarkør for angiogenese, ble observert i cytoplasma av både godartede og ondartede epitelceller, med kreft områder som viser høyere farging sammenlignet med godartet. Mer enn 73% av kreft kjernene viste sterk VEGF farging, mens bare 51% av de godartede kjernene viste sterk immunreaksjons (tabell 2).
Forskjellen mellom AR, Ki-67 og VEGF fargingsintensitet i kreft versus godartede kjerner var statistisk signifikant (p 0,0001). når Wilcoxon rank sum test ble utført (tabell 2)
Korrelasjonen av Wnt5a vev uttrykk med AR, Ki-67 og VEGF
i den foreliggende kohort Wnt5a uttrykk viste en positiv og statistisk signifikant korrelasjon med VEGF uttrykk (Spearmans rho (ρ) = 0,396, p 0,0001), svak, men likevel statistisk signifikant korrelasjon med AR uttrykk (ρ = 0,159, p = 0,007) og Ki-67 uttrykk (ρ = 0,233, p 0,0001) (tabell 3). Mesteparten av pasientene (220/365, 60%) med sterke Wnt5a immunofarging i kreftvev oppviste også intens AR farging (tabell 4). En lignende trend ble observert når Wnt5a og VEGF ble sammenlignet; 65% (219/339) av kreft kjernene viste sterk farging for både Wnt5a og VEGF. Vi fant ingen forskjeller i Wnt5a farging intensitet når vi sammenlignet pasientgrupper med ulike Gleason score. Blant pasienter med patologisk Gleason scorer opptil 3 + 4 ( «low grade»), 81% hadde forhøyet Wnt5a protein uttrykk sammenlignet med 86% av pasientene med høyere Gleason score (data ikke vist). Tilsvarende ble observert noen sammenheng mellom Wnt5a farging og patologisk T scenen, klinisk T scenen, kirurgisk margin status eller sædvæske invasjon (data ikke vist).
Wnt5a protein uttrykk og prediksjon av klinisk utfallet
Deretter vurderte vi om Wnt5a protein uttrykk i kreftvev analysert etter radikal prostatektomi for lokaliserte PCa kunne forutsi klinisk utfall målt ved tid til biokjemisk tilbakefall (BCR), ved hjelp av PSA 0,2 ng /ml i blodet prøver med en bekreftende verdi som en surrogatmarkør. Wnt5a protein uttrykk som illustrert ved IHC var signifikant høyere hos kreft områder sammenlignet med benigne områder (fig. 1, tabell 2). Interessant, da Kaplan-Meier kurve ble plottet mellom Wnt5a protein uttrykk og BCR fritiden, et positivt resultat (p = 0,001) var tydelig for pasienter med høy Wnt5a protein uttrykk i forhold til pasienter med lav Wnt5a protein uttrykk (Fig. 2A). Som ventet ble lavt uttrykk av AR (figur S2C) og Ki-67 (figur S2B) forbundet med positivt resultat, mens VEFG uttrykk ikke var signifikant assosiert med BCR fritid (figur S2D).
Alle krefttilfeller ble delt inn i 2 grupper basert på fargeintensitet av Wnt5a, Ki-67, AR og VEGF. De lave grupper inkludert svulster med score 0 eller 1 og de høye grupper inkludert svulster med score 2 eller 3. A) Panelet viser overlevelseskurver plottet mellom høy eller lav Wnt5a protein uttrykk og BCR fritiden. B) Panelet viser overlevelseskurver plottet mellom høy eller lav Wnt5a og høye og lave Ki-67 protein uttrykk. Følgelig ble tumorene delt inn i følgende 4 grupper; Wnt5a lav Ki-67 lav, Wnt5a lav Ki-67 høy, Wnt5a høy Ki-67 lav og Wnt5a høy Ki-67 høy. C Panelet viser overlevelseskurver plottet mellom høy eller lav Wnt5a og høye og lave AR protein uttrykk. Følgelig ble tumorene delt inn i følgende 4 grupper; Wnt5a lav AR lav, Wnt5a lav AR høy, Wnt5a høy AR lav og Wnt5a høy AR høy. D) Panelet viser overlevelseskurver plottet mellom høy eller lav Wnt5a og høye og lave VEGF protein uttrykk. Følgelig ble tumorene delt inn i følgende 4 grupper; Wnt5a lav VEGF lav, Wnt5a lav VEGF høy, Wnt5a høy VEGF lav og Wnt5a høy VEGF høy. I alle paneler høy ekspresjon av et protein som er angitt ved ↑ mens ↓ indikerer lav ekspresjon. Hvert trinn i svingene representerer tilbakefall ved PCA. De oppgitte p-verdier på nedre høyre side av panelene viser signifikante forskjeller i utfall mellom den mest gunstige gruppen og den minst gunstige gruppen (se tabell 4 for mer informasjon).
Videre vi undersøkt om Wnt5a protein uttrykk også kunne forutsi utfallet når kombinert med noen av de andre vev biomarkører. Den beste prediksjon modellen ble oppnådd når Wnt5a protein uttrykk ble kombinert med enten AR eller Ki-67 uttrykk (Fig 2B, C.), Som pasienter med høy Wnt5a og lav AR eller lav Ki-67 uttrykk viste bedre tilbakefall overlevelse (p 0,0001), mens pasienter med lav Wnt5a ekspresjon og høy AR eller høy Ki-67 ekspresjon hadde den verste utfallet etter operasjonen. Pasienter med høy Wnt5a og lav VEGF uttrykk hadde bedre resultat sammenlignet med andre grupper (p = 0,003) eller hver markør alene. Men kombinasjonen av høy Wnt5a og lav VEGF var dårligere enn når Wnt5a ble analysert i kombinasjon med AR eller Ki-67 som indikerer at VEGF i ikke så sterk som AR eller Ki-67 for å forutsi utfallet i kombinasjon med Wnt5a i den foreliggende sammenheng ( fig. 2D). Cox regressional analyse ble brukt for multivariate analyser og avslørte at Wnt5a uttrykk, Gleason score og patologisk T scenen var uavhengige faktorer som påvirker tilbakefall overlevelse ved PCA (tabell 4).
Wnt5a protein uttrykk og dens virkninger på invasjon og spredning av PCa cellelinjer
Våre data viser at pasienter med høyt Wnt5a protein uttrykk ha mer gunstig utfall i forhold til pasienter med lav Wnt5a protein uttrykk. For bedre å forstå dette med å finne Wnt5a protein uttrykk i en SV40 udødelig normal human prostata epitel cellelinje (PNT2) og fire forskjellige PCA cellelinjer ble undersøkt. PNT2 cellene hadde et lavt uttrykk av endogen Wnt5a protein mens det var betydelig Wnt5a uttrykk i PCA cellelinjer LNCaP og 22Rv1 (Fig. 3A). Disse dataene er i samsvar med våre funn av Wnt5a protein uttrykk i tiden analysert kohort av PCa og en fersk undersøkelse også utført på normal prostata epitel og PCA cellelinjer [26]. Imidlertid analyser av de to mer aggressive PCA-cellelinjer (PC3 og DU145) viste meget lav ekspresjon av Wnt5a protein, sammenlignes med den normale PNT2 prostata epitelisk cellelinje (Fig. 3A). Interessant nok, Wnt5a protein nivåer matchet med AR protein uttrykk i disse cellelinjer (fig. 3A).
A) Dette panelet viser endogene Wnt5a og AR uttrykk i fire indikert PCA cellelinjer (LNCaP, 22Rv1 , DU145 og PC3-celler) og i løpet av en immortalisert human prostata epitelcellelinje (PNT2 celler). Wnt5a proteinbånd ble identifisert ved å kjøre rWnt5a i parallell på den samme gelen. Blottene ble reprobed for β-actin som lasting kontroll. De presenterte blotter er representative for 4 separate eksperimenter. B) Panelet skisserer den relative invasjonen av LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC3 cellelinjer etter 24 timer i fravær eller nærvær av rWnt5a (0,4 ug /ml) i analysen beskrevet i Materialer og metoder. Resultatene er gitt som gjennomsnitt ± SEM fra 5 separate eksperimenter. Forskjellene i invasjon mellom cellene behandlet med bærer alene eller sammen med rWnt5a ble evaluert for statistisk signifikans (p = 0,0001 for 22Rv1 og p 0,0001 for DU145). C) Panelet skisserer spredning av LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC3 cellelinjer etter 24 timer i fravær eller nærvær av rWnt5a (0,4 ug /ml). Resultatene er gitt som gjennomsnitt ± SEM fra 5 separate eksperimenter. Det var ingen signifikante forskjeller i spredning mellom kontroll og rWnt5a behandlede celler. D) Et panel representerer den relative invasjonen av 22Rv1 og DU145-celler etter 24 timer i fravær eller nærvær av Foxy5 (100 uM) ved anvendelse av samme analyse som i panel B. Forskjellen i invasjon mellom cellene behandlet med bærer alene eller sammen med Foxy5 var evaluert for statistisk signifikans (p = 0,01 for 22Rv1 og p = 0,0003 for DU145). E) Panelet viser effekten av siRNA knockdown av Wnt5a i LNCaP og 22Rv1. Blottene ble reprobed for α-tubulin som lasting kontroll. De presenterte blotter er representative for 4 separate eksperimenter. F) Panelet skisserer den relative invasjonen av LNCaP og 22Rv1 celler etter behandling med Wnt5a Si-RNA (Wnt5a knockdown) eller kryptert siRNA (kontroll), i den samme assay som tidligere ble brukt i panel B. Resultatene er gitt som gjennomsnitt ± SEM fra 5 separate forsøk. Forskjellen i invasjonen mellom kryptert og si-Wnt5a slått ned celler var statistisk signifikant for begge cellelinjene (p 0,0001).
Vi brukte fire kreftcellelinjer (LNCaP, 22Rv1, PC3 og DU145 ) for våre påfølgende invasjonen eksperimenter. Tilsetning av rekombinant Wnt5a (rWnt5a) reduserte invasiv oppførselen til både 22Rv1 og DU145 kreftceller (Fig. 3B). Verken LNCaP eller de PC3 cellene reagerte på rWnt5a med en endring i deres invasive atferd. Resultatet med PC3 cellene er i henhold til en nylig publisert rapport fra Wang et al [26], hvor PC3 cellene ikke svare på tillegg av rWnt5a i en migrasjons såret scratch analysen. LNCaP-celler er kjent for å ha en meget lav invasjon aktivitet, og dette kan forklare hvorfor disse cellene ikke reagere når rWnt5a ble tilsatt. Imidlertid, når Wnt5a ekspresjon i LNCaP-celler ble slått ned ved hjelp av Si-RNA (fig. 3E), var det en betydelig økning i den invasive oppførselen av LNCaP-celler (fig. 3F). I tillegg Wnt5a knockdown ved si-RNA i 22Rv1 kreftceller også resultert i økt invasjon av disse cellene (Fig. 3E-F og figur S4).
For å finne ut om nedgangen i invasjonen av 22Rv1 og DU145 cellelinjer med tillegg av rWnt5a var på grunn av reduksjon i proliferasjon av disse cellelinjene, undersøkte vi formeringshastigheten i PCA-cellelinjer. Tilsetting av rWnt5a ikke har noen vesentlig effekt på spredningen i disse cellelinjene i løpet av 24 timer som brukes for invasjonen analysen (fig. 3C).
Siden rWnt5a redusert invasjonen av 22Rv1 og DU145 cellene, invasjon analysen var også utføres i disse cellelinjer ved bruk av Foxy5 som er et heksapeptid avledet fra aminosyresekvensen til Wnt5a protein og tidligere vist å hemme motilitet av brystkreftceller som rWnt5a [30]. Foxy5 faktisk trykt invasive egenskapene til disse to PCA-cellelinjer (fig. 3D), og denne reduksjon i invasjonen var ikke forårsaket av redusert proliferasjon som Foxy5 ikke påvirke statusen proliferasjon i disse cellelinjene (BrdU assay, data ikke vist).
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er dette langt bare én studie med et begrenset antall pasienter har vist en rolle Wnt5a protein å forutsi klinisk utfall ved PCA [25]. Dette oppfordret oss til å utføre en studie på Wnt5a protein uttrykk i en større kohort av veldefinerte PCA pasienter med lokalisert og overveiende lav grad av sykdom og relatere resultatene med uttrykket av andre kjente vev biomarkører og viktigst med BCR. Denne studien involverte en rekke av 503 PCA pasienter som hadde gjennomgått radikal prostatektomi under 1988-2003 i Skåne universitetssykehus, Malmö, Sverige med en gjennomsnittlig oppfølgingstid på 41,6 måneder (range 1,51 til 205,90). Denne pasienten kohorten er store, populasjonsbasert, og pasientene er godt karakterisert (tabell 1). I TMA glir benigne og maligne vev fra den samme pasienten er til stede i duplikater. Basert på Gleason karakterer pasientmateriale ble videre preget inn i lavgradige kreft (Gleason scorer opptil 3 + 4) og høy grad av kreft (Gleason 4 + 3 eller høyere). Nesten 89% av pasientene som ble klassifisert som lav grad av kreftformer, noe som er å forvente i en gruppe pasienter med lokalisert PCa egnet for radikal prostatektomi. Som en kontroll av den kliniske materiale, har vi fastslått at det var en statistisk signifikant forskjell i kliniske resultatet mellom pasienter med lav kvalitet og høy grad av kreft ved bruk av Kaplan-Meier-analyser av BCR-overlevelse (fig S2A). Ytterligere kontroll av den kliniske materiale også åpenbart at det samme var tilfellet når proliferasjon ble undersøkt ved Ki-67 ekspresjon, en biomarkør validert vev i PCa [31]. Pasienter med høy Ki-67 uttrykk hadde redusert tilbakefall overlevelsestid sammenlignet med pasienter med lavt antall Ki-67 uttrykker tumorceller (Figur S2B).
I den foreliggende TMA studien brukte vi en godt karakterisert -huset antistoff som er spesifikt for Wnt5a som tidligere beskrevet i brystkreft studier [20]. Her, også utførte vi konkurranse med rWnt5a for å bekrefte spesifisiteten av antistoffet på prostatavev seksjoner (figur S3). Fargeintensitet ble redusert fra antistoff alene til når antistoffet og rWnt5a ble anvendt og allerede ved et molforhold på 01:10 vi funnet en tydelig reduksjon av immunfarging. I tillegg gjennomførte vi immunocytochemistry (Utfyllende Materialer og Metoder S1) av Wnt5a i prostatakreft cellelinjer (LNCaP, 22Rv1 og DU145) etter forbehandling med enten eggerøre eller Wnt5a si-RNA (Figur S4A, B, C, D, E) . Først observerte vi cytosolic farging av Wnt5a lik den som er observert i prostata kreft vev og for det andre, intensiteten av Wnt5a farging sunket betraktelig i de Wnt5a si-RNA behandlede celler sammenlignet med de som ble behandlet med egge si-RNA. Behandling med Wnt5a siRNA redusert graden av Wnt5a farging til et nivå tilsvarende det man ser i de vestlige blotter (fig. 3E). Analyse av vår TMA viser klart at Wnt5a protein-ekspresjon ble øket til lokal PCa sammenlignet med benign vev fra de samme pasientene, en effekt som fremviste en sterk statistisk signifikans (p 0,0001 Fig. 1 A, B 4 + 3) PCA tilfeller. Hvis disse tilsynelatende motstridende resultater indikerer en klasse-urelaterte funksjon Wnt5a eller bare reflekterer de individuelle egenskapene til de to svulster som cellelinjer ble avledet er vanskelig å si. Som et alternativ forklaring, kan antall høyverdig PCa i nåtiden kohort (n = 41) være for liten til å oppdage en klasse-relatert Wnt5a nedregulering.
Vi har også funnet økt uttrykk av AR, Ki-67 og VEGF-proteiner i lokaliserte PCa vev sammenlignet med benign vev (fig. 1 C-F, H-i, tabell 2). For å få et første innblikk i mulige mekanismer for hvordan Wnt5a funksjoner i PCA utførte vi statistiske analyser av mulige sammenhenger mellom Wnt5a protein uttrykk og som av AR, Ki-67 og VEGF, alle tre godt kjent for å være oppregulert i progressiv PCa. Wnt5a signifikant korrelert med VEGF, en markør for angiogenese, noe som indikerer at Wnt5a kan være relatert til tumorvekst (tabell 3). I denne forbindelse våre data er noe forskjellig fra de rapporterte fra analyser av ikke-småcellet lungekreft hvor Wnt5a ikke korrelerer med VEGF uttrykk i kreftvev men med VEGF i omkringliggende stromal vev [32]. Videre Wnt5a ekspresjon i PCa vev i vårt studium svakt, men signifikant assosiert med AR ekspresjonen (tabell 3). Proteinekspresjon analyse ved western blot indikerte at Wnt5a nivåer og AR ekspresjon i en immortalisert prostata epitelcellelinje og 4 forskjellige PCA cellelinjer sammenliknes med hverandre, noe som indikerer en mulig sammenheng mellom Wnt5a og AR i PCa (fig. 3A). Til tross for disse data, har det nylig blitt vist at Wnt5a inhiberer AR transkripsjonen aktivitet i 22Rv1 celler når disse cellene ble transfektert med et plasmid Wnt5a [33]. Til slutt, Wnt5a protein-ekspresjon ble svakt, men signifikant assosiert med Ki-67 ekspresjonen (tabell 3). Dette resultatet er i samsvar med rapporten på ikke-småcellet lungekreft, hvor intratumoral Wnt5a ekspresjon signifikant korrelert med Ki-67 proliferasjon indeks [32], men i motsetning til studien på leverkreft hvor Wnt5a har en tumor undertrykkende effekt og tap av Wnt5a har en sterk sammenheng med høy Ki-67 spredning index [34]. Tatt sammen disse dataene indikerer at rollen Wnt5a signalering i reguleringen av tumor celleproliferasjon er usikkert.
I denne undersøkelsen fant vi ikke en sammenheng mellom Wnt5a protein uttrykk og Gleason score, selv om sistnevnte mai være den beste tilgjengelige prognostisk indikator på resultatet ved PCA [35]. Imidlertid har Gleason scoring sine begrensninger på grunn av interobserver variabilitet blant patologer, og dermed er det et behov for komplementære markører.
