Abstract
Bakgrunn
Tensin familie av intracellulære proteiner (Tensin1, – 2, -3 og -4) er tenkt å fungere som bindeledd mellom den ekstracellulære matriks og cytoskjelettet, og dermed formidler signalering for cellen form og bevegelighet. Feilregulering av Tensin uttrykk har tidligere vært innblandet i menneskelig kreft. Her har vi for første gang evaluert betydningen av alle fire Tensins i en studie av menneskelig nyrecellekreft (RCC), samt analysert den biologiske funksjonen til Tensin3.
hovedfunnene
uttrykk for Tensin2 og Tensin3 på mRNA og proteinnivåer var i stor grad fraværende i et panel av ulike menneskelige kreftcellelinjer. Kvantitativ RT-PCR analyse viste mRNA uttrykk av alle fire Tensin gener for å bli betydelig nedregulert i humane nyre tumorer (50-100% reduksjon i forhold til normal nyre cortex;
P
0,001). Videre mRNA uttrykk for Tensins for det meste positivt korrelert med hverandre og med en negativ tumor grad, men ikke tumorstørrelse. Immunhistokjemisk analyse viste Tensin3 å være til stede i cytoplasmaet av rørformede epitel i normale humane nyre seksjoner, mens ekspresjonen var svakere eller fraværende i 41% av nyre tumorer. En undergruppe av tumorsnitt viste en fortrinnsrett plasma membran uttrykk for Tensin3, som i klare celle RCC pasienter ble korrelert med lengre overlevelse. Stabil uttrykk for Tensin3 i HEK 293 celler markert hemmet både cellemigrasjon og matrise invasjon, en funksjon uavhengig av antatte fosfatase-aktivitet i Tensin3. Motsatt, siRNA knockdown av endogen Tensin3 i humane kreftceller økt migrasjon betraktelig.
Konklusjoner
Våre funn tyder på at de Tensins kan representere en ny gruppe av metastasedempere i nyrene, tap av noe som fører til større svulst cellemotilitet og påfølgende metastasering. Videre kan tumorigenese i den menneskelige nyre lettes ved en generell nedregulering av Tensins. Derfor kan anti-metastatiske behandlinger nytte av å gjenopprette eller bevare Tensin uttrykk i primære svulster
Citation. Martuszewska D, Ljungberg B, Johansson M, Landberg G, Oslakovic C, Dahlbäck B, et al. (2009) Tensin3 er en negativ regulator av celle migrasjon og alle fire Tensin familiemedlemmer er nedregulert i Human nyrekreft. PLoS ONE 4 (2): e4350. doi: 10,1371 /journal.pone.0004350
Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 20 august 2008; Godkjent: 15 desember 2008; Publisert: 04.02.2009
Copyright: © 2009 Martuszewska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Vetenskaps Council (Vetenskapsrådet), den Cancer Foundation, Alfred Österlund Trust, Malmö universitetssykehus HF, Malmö universitetssykehus Cancer Trust, Greta og Johan Kock Trust, Crafoord Trust, og Royal physiographic Society i Lund. D.M. ble støttet av et fellesskap fra Anna-Greta Crafoord Trust. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de Tensins utgjør en familie av intracellulære proteiner som kommer i forgrunnen som nye regulatorer av cellemotilitet og vekst. Den Tensin familien består av fire medlemmer: Tensin1, Tensin2, Tensin3 og Tensin4 (TNS1, TNS2, TNS3, TNS4) hver med diskrete uttrykk mønstre i menneskekroppen [1], [2]. Basert på deres vanlige domener, er Tensins har potensial til å kommunisere med plasmamembranen (C1-domene), så vel som binder til tyrosiner (SH2 og PTB domene) i griner [3] og reseptor-tyrosin-kinaser (RTK) [1].
i tillegg Tensins 1-3, men ikke -4, inneholde en fosfatase (PTPase) -C2 domene par som er homolog med den i PTEN tumor suppressor protein [4], [5]. Imidlertid potensialet lipid PTPase aktivitet av Tensins 1-3, samt deres mulige interaksjoner med aktin cytoskjelettet, gjenstår å bestemmes. Tensin1 var det første element identifisert, og er lokalisert til fokal adhesjon i celler [6]. Vi identifiserte Tensin2 (også kjent som C1-TEN, TENC1) som en bindende partner for Axl RTK gjennom sitt SH2-PTB region [1]. Tensin3 har tilnærmet samme domene organisasjon som C1-TEN, og samhandler med EGF reseptoren [7]. Tensin4 er en kortere protein som ikke forventes å interagere med cytoskjelettet, mens den inneholder SH2-PTB domener som ligner på de andre Tensins [8].
Den funksjonelle konsekvens av Tensin interaksjoner antyder regulering av membran reseptor signalisering som er knyttet til kontroll av cytoskeletal dynamikk. Dette har derfor betydning for cellemotilitet i metastatisk prosess. For eksempel, i brystkreftceller, ble Tensin3 vist seg å forankre integriner for cytoskjelettet, slik at cellen mindre motile og derved mindre i stand til metastasizing [9]. Omvendt, stimulering av epidermal vekstfaktor (EGF) oppregulerer Tensin4, som er en kortere protein som kunne mangle actin-bindende regioner, men som fortsatt kommuniserer med integriner. Dette mobilisering av Tensin4 resulterer i sin forskyvning av Tensin3 fra inte, og dermed destabilisere cytoskjelettet og styrke cellemotilitet. Vi har rapportert at Tensin2 uttrykk i nyreceller hemmer celledeling, overlevelse og migrasjon, samtidig med en selektiv undertrykkelse av Akt signalveien [5]. Til slutt, er en interaksjon tilsynelatende er felles for alle fire Tensins at med DLC-en tumor suppressor protein, som kan være en mediator for de potensielle antitumoreffekter av Tensins [10] – [12]
. USA, er 54390 nye tilfeller av nyrekreft spådd til å skje i 2008, forårsaker anslagsvis 13010 dødsfall [13]. Nyrecellekarsinom (RCC) er en kreft som stammer fra nyre epitel og står for 85% av nyrekreft og tilhørende dødelighet. RCC kan videre deles inn i ulike undergrupper: konvensjonell eller klarcellet RCC (ccRCC), som representerer det store flertallet av RCC tilfeller, etterfulgt av papillær (pRCC) og chromophobe (chRCC). Også inkludert i denne studien er oncocytoma, som er en ikke-RCC, godartet svulst type. Hver av disse tumortyper har en distinkt patogenese. For eksempel er to tredjedeler av ccRCC tilfeller forbundet med en defekt i den von Hippel-Lindau (VHL) tumorsuppressorgen [14].
imidlertid den epiteliale celletransformasjoner som oppstår i felles for disse tumortyper involverer flere prosesser, blant annet mutasjoner som gjør at forholdene gunstige for kreft celle overlevelse, spredning og migrasjon. I tillegg er forbedret kreftcelle motilitet et hovedtrekk i tidlig metastatisk prosess. Som en fjerdedel av RCC pasienter til stede med lokalt invasiv eller metastatisk sykdom, er det viktig å identifisere hvilke faktorer og mekanismer som ligger til grunn for metastatisk prosess.
nyre er det organet der de fleste Tensins er fortrinnsvis uttrykt [1], [6], [7]. Sletting av
Tensin2
genet ble vist å være bak en musemodell for nefrotisk syndrom [15], og knockout-mus for Tensins -1 og -3 utstillings nyre rørformet cyste dannelse og nyresvikt [16], [17 ]. Derfor, er det et tydelig behov for å undersøke Tensins for deres ekspresjon og funksjon i det humane nyre i både normale og sykdomstilstander. Målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle hele Tensin familien i menneskelig RCC.
Metoder
Cell kultur
Følgende menneskelige kreftcellelinjer ble dyrket og forberedt for QRT-PCR og Western blot analyse: bryst (MCF-7, MDA-MB231), prostata (DU145, PC3, PNT-1A), tykktarms adenokarsinom (SW480), livmorhalskreft (HeLa S3), osteosarkom (U20S), melanom (WM9, WM266-4, WM793), ikke-småcellet lungekreft (H358, H2087, H226, H727) og B-celle lymfom (U629, U2932). Forskjellige humane ikke-cancercellelinjer ble også analysert: endotelial cellelinje (EAhy926), dermale fibroblaster (AG52), nyre proksimale rørformede celler (HK-2), bryst epitelceller (MCF-10A). Celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum, 20 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft.
pasienter
studien inkluderte 260 pasienter med histopathologically bekreftet nyrecellekreft (RCC) etter nefrektomi utført ved Institutt for Urologi, Umeå universitetssykehus, mellom 1982-2003. Studien ble godkjent av etisk komité av Umeå universitet og av Institutional Review Board, og hver pasient deltok etter å gi informert samtykke. De clinicopathological kjennetegn ved pasientene er oppsummert i tabell 1.
Staging prosedyrer inkludert en fysisk undersøkelse, brystet røntgen, ultralyd og datastyrte tomografi av magen. Svulster ble iscenesatt i henhold til TNM klassifiseringssystem 2002 [18] og histopatologiske gradering ble gjort i henhold til Skinner
et al.
[19]. RCC typen ble definert i henhold til Heidelberg konsensus konferanse [20]. Tumorstørrelsen ble målt på de kirurgiske prøver og /eller datastyrt tomografi. Tumor størrelse varierte fra 0,6 cm til 25 cm (median: 7,0 cm). Venøs invasjonen ble definert som tumorinvasjon i store nyre årer, verifisert mikroskopisk i vevssnitt fra nedsatt hilum. Oppfølging av pasientene status ble vurdert minst årlig av rutinemessig klinisk oppfølging ved Umeå Universitetssykehus eller ved å kontakte pasienter direkte. I løpet av oppfølgingsperioden blant de 260 pasientene hadde 139 døde av sykdommen, 61 hadde dødd av andre årsaker, 7 var i live med sykdom, og 53 var i live og fri for sykdom. Tumor og nyrebark vev ble prøvetatt umiddelbart etter nefrektomi. Prøver fra histopathologically nonmalignant nyrebark vev fjernt fra svulsten sonen ble også oppnådd fra 48 pasienter og brukes for sammenlignende evaluering.
elektroforese og western blot
Celler ble lysert i lyseringsbuffer (1% NP -40, 1% deoksykolat, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA i PBS, pH 7,4) og separert på 5% og 8% polyakrylamid SDS-geler under reduserende betingelser og deretter overført til en PVDF-membran. Membranene ble blokkert i 3% fiskegelatin i 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl og 0,5% Tween 20 (vaskebuffer), probet med et primært antistoff mot Tensin2 (1:1000 fortynning) og Tensin3 (1:1000 ), henholdsvis i 1 time, vasket med vaskebuffer, etterfulgt av inkubasjon i 1 time med det sekundære antistoff bundet til enten pepperrot-peroksydase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP). Deretter ble membranene visualisert ved hjelp av en kjemiluminescens-metoden (HRP) eller ved reduksjon av 4-nitro tetrazoliumsalt (NBT) i nærvær av 5-brom-4-klor-3-indol-fosfat (BCIP) i 0,1 M Tris- HCl, 0,05 M MgCl
2, 0,1 M NaCl, pH 9,5 (AP).
antistoffer brukes for påvisning av Tensin2 og Tensin3 var både interne kanin polyklonale antistoffer dannet mot peptider som tilsvarer C ende av hvert protein. Det urene antisera ble renset sekvensielt, først ved affinitetskromatografi på protein A og G-sepharose kolonne og etterfølgende ytterligere affinitetsrensing ved hjelp av de immobiliserte peptid-antigenene, som tidligere beskrevet for anti-Tensin2 [5]. Anti-Tensin3 antistoffer ble testet for spesifisitet ved hjelp av cellelysatene som uttrykker full-lengde rekombinant Tensin3, så vel som ved å blokkere med den Tensin3 C-terminale peptid antigen (figur S1). En kommersiell kanin polyklonalt anti-Tensin3 antistoff (Sigma) ble anvendt for Western-blot av stabilt transfekterte Tensin3 cellelysater. Optimale fortynninger ble bestemt for western blotting.
Sanntids kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR)
For QRT-PCR-analyse for nyrekreftpasientprøver, den levedyktig område av hver svulst vevet ble brukt for å oppnå høy kvalitet RNA, ekstrahert ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Stockholm, Sverige). Fra dyrkede celler, ble total RNA ekstrahert ved CellDirect ™ One-Step QRT-PCR Kit (Invitrogen, Lidingö, Sverige). RNA-konsentrasjoner ble kvantifisert ved spektrofotometrisk måling ved 260 nm bølgelengde (DU640 spektrofotometer, Beckman Coulter, Bromma, Sverige) og RNA integritet ble verifisert ved etidiumbromidfarging av 28S og 18S rRNA etter agarosegel-elektroforese.
Ett-trinns multiplex sanntid kvantitativ RT-PCR ble anvendt, hvor forsterkning av både genet av interesse og endogene kontroll-genet ble utført sammen i samme reaksjonsrør. Gene-spesifikke primere og TaqMan prober ble kjøpt fra Applied Biosystems (Applera Sverige, Stockholm, Sverige). For hver prøve ble 40 ng av total-RNA blandet med en revers transkriptase og polymeraseenzym konsentrat-blanding, og TaqMan® MGB prober og primere ble tilsatt til denne blandingen til et sluttvolum på 25 pl. Den QRT-PCR-reaksjonen ble utført i en ABI PRISM 7900HT system (Applera Sverige, Stockholm, Sverige), ved anvendelse av de følgende veksling: revers transkripsjon i 15 minutter ved 50 ° C; 2 min ved 95 ° C, og 40 sykluser med: 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 60 sek. Hver måling ble utført i duplikat og terskelsyklusen (C
t) ble bestemt for hver forsterkerkurve.
For å generere standardkurver for kvantitativ analyse av hvert gen, en cellelinje ble valgt som var en pålitelig og kontrollert kilde for mRNA for det aktuelle genet. RNA-templat ble utelatt i negative kontroller, og en standardkurve fra seriefortynninger av total RNA fra den aktuelle cellelinjen ble oppnådd for alle løp, og hvert gen av interesse. For hver prøve ble gjennomsnittet av duplikate Ct-verdiene konverteres til ng RNA fra lineær regresjonsanalyse ved å bruke et relativt standardkurve metode under anvendelse av Excel-pakke (Microsoft, Redmond, Washington). Hver bestemt RNA-verdien ble deretter normalisert for det endogene genet referanse innholdet i den samme prøven. Fra en skjerm på 11 kandidat housekeeping gener, menneske β2-mikroglobulin (
B2M
) og glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) gener ble empirisk bestemt av oss til å være den mest robuste endogene gener for kontroll humant nyrevev og humane cellelinjer, henholdsvis (data ikke vist). Resultater oppnådd ble vilkårlig uttrykt som ng Tensin RNA /ng endogen kontroll RNA.
Northern blot analyse
Menneskelig flere vev Northern (MTN) blotter (BD Biosciences, Stockholm, Sverige), som inneholder 2 mikrogram poly A + RNA fra hver av åtte kreftcellelinjer, ble undersøkt for ekspresjon av Tensin2 mRNA. Et 1,6 kb 3-terminale cDNA-sekvensen som er felles for alle spleisevarianter av Tensin2 ble anvendt som
32P-merket probe. CDNA-sekvensen for human β-aktin ble benyttet som en kontroll probe. Radiomerking med [
32P] dCTP ble oppnådd gjennom Rediprime II DNA merkingssystemet (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Hybridisering ble utført over natten ved 42 ° C i ULTRAhyb hybridisering buffer (Ambion, Stockholm, Sverige), etterfulgt av høye ente vasker. Membraner ble utsatt for et Fosfor-Imager skjermen minst over natten før vizualization.
Immunhistokjemisk analyse av Tensin3 i menneskelige nyresvulster
For bygging av microarray (TMA), RCC seksjonene ble samlet som beskrevet ovenfor, og vist ved primær evaluering av hematoksylin /eosin-fargede objektglass før TMA preparat som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt ble to 0,6 mm diameter vev kjerner fra hver svulst blokk og ordnet i en mottaker blokk ved hjelp av en manuell vev arrayer (Beecher Inc., Sun Prairie, WI). TMA seksjoner på 4 um tykkelse ble deparaffinized og mikrobølgebehandlet for antigen gjenfinning i henhold til standardprosedyrer. Kvaliteten og robusthet RCC TMA har blitt testet for andre faktorer, og rapportert av oss tidligere [22]. De polyklonale kanin anti-Tensin3 antistoff som brukes for TMA immunofarging er beskrevet ovenfor, og ble verifisert for spesifisitet fra analyse av mock- og Tensin3-transfekterte celler, så vel som av antigen blokkering (figur S1). For farging, ble det antistoffet som brukes på et optimalt bestemt fortynning av 1:300. Deteksjon ble utført med pepperrot peroksidase bruke Dako EnVision og Techmate 500 systemer, og kontra med hematoxylin og eosin. TMA seksjoner fra 148 pasienter ble analysert og farging ble gruppert i no, lav, middels eller høy ekspresjon av Tensin3, samt i tillegg til nærvær eller fravær av farging på plasmamembranen (PM). Alle TMA ble evaluert uavhengig av to observatører
Generering av rekombinant Tensin3-uttrykke celler
Den komplette cDNA sekvens for Tensin3. (1409 aminosyrer;. NCBI tiltredelse ingen NM_022748) ble klonet inn pcDNA3 pattedyr ekspresjonsvektoren (Invitrogen Gibco, Lidingö, Sverige) for stabil ekspresjon i humane embryonale nyre (HEK) 293-celler, som tidligere beskrevet [5]. Plasmid-bærende celler ble selektert for vekst i nærvær av neomycin analoge G418 (400 ug /ml). Parallelt ble mock-transfektert cellekloner også utviklet bærer tom vektor bare, samt mutante kloner inneholdende en antatt PTPase-død mutant Tensin3 (Tns3 Mut) cDNA. Denne mutant ble generert i den antatte PTPase aktive sete av Tensin3 med cystein i posisjon 107 erstattet med et serin. Mutasjon av villtype Tensin3 cDNA i pcDNA3-vektoren ble utført ved QuikChange seterettet mutagenese (Stratagene, Amsterdam, Nederland) i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av de følgende primere (vekslende nukleotid understreket): 5′-CATGTGGTCGTCATTCACAGCAGGGGCGGGAAAGGAC-3 «(forstand ) og 5»-GTCCTTTCCCGCCCCTGCTGTGAATGACGACCACATG-3 «(antisense).
celleproliferasjon analyser
celleproliferering ble vurdert på to måter. Den første var målingen av mitokondriell aktivitet som en refleksjon av levedyktig celleantall, som tidligere beskrevet [23]. I korthet, ble separate kloner av stabilt transfekterte mock 293 celler, villtype Tensin3 celler (Tns3 wt) og Tensin3 PTPase mutante celler (Tns3 Mut) sådd ut tynt på 0,5 x 10
4 celler per brønn i en 96-brønners mikrotiterplate, i medium inneholdende 0,5% serum (dag -1). Den neste dag (dag 0), ble mediet erstattet med det inneholdende 5% serum, og cellene ble videre inkubert i opp til 7 dager. På hver påfølgende dag, ble antallet levedyktige celler målt ved deres omdannelse i løpet av 3 timer av tetrazoliumforbindelsen [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4- sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS, Sigma) i en oppløselig formazanprodukt som ble målt spektrofotometrisk ved 490 nm. Kvadruplikeres ble anvendt brønner for hver måling.
Den andre metoden for celleformering ble kvantifisering av absolutte celle tall for å generere en vekstkurve over 5 dager. Separate kloner av stabilt transfekterte mock 293 celler, hvete Tensin3 celler (Tns3 wt) og Tensin3 PTPase mutante celler (Tns3 Mut) ble sådd på 1 × 10
4 celler per brønn i en 48-brønns plate, i medium som inneholdt 0,5% serum (dag -1). Den neste dag (dag 0), ble mediet erstattet med det inneholdende 5% serum, og cellene ble inkubert i ytterligere 5 dager. På hver påfølgende dag, ble celletallet pr brønn bestemt ved trypsinering av celler fra brønnene og telling i et hemocytometer kammer. For hver klon, ble celletallet bestemt fra middelverdien telle fra ni felter. I begge forsøkene ble statistiske forskjeller mellom celletyper på hver dag bestemmes av ANOVA med Bonferroni post-hoc korreksjon.
Cell migrasjon og celle matrise invasjon analyser
En modifisert Boyden kammeret analysen systemet ble brukt for å bestemme migrasjons /haptotaxis av Tensin3-transfekterte celler som tidligere beskrevet [5]. I korthet, setter cellekultur med 8 um porestørrelse membraner (Nunclon, Roskilde, Danmark) ble forhåndsbelagt med fibronektin (10 ug /ml; Sigma, Stockholm, Sverige) på undersiden. Innsatser ble plassert i brønner av 24-brønners plater inneholdende komplett vekstmedium, og 10
5 celler ble sådd inn i hvert sett innvendig i fullstendig medium. Duplikate innskudd ble anvendt for hver enkelt cellelinje analysert. Celler ble tillatt å migrere ved 37 ° C i en cellekulturinkubator i 18 timer. Etterpå inserts ble fjernet og mellom inne aspirert. Alle cellene igjen på den øvre overflate av membranen ble tørket bort, og innsetting membraner ble kort vasket, fiksert i 10% formalin og farget med Grams krystallfiolett-oppløsning (Fluka, Stockholm, Sverige). Celler fra minimum tre høye kraft felt per insert ble tellet under lysmikroskopi (Olympus, Solna, Sverige). Statistiske sammenligninger mellom migrering av enkeltcellekloner ble utført ved ANOVA med Bonferroni post-hoc-korreksjon.
For matrise invasjon test, haptotaxis analysen ovenfor, ble modifisert slik at i stedet for fibronektin, basalmembranmassen blanding Matrigel ( BD Biosciences, Bedford, MA) ble anvendt for å dekke oversiden av cellekulturinnsatser med 8 um porer. Separate kloner av Mock og Tensin3-transfekterte 293-celler ble sådd inn i kammeret interiører i medium inneholdende 0,5% serum, mens brønnene av 24-brønners plater inneholdt komplett vekstmedium, og dermed skape en serum-gradient. Duplikate innskudd ble anvendt for hver enkelt cellelinje analysert. Celler ble tillatt å invadere matrisen og migrere gjennom til den andre siden av membranen i løpet av 30 timer ved 37 ° C. Etterpå ble cellene fiksert, farget og telles som beskrevet ovenfor.
knockdown av Tensin3 av siRNA stanse
melanoma cellelinje WM793 ble valgt for Tensin3 genet Slå som det uttrykkes den høyeste mengder Tensin3 ut av alle kreftcellelinjer testet (figur 1B). Celler ble sådd ut i 6-brønns plater 24 timer før transfeksjon siRNA. Celler ble separat tilført med 5 nM hver av tre forskjellige Tensin3 siRNA konstruksjoner, siRNA I, II (ON-TARGET pluss siRNA reagenser, Dharmacon, Täby, Sverige) og III (HP validert siRNA, Qiagen, Solna, Sverige). Negative kontroller inkludert transfeksjon blanding bare og en ikke-tie siRNA som ble vist seg å ha liten effekt på global genekspresjon (AllStars, Qiagen, Solna, Sverige). SiRNA ble blandet med Lipofectamine 2000 og OptiMem I serumfritt medium (Invitrogen, Lidingö, Sverige), og den transfeksjon blandingen ble inkubert med cellene i 24 timer. Etter denne perioden ble cellene trypsinert, telles og underkastet en migrering /haptotaxis analyse nøyaktig som beskrevet ovenfor, bortsett fra at 0,5 x 10
5 WM793 celler pr innskuddet ble anvendt, og migrering ble tillatt å skje i løpet av 16 timer.
(A) Northern blot analyse av Tensin2 (TNS2) mRNA i humane kreftcellelinjer. En menneskelig kreft cellelinjer MTN blot ble undersøkt ved høy stringens med radiomerkede cDNA spesifikke for Tensin2. Banene er som følger: 1, promyelocytisk leukemi HL-60; 2, HeLa S3; 3, kronisk myelogen leukemi K-562; 4, lymfatisk leukemi MOLT-4; 5, Burkitt lymfom Raji; 6, tykktarms adenokarsinom SW480; 7, lungekarsinom A549 og 8, melanom G-361. Det samme membran ble også undersøkt for human β-aktin (laveste panelet) for å vise lik RNA lasting. En representant blot er vist fra to uavhengige hybridiseringer. (B) mRNA uttrykk for Tensin2 og Tensin3 analysert ved QRT-PCR. Et panel av humane kreftcellelinjer samt humane normale epiteliale og endotelceller cellelinjer ble screenet for Tensin2 (TNS2) uttrykk (venstre akse, tomme barer) og Tensin3 (TNS3) uttrykk (høyre akse, svarte striper). Resultatene er presentert som relativ uttrykk gitt etter normalisering av genet av interesse å referere genet
GAPDH plakater (ng gen av interesse /ng referanse genet). (C, D) Uttrykk for Tensin2 og Tensin3 proteiner i menneskekreftcellelinjer. Helcellelysater ble underkastet 8% SDS-PAGE og western blot-påvisning av Tensin2 og Tensin3 proteiner. Banene er som følger: 1, HEK 293-celler som stabilt transfektert med Tensin2 (C); 1, HEK 293-celler som stabilt transfektert med Tensin3 (D) 2, nyrekarsinom SKRC-52; 3, HeLa S3; 4, tykktarms adenokarsinom SW480; 5, bryst adenokarsinom MCF-7; 6, prostata carcinom DU145; 7, melanom WM793; . 8, lungekreft H727
Statistisk analyse
Alle kliniske data ble analysert ved hjelp av SPSS programvarepakken (versjon 16.0.2 for Macintosh, SPSS Institute, Chicago, IL). Gjennomsnittsdifferanser av ikke-normalfordelte data ble analysert ved hjelp av Mann-Whitney test. Den Kruskal-Wallis-test ble benyttet for sammenligning mellom mer enn to grupper. Korrelasjoner ble vurdert av Spearman rank korrelasjon test. Overlevelseskurver ble evaluert med Kaplan-Meier metoden og overlevelsestiden ble sammenlignet med log-rank test.
I celle spredning, migrasjon og invasjon analyser, statistiske sammenligninger mellom ulike cellekloner eller behandlinger ble utført av ANOVA med Bonferroni post-hoc korreksjon. Alle statistiske tester var tosidig og en
P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Tensin uttrykk er i stor grad fraværende i human kreftcelle linjer
Vi først vist et panel av humane kreftcellelinjer for Tensin uttrykk. Et utvalg av forskjellige humane kreftcellelinjer ble undersøkt ved Northern blot-analyse for ekspresjon av Tensin2 mRNA. Den forventede band på 5 kb for Tensin2, som tidligere rapportert i menneskelige organer [1], var knapt synlig i bare 2 av 8 cellelinjer: HeLa og SW480 (figur 1A). Vi fortsatte med å utføre kvantitativ RT-PCR for ytterligere å undersøke mRNA uttrykk nivåer av Tensin2 og Tensin3 i et større utvalg av humane kreftcellelinjer og sammenlignet dem direkte til RNA hentet fra hele menneske nyre vev ekstrakter. Som vist i figur 1B, Tensin2 mRNA var fraværende i de fleste cellelinjer. Bare kolorektal adenokarsinom cellelinje SW480 uttrykt Tensin2 mRNA ved detekterbare nivåer, som også ble sett i Northern blot (figur 1A). Betydelig, både Tensin2 og Tensin3 uttrykk var lavere i en enkelt RCC pasientens nyre svulst ekstrakt som i forhold til sin tilstøtende normalt motstykke (matchet). Resultatene viser at Tensin3 uttrykk er høyere og bredere enn den for Tensin2 blant de undersøkte cellelinjer, men at begge genene synes å bli nedregulert i RCC. Vi har også undersøkt Tensin1 og Tensin4 mRNA i det samme panel av prøver og funnet ekspresjon av disse Tensins å være stort sett umulig å oppdage eller fullstendig fraværende (data ikke vist).
Vi utførte immunoblot for å analysere proteinet ekspresjon av Tensin2 og Tensin3 (figur 1C, D). I tråd med mRNA-resultatene, ble ekspresjon av Tensin2 på proteinnivå (molekylvekt 160 kDa) nesten ikke detektert i humane kreftcellelinjer, mens Tensin3 (180 kDa) ekspresjon var detekterbar i det minste i to cellelinjer: melanomcellelinje WM793 og lungekarsinom linjen H727. Sammen disse resultatene viser at uttrykket av alle Tensins er i stor grad fraværende i humane kreftcellelinjer samt å være nedregulert i humane nyre svulster.
Tensins 1-4 mRNA nivåene er betydelig lavere i nyrecellekarsinom versus normalt nyrevev
Vi søkte multiplex ett-trinns QRT-PCR for å evaluere mRNA uttrykk nivåer av alle fire Tensins i denne kliniske studien av total RNA ekstrahert fra 223 RCC og 48 vevsprøver normale nyrebark. De kliniske og patologiske egenskaper ved de RCC-pasienter i denne studien er vist i tabell 1. Den normale prøver ble oppnådd fra passet tumorkilder og fordelingen av tumortyper blant disse var lik den i den generelle populasjonen, dvs. 75% var av klarcellet type (tabell 1). Fra en skjerm på 11 kandidat housekeeping gener (Applera Sverige, Stockholm, Sverige), vi empirisk bestemt
B2M
genet for å være den mest konsekvente og robust intern standard til bruk for human nyrevevet (data ikke vist).
Som vist i figur 2A, mRNA uttrykk for Tensin2 fra 223 RCC ekstrakter var betydelig lavere enn i ekstrakter fra normal nyre cortex (48 tilfeller;
p
0,001). Resultatene er i stor grad reflektert fra ccRCC, som representerte de fleste tilfeller; men de lavere nivåene i pRCC var også av høy betydning (
p
0,001). Videre analyse av bare undergruppen av tumormateriale som hadde matchet normale kolleger ga også en signifikant lavere Tensin2 og -3 uttrykk i tumorvev (n = 48;
p
0,001). I tillegg var det også en statistisk signifikant fall i Tensin1 ekspresjon i tumorprøver (n = 134) i forhold til normaler (n = 21) (figur 2B). En tilsvarende og meget signifikant reduksjon i Tensin3 mRNA-ekspresjon ble også observert (figur 2C). Spesielt, Tensins -1, -2 og -3 ekspresjon ble påvist i alle prøver måles. I motsetning til dette, Tensin4 ekspresjon var stort sett fraværende i de fleste RCC-prøvene måles (n = 134), mens det var til stede i alle normale nyrebark prøver (n = 21) (figur 2D). Disse funnene, sammen med de som er beskrevet ovenfor, viser at en generell nedgang i ekspresjon av Tensins forekommer i RCC og kan derfor være fordelaktige for utviklingen av RCC-tumorer.
(A, C) mRNA-nivåene av Tensin2 (TNS2) og Tensin3 (TNS3), henholdsvis i 223 RCC pasienter gruppert etter tumor type, vs normal nyre cortex prøver fra 48 pasienter. Resultatene er presentert som relativ uttrykk (ng Tensin2 /ng B2M og ng Tensin3 /ng B2M, henholdsvis). Tensin2 og Tensin3 uttrykk i forhold til tumor type så vel i kontrollgruppen vises sammen med medianverdien.
***
P
0,001 normal vs. papillær og for normal vs. ccRCC. (B, D) mRNA nivåer av Tensin1 (TNS1) og Tensin4 (TNS4), henholdsvis i 134 RCC tilfeller (tumor) og 21 nyre cortex prøver (normal) etter normalisering å referere genet (relative uttrykk). Medianer er vist for både Tensin1 og Tensin4 uttrykk i normale og tumorprøver. I panel D, verdien n = 123 angis som antall tumorprøver uten Tensin4 uttrykk.
***
P
. 0,001 normal vs. svulst
Sammenheng mellom Tensin uttrykk og kliniske variabler i RCC pasienter
Vi utførte korrelasjonsanalyser for å vurdere en mulig sammenheng mellom Tensin mRNA-ekspresjon i RCC og kliniske karakteristika for pasientene. De mest relevante sammenhenger er oppsummert i tabell 2. For det første mRNA ekspresjon av Tensins 1-3 i tumorer positivt korrelert med hverandre, men ikke med Tensin4 som det var i stor grad påvises i RCC-prøver. Ingen signifikant sammenheng var tydelig mellom Tensins mRNA uttrykk nivåer og kliniske variabler som tumorstørrelse, tumor venøs infiltrasjon, regional lymfeknute infiltrasjon, alder eller kjønn.
