Abstract
Tumor nekrose faktor-α (TNF-alfa) aktiverer både celledød og celleoverlevelses veier. Aktiveringen av overlevelsesreaksjonsveien gjengir de fleste kreftceller som er resistente mot TNF-indusert cytotoksisitet. Vi fant at forbehandling med digitoflavone, en plante flavonoid, sterkt sensibilisert TNFa-indusert apoptotisk celledød i flere menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. På jakt etter det molekylære grunnlag for sensibilisering effekten av digitoflavone, ble digitoflavone funnet å hemme TNFa-indusert aktivering av atomtranskripsjonsfaktor-kappa B (NF-kB), som er den viktigste overlevelsesfaktor i TNFa-signalisering. NF-kB undertrykkelse skjedd gjennom hemming av IκBα kinase aktivering, IκBα fosforylering, IκBα degradering, og NF-kB kjernefysisk translokasjon. Denne hemmingen korrelert med undertrykkelse av NF-kB-avhengige gener involvert i antiapoptosis (MCL-en, BCL-2, BCL-XL, c-iap1, c-iap2, flip, og Survivin), spredning (c-myc, cyclin D1 ) og angiogenese (VEGF, cOX-2, og MMP-9). I tillegg kan digitoflavone aktiverer JNK via hemming av NF-kB signalering, tilveiebringe en kontinuerlig blokkering av feed-back-inhiberende mekanisme ved JNK-indusert NF-kB-aktivering. Denne studien fant en ny funksjon digitoflavone og økt verdien av digitoflavone som et anticancermiddel
Citation. Cai X, Lu W, Yang Y, Yang J, Ye J, Gu Z, et al. (2013) Digitoflavone hemmer IκBα kinase og forbedrer apoptose indusert av TNFa gjennom nedregulering av Expression of Nuclear Factor kB regulerte Gene produkter i Human kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 8 (10): e77126. doi: 10,1371 /journal.pone.0077126
Redaktør: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, USA
mottatt: 08.08.2012; Godkjent: 08.09.2013; Publisert: 11 oktober 2013
Copyright: © 2013 Cai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr. 30701098, 30873410 og 81073101), Science Foundation i Zhejiang-provinsen (nr Y2090676) og Jiangsu-provinsen fremragende leder Program for tradisjonell kinesisk medisin Natural. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største dødsårsaken hos kreftpasienter i USA og er en global kreftbehandling problem [1]. Tradisjonelle behandlingsmetoder for unresectable bukspyttkjertelkreft inkluderer stråling alene, kjemoterapi alene, eller kombinert chemoradiation. Men ett år og fem års overlevelse er bare 15% og 5%, henholdsvis [2], [3]. Den hoved medikament for tiden anvendes ved behandling av pasienter som har kreft i bukspyttkjertelen er gemcitabin, som har en objektiv responsrate på bare 5% [4]. Chemoresistance av tumorceller er tilsynelatende den viktigste årsaken til svikt i konvensjonell kjemoterapi i behandlingen av kreft i bukspyttkjertelen. Nukleær faktor-kB (NF-kB) er en av de medvirkende faktorer som er involvert i resistens mot kjemoterapi [5], [6]. Mer enn 90% av kreft i bukspyttkjertelen celler Harbor muterte K-ras [7], og NF-kB er en nedstrøms effektor av denne onkogenisk Ras [8], [9], [10]. NF-kB er konstitutivt aktivert i primær bukspyttkjertelen adenokarsinom og bukspyttkjertelkreft cellelinjer [8], og nedregulert NF-kB danner biologiske begrunnelsen for effektiv behandling av pasienter med bukspyttkjertelkreft ved hjelp av en giftfri phytochemical [11]. Videre er inflammasjon foreslått å være en kritisk komponent for kreft i bukspyttkjertelen [12], og NF-kB-aktivering er nødvendig i den inflammatoriske prosessen [13]. Således er utviklingen av forbindelser som er rettet mot NF-kB foreslått som en metode for behandling av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen [6], [14], [15].
Nuclear transkripsjonsfaktor-kappa B (NF -κB) er kritisk viktig for svulst celle overlevelse, vekst, angiogenese og metastasering. Under normale forhold, NF-kB, som består av p50, p65, og IκBα, er lokalisert i cytoplasma. Imidlertid, når den er aktivert, translocates denne transkripsjonsfaktor til kjernen. Som respons på et aktiveringssignal, gjennomgår den hemmende IκBα subenheten fosforylering, ubiquitinering, og nedbrytning, og dermed utsette nukleære lokaliseringssignaler på P50-P65 heterodimer. Den p65 er deretter fosforylert, noe som fører til dets atomtranslokasjon og binding til en spesifikk sekvens i DNA, som i sin tur resulterer i gentranskripsjon [16], [17]. NF-kB er blitt vist å regulere ekspresjonen av et antall gener, som gir produkter som er involvert i tumordannelse [17], [18], [19], [20], [21]. Disse inkluderer antiapoptotic gener (f.eks CIAP, survivin, tra, cflip, BFL-en, BCL-2, og BCL-XL), inflammatoriske gener (COX-2, MMP-9, og VEGF), og gener som koder adhesjonsmolekyler , chemokiner, og cellesyklusregulerende gener (f.eks cyclin D1 og c-myc). Således, midler som hemmer NF-kB-aktivering ha terapeutisk potensiale for pankreatisk karsinom [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28].
Digitoflavone (Dig) er en vanlig flavonoid som er til stede i mange typer planter som for eksempel frukt, grønnsaker og medisinske urter. Planter som er rike på digitoflavone har blitt benyttet i tradisjonell kinesisk medisin for behandling av forskjellige sykdommer så som hypertensjon, inflammatoriske lidelser, og cancer. Digitoflavone sin anticancer egenskap er assosiert med induksjon av apoptose og inhibisjon av cellevekst, metastase, og angiogenese [29]. Digitoflavone vesentlig sensibilisert TNFa-indusert apoptose i en rekke humane bukspyttkjertel cancer cellelinjer, en effekt som ble oppdaget for første gang av denne studien. En slik allergi er nært forbundet med digitoflavone sin hemmende effekt på NF-kB aktivering, som downregulated noen viktige antiapoptotic gener som c-iap1 og VEGF. Digitoflavone kunne aktivere JNK, en kritisk prosess i sensibilisering av digitoflavone på TNFa-indusert apoptose. Data fra denne studien utvidet vår forståelse av den molekylære mekanismen involvert i anticancer aktivitet digitoflavone.
Materialer og metoder
2.1 Materialer
Digitoflavone ble kjøpt fra Nanjing TCM Institute of Chinese Materia Medica, Kina. Det ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) som en 20 mmol /l stamløsning og lagret ved -20 ° C.
Escherichia coli
avledede human tumor nekrose faktor-α (TNF-α), som er egnet for cellekultur, ble erholdt fra Sigma, Inc. ble trypsin og MTT oppnådd fra Sigma, USA. Lysis buffer ble kjøpt fra Beyotime, Kina. Antistoffer (caspase-3, caspase-8, geite-anti-muse-IgG-HRP og geit-anti-kanin-IgG-HRP) ble oppnådd fra Santa Cruz, USA. Antistoffer Cycle D1, COX-2, MMP-9, VEGF, Mcl-en, Bcl-2, Bcl-X
L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP, Survivin, PARP, IKKα /β, p- IKKα, p-IKKβ, IκBα, p- IκBα, JNK, og p-JNK ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, USA. Monoklonale mus anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble oppnådd fra Kangchen, Kina. Den p65 uttrykk vektor, pCMV-p65, var en slags gave fra Dr Fang Wang, Harvard Medical School, Boston.
2,2 Cell Culture
Menneskelige bukspyttkjertelen cellelinjer PANC-en, Colo-357 og BxPC-3 ble kjøpt fra Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi. Celler ble dyrket i DMEM-medium (for PANC-1, Colo-357-celler) eller RPMI-1640 (for BxPC-3-celler) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle tilgjengelige fra Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Alle kulturer ble opprettholdt i en fuktet miljø med 5% CO
2 ved 37 ° C.
2,3 Annexin-V /PI Double Farging analysen
kreft i bukspyttkjertelen celler ble behandlet med digitoflavone ( 40 uM), TNFa (20 ng /ml) alene eller sammen ved 37 ° C i 24 timer. Cellene ble deretter høstet, vasket og resuspendert med PBS. Apoptotiske celler ble bestemt ved hjelp av et FITC-Annexin V Apoptose Detection Kit (BD Biosciences, USA) i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble vasket en kort stund og deretter inkubert i 15 minutter i 100 ul av 1 x bindingsbuffer, som inneholder 5 ul av Annexin V-FITC og 5 ul av PI, i mørke ved romtemperatur. Etterpå apoptose ble analysert ved FACScan laser strømningscytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA). Dataene ble analysert ved hjelp av programvaren Cellquest.
2,4 NF-kB luciferaserapportørplasmid analysen
Panc-1 celler ble transient transfektert med NF-kB avhengig ildflue luciferase reporter konstruere og konstitutivt uttrykker Renilla luciferase konstruere (40:1) ved hjelp av Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, USA). Ildflue luciferase-aktiviteten ble bestemt og normalisert til kontroll Renilla nivå, ved hjelp av Dual-luciferase reporter Assay System (Promega USA).
2,5 NF-kB Activation
DNA-bindende aktivitet av NF-kB kB ble bestemt ved elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA) fulgt instruksjonene fra LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce, USA). Atom ekstrakter ble fremstilt ved bruk NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Extraction Kit (Pierce, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Nukleære ekstrakter ble inkubert med biotin ende-merket, dobbelt-trådet NF-kB-oligonukleotid (5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3 «) eller Oct-1-oligonukleotid (5′-TGTCGAATGCAAATCACTAGA A-3») (Beyotime, Kina) i 20 minutter ved romtemperatur. DNA-protein-komplekset ble dannet, ble separert på 5% innfødt polyakrylamidgel. DNA ble deretter hurtig overført til en positiv nylonmembran, UV-kryssbundet, probet med streptavidin-HRP-konjugat, inkuberes med substrat og utsatt for røntgenfilm.
2,6 IκBα Nedbrytning og Fosforylering
for å bestemme effekten av digitoflavone på TNFa-avhengige IκBα nedbrytning og fosforylering, ble cytoplasmiske ekstrakter fremstilt som beskrevet tidligere [30] fra kreft i bukspyttkjertelen celler forbehandlet med digitoflavone i 7 timer og deretter eksponert for 20 ng /ml TNFa til 5, 10, og 20 min. Ekstraktene ble deretter løst i 13% SDS-polyakrylamidgeler. Etter elektroforese ble proteinene elektrooverført til PVDF-membraner (Millipore, USA), probet med antistoffer mot IκBα og fosforylert IκBα, og detektert ved hjelp av kjemiluminescens (Luminata Crescendo Vest-HRP-substrat, Millipore, USA).
2.7 Binding styrken på digitoflavone til ATP binding Site of IKK
for å bestemme bindingen styrken av digitoflavone til ATP-bindingssetet av IKK, utførte vi kinase bindingsanalyse ved KINOMEscan (LeadHunter Discovery Services). Kort fortalt ble kinase-merket T7 fag stammer utarbeidet i en
E. coli-vert
avledet fra BL21 belastning.
E. coli
ble dyrket til log-fase og infisert med fag T7 og inkubert med risting ved 32 ° C inntil lyse. Lysatene ble sentrifugert og filtrert for å fjerne celleavfall. De gjenværende kinaser ble produsert i HEK-293-celler og deretter merket med DNA for qPCR deteksjon. Streptavidin-belagte magnetiske kuler ble behandlet med biotinylerte små molekyl ligander i 30 minutter ved romtemperatur for å generere affinitet harpikser for kinasebestemmelser. De liganded Kulene ble blokkert med overskudd av biotin og vasket med blokkeringsbuffer (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0,05% Tween 20, 1 mM DTT) for å fjerne ubundet ligand, og for å redusere ikke-spesifikk binding. Bindingsreaksjoner ble satt sammen ved å kombinere kinaser, liganded affinitet perler, og testforbindelsene i 1 x bindingsbuffer (20% SeaBlock, 0,17 x PBS, 0,05% Tween 20, 6 mM DTT). Alle reaksjoner ble utført i polystyren 96-brønners plater i et sluttvolum på 0,135 ml. Analyseplatene ble inkubert ved romtemperatur med risting i 1 time, og affinitet kulene ble vasket med vaskebuffer (1 x PBS, 0,05% Tween 20). Perlene ble deretter resuspendert i elueringsbuffer (1 x PBS, 0,05% Tween 20, 0,5 mM ikke-biotinylert affinitetsligand) og inkubert ved romtemperatur med risting i 30 minutter. Kinase-konsentrasjonen i eluatene ble målt ved qPCR.
2,8 JNK-aktivering Assay
For å bestemme effekten av digitoflavone på TNFa-indusert JNK-aktivering, ble Western blot brukt til å utføre JNK analyse. Kort sagt ble cytoplasmiske ekstrakter fremstilt fra kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med 40 uM digitoflavone i 7 timer og deretter behandlet med 20 ng /mL TNFa til 5, 10 og 20 min. Ekstraktene ble deretter løst i 13% SDS-polyakrylamidgeler og analysert ved hjelp av Western blot ved anvendelse av et antistoff mot JNK og p-JNK.
2.9 Transfeksjon av p65
Transfeksjon ble utført i 6- brønners plater ved hjelp Lipofectamin 2000 reagens (Invitrogen, Paisley, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene dyrket i 6-brønners plater og transfektert med den passende vektor (2 ug) den påfølgende dagen. Etter 4 timer ble blandingen transfeksjonen ble fjernet og erstattet med fullstendig medium. Cell behandlinger ble deretter utført 24 timer etter transfeksjon som angitt.
2,10 NF-kB Målrettet genekspresjonsanalyser
For å bestemme effekten av digitoflavone på TNFa-indusert NF-kB målrettede genuttrykk , Western blot ble anvendt for å utføre proteinekspresjon assay. Kort sagt ble cytoplasmiske ekstrakter fremstilt fra kreft i bukspyttkjertelen celler ubehandlede eller forhåndsbehandlet med 40 uM digitoflavone i 7 timer og deretter behandlet med 20 ng /mL TNFa for 2, 4, 8, 12 og 24 timer.
2.11 real-Time Kvantitativ PCR (qPCR)
Total RNA ble ekstrahert ved Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. 2 mikrogram av total RNA ble benyttet for cDNA-syntese med tilfeldige heksamerprimere. qPCR ble utført med en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaksjonene ble utført per SYBR Grønn instruksjoner (Thermo Scientific, USA) i tre eksemplarer i tre uavhengige forsøk. Primersekvensene er gitt i tabell 1. Den ΔΔC
T-metoden ble brukt for bestemmelse qPCR. GAPDH ble brukt som husholdningsgenet til å normalisere variasjon i uttrykket nivåer.
2,12 VEGF Påvisning av ELISA
VEGF konsentrasjon i kondisjonert medium fra menneskelige bukspyttkjertel carcinoma celler ble målt ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ELISA-sett (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
3,1. digitoflavone forsterkes apoptotisk effekter av TNFa
effektene av digitoflavone på apoptotiske virkninger av TNFa ble undersøkt. TNFa alene induserte ikke en betydelig mengde av apoptose; imidlertid, når kombinert med digitoflavone, de cytotoksiske effektene av TNFa ble utvidet (fig. 1). Digitoflavone kombinert med TNFa økt med ca 180-240% apoptose rente enn TNFa alene.
Cell apoptose ble bestemt av Annexin V FITC apoptose Kit. *
P
0,05 sammenlignet med ikke-behandlede kontroll; og #
P
. 0,05 sammenlignet med gruppen med TNFa bare
3,2 Digitoflavone Trykt NF-kB avhengig Reporter Gene Expression indusert av TNFa
undersøkte den hemmende effekten av digitoflavone på NF-kB transkripsjonen aktivitet i PANC-1-celler ved hjelp av NF-kB luciferase reporter-analyse. Som vist i figur 2, behandling med TNFa betydelig forbedret NF-kB transkripsjonen aktivitet og digitoflavone forbehandling markert undertrykket den transaktivering av NF-kB som induseres av TNFa. Den reduserte luciferase-aktivitet ved digitoflavone kan på grunn av sin direkte inhibering på luciferase-enzymaktivitet. For å utelukke en slik mulighet, ble digitoflavone etterbehandling utført. Celler ble først behandlet med TNFa (20 ng /mL) i 2 timer fulgt av digitoflavone (40 uM) behandling i ytterligere 2 timer. Det er ganske interessant å finne at digitoflavone etter behandling klarte å hemme trans av NF-kB indusert av TNFa, noe som tyder på at digitoflavone ikke undertrykke NF-kB aktivering post-transcriptionally og utgjør ingen direkte hemming til luciferase enzymaktivitet.
PANC-1 celler ble transfektert med NF-kB avhengig ildflue luciferase reporter konstruere og konstitutivt uttrykker Renilla luciferase konstruere. Cellene ble deretter behandlet med digitoflavone (40 uM) i forskjellige tidsrom (1 H, 3H, 5H, 7H). En annen gruppe celler (forbehandlingen gruppe) ble behandlet med digitoflavone (40 uM) i forskjellige tidsrom (1 H, 3H, 5 timer, 7 timer), etterfulgt av TNFa (20 ng /mL) i 2 timer. Den post-behandlingsgruppe ble behandlet med TNFa (20 ng /mL) i 2 timer, etterfulgt av digitoflavone (40 uM) i forskjellige tidsrom (1 H, 3H, 5 timer, 7 timer). Luciferase aktiviteten ble uttrykt som ganger økt kontroll etter normalisert med Renilla luciferase aktivitet. Data er presentert som gjennomsnitt ± s.d. fra minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05 sammenligne med TNFa-behandlede kontroll (0 h);
#
P
0,05 sammenlignet med gruppen med TNFa bare, og
△
P
0,05 sammenlignet med gruppen TNFa-behandlede Dig-behandlet kontroll (7 h).
3,3 Digitoflavone hemmet induserbar NF-kB Aktivering av TNFa
TNFa er en aktivator av NF-kB, og mekanismen for NF-kB-induksjon velig varierer mellom forskjellige celle typer. [31] Dermed vi undersøkt om digitoflavone var effektive i blokkering NF-kB aktivering i tre menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. I henhold til resultatene digitoflavone fullstendig hemmet TNFa-indusert NF-kB-aktivering i alle tre cellelinjer (Fig. 3), og derved indikerer at digitoflavone var effektive i å hemme TNFa-induserbar NF-kB i bukspyttkjertelcancercellelinjer av varierende differensiering.
kreft i bukspyttkjertelen celler ble for-inkubert med digitoflavone (40 uM) i 7 timer og deretter behandlet med 20 ng /mL TNFa i 30 minutter ved 37 ° C. Nukleære ekstrakter ble fremstilt og deretter testet for NF-kB-aktivering av EMSA. Bottom, EMSA ved hjelp av en oktober-en sonde for en lasting kontroll.
3,4 Digitoflavone hemmet TNFa-avhengige IκBα Fosforylering og Nedbrytbarhet
IκBα fosforylering er nødvendig for NF-kB aktivering. Derfor ønsket vi å finne ut om digitoflavone påvirket TNFa-indusert IκBα fosforylering som er en annen forutsetning for NF-kB trans. Ifølge Western blot-analyse hvor det anvendes et antistoff som gjenkjenner bare serin-fosforylert form av IκBα, digitoflavone fullstendig undertrykt TNFa-indusert fosforylering IκBα (Fig. 4A). IκBα nedbrytning er vanligvis nødvendig for translokasjon av NF-kB til kjernen. Derfor forsøkte vi å bestemme hvorvidt inhibering av TNFa-indusert NF-kB-aktivering av digitoflavone skyldes hemming av IκBα degradering. Vi fant at TNFa-indusert IκBα degradering i kontrollceller og digitoflavone forsinket TNFa-indusert degradering IκBα på PANC-1 og Colo-357-celler (Fig. 4A). På den annen side, digitoflavone forbehandling delvis hemmet ekspresjon av IκBα (tidspunkt 0 «).
A, digitoflavone hemmet TNFa-indusert fosforylering av IKKα /β og IκBα. Kreft i bukspyttkjertelen celler ble inkubert med 40 pM digitoflavone i 7 timer før den utsettes for TNFa i forskjellige tidsrom, og deretter testet for fosforylert IKKα /β og IκBα i cytosoliske fraksjoner ved hjelp av Western blotting-analyse. B, digitoflavone hadde en god binding potens til ATP-bindingssetet av IKK, med KDS på 7,3 mikrometer og 5,2 mikrometer for IKKα og IKKβ hhv.
3,5 Digitoflavone hemmet TNFa-indusert IKK Activation
ikk aktivering er kritisk med hensyn på TNFa-indusert NF-kB-aktivering. Digitoflavone fullstendig undertrykt TNFa-indusert aktivering av IKK. Verken TNFa eller digitoflavone utøves noen direkte effekt på uttrykk for IKK proteiner (fig. 4A). Resultater fra KINOMEscan analysen viste at digitoflavone hadde en god binding potens til ATP-bindingssetet av IKK, med KDS på 7,3 mikrometer og 5,2 mikrometer for henholdsvis IKKα og IKKβ (Fig. 4B). Resultatene viste at digitoflavone svært sannsynlig downregulated uttrykk for NF-kB-regulerte genprodukter gjennom hemming av IKK.
3,6 Digitoflavone Kunne Active JNK og denne effekten ble blokkert av Overuttrykte p65
undersøkte effekten av digitoflavone forbehandling på TNFa-indusert JNK-aktivering. TNFa alene forårsaket rask og forbigående JNK aktivering i bukspyttkjertelen kreftceller, som demonstrert ved økt JNK fosforylering. Digitoflavone kunne aktiverer JNK, så vel som TNFa, og aktiverings effekten ble ikke svekket når de brukes sammen (fig. 5). For å fastslå effekten av overekspresjon av p65 på JNK-aktivering, vi transient transfektert Panc-1 celler med p65 eller tom vektor og vurderes hel-cellelysater fra digitoflavone-behandlede celler ved western blotting analyse ved hjelp av et antistoff som spesifikt gjenkjenner fosforylert form av JNK . Som vist i figur 6, digitoflavone behandlingen resulterte i forlenget fosforylering av både P46 og P54 isoformer av JNK. Overekspresjon av p65 blokkert digitoflavone indusert JNK-aktivering.
bukspyttkjertelkreft-celler ble inkubert med 40 pM digitoflavone i 7 timer ved 37 ° C, og deretter testet for fosforylert JNK i cytosoliske fraksjoner ved hjelp av Western blotting-analyse.
PANC-1-celler ble transfektert med pCMV-p65 eller tom vektor og behandlet med digitoflavone (40 uM) i 3 timer eller 7 timer. JNK-aktivitet ble bestemt ved Western-blotting i hel-celle-lysater.
3,7 Digitoflavone hemmet NF-kB-regulert Gene Expression Products
COX-2, MMP-9, og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er kjent for å bli regulert av NF-kB. Cyclin D1 og c-myc regulere mobilnettet spredning og er regulert av NF-kB. NF-kB oppregulerer uttrykk for en rekke gener involvert i å tilrettelegge svulst celle overlevelse, slik som Mcl-en, Bcl-2, Bcl-X
L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP og Survivin. Dermed blir virkningen av digitoflavone på ekspresjonen av disse NF-kB-regulerte gener og genprodukter ble også undersøkt. TNFa behandling indusert uttrykk av MMP-9, cyclin D1, Mcl-en, Bcl-2, c-IAP1, c-IAP2, vende og overlevende genprodukter, og digitoflavone avskaffet TNFa-indusert ekspresjon av disse genprodukter (Fig. 7A C). Våre resultater viste også at digitoflavone opphevet TNFa-indusert mRNA nivå av COX-2, MMP-9, VEGF, Cyclin D1, c-Myc, Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-X
L (fig. 7D) .
kreft i bukspyttkjertelen celler ble ubehandlet eller inkubert med 40 mikrometer digitoflavone for 7 timer og deretter utsatt for TNFa for forskjellige tider. Hele celle ekstrakter ble utarbeidet og analysert ved Western blotting (Fig. 7A-C) eller qPCR (Fig. 7D).
3,8 Digitoflavone Trykt VEGF-sekresjon fra bukspyttkjertelen carcinoma celler
VEGF som er aktivt utskilt fra hypoksiske tumorceller kan utløse tumor angiogenese. Reduksjon av VEGF svekker dens evne til å stimulere tumor angiogenese. Derfor undersøkte vi effekten av digitoflavone på VEGF sekret fra bukspyttkjertelen carcinoma celler ved hjelp av ELISA analyse. Resultatene indikerte at digitoflavone behandling i 24 timer ble redusert VEGF-sekresjon sammenlignet med bærerkontrollgruppen (
P
0,05). Stimulering med TNFa øket VEGF-sekresjon sammenlignet med bærerkontrollgruppen (
P
0,05). Imidlertid forbehandling med digitoflavone blokkerte stimulering effekten av TNFa (fig. 8).
Representative data ble vist fra tre uavhengige eksperimenter med identiske resultater. VEGF ble uttrykt som en pikogram av VEGF protein per milliliter medium og per 10
5 celler. *
P
0,05 sammenlignet med ikke-behandlede kontroll; og #
P
. 0,05 sammenlignet med gruppen med TNFa bare
Diskusjoner
bukspyttkjertelen adenokarsinom er en aggressiv og svært dødelig malignitet. Foreløpig er gemcitabin vanligvis brukes i pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Men forventet levealder for kreft i bukspyttkjertelen pasienter forblir fattige. Tsutom har rapportert at intratumoral injeksjon av rekombinant humant TNFa inoperable tilfeller av kreft i bukspyttkjertelen forårsaket regresjon av tumoren eller en reduksjon i tumormarkører [32]. Men hadde en komplett respons ikke er oppnådd i noen av disse tilfellene, og det samlede resultatet var ikke tilstrekkelig, muligens fordi cytoprotecting faktorer som enTNF og MnSOD er rikelig i kreft i bukspyttkjertelen celler [33], eller fordi TNF reseptorer ble neppe uttrykt. Dette refraktær mot TNFa kan overvinnes ved kombinasjon med en lav cytotoksisk forbindelse, noe som kan sensibilisere effekten av TNFa.
Digitoflavone er et vanlig anlegg flavonoid som besitter anticancer egenskaper som ble vist av tidligere studier [29]. Digitoflavone kan finnes i store mengder planter og matvarer, blant annet rødbeter, kål, blomkål, selleri, grønn pepper, perilla blad, olivenolje og te [34]. I cellulære studier har digitoflavone blitt funnet å ha anti-oksidanter, antiinflammatoriske /antiallergisk, anti-tumorigen, og radikale handling [35], [36], [37]. Digitoflavone ble rapportert å hemme utviklingen av en serie av faste tumorer [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [ ,,,0],47]. I denne studien har vi gitt bevis for at digitoflavone sensitizes TNFa-indusert apoptose i humane kreft i bukspyttkjertelen celler. Slik sensibilisering oppnås via dets hemmende effekt på NF-kB-aktivering, noe som igjen resulterer i redusert ekspresjon av antiapoptotic NF-kB målgener. Data fra denne studien viste en roman funksjon av digitoflavone og øke verdien av digitoflavone som et nyttig kreft agent.
NF-kB aktivering fører til uttrykk av gener som er involvert i spredning og metastasering av kreft. I denne rapporten viste vi at digitoflavone hemmer uttrykk for cyclin D1, som reguleres av NF-kB. I tillegg viser våre resultater indikerer at digitoflavone nedregulerer ekspresjon av COX-2, MMP-9, og VEGF som alle er regulert av NF-kB. Disse resultatene underforstått videre at digitoflavone utøvd sin kreft egenskaper gjennom NF-kB hemming. NF-kB regulert ekspresjon av Mcl-en, Bcl-2, Bcl-X
L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP, og Survivin, og deres overekspresjon i mange svulster har vært knyttet til tumor celle overlevelse, chemoresistance, og radioresistance. Våre resultater tyder på at digitoflavone behandlingen nedregulerer alle disse genprodukter. Digitoflavone har vist seg å hemme veksten av mange forskjellige tumorceller som leukemiceller og ikke-små-celle lunge karsinom-celler [30]. Denne veksthemming kan være mediert gjennom nedregulering av ulike gener. Nedregulering av forskjellige antiapoptotic genprodukter av digitoflavone også lysfølsomt cellene til de apoptotiske effekter av TNFa. Videre studier har vist at digitoflavone hadde en god binding potens til ATP-bindingssetet av IKK, som viste at digitoflavone meget sannsynlig hemmet NF-kB vei gjennom inhibisjon av IKK. Digitoflavone kunne aktiv JNK og overekspresjon av p65 forhindret digitoflavone-indusert JNK-aktivering. Dig kan være en ny medikament for å tilveiebringe en kontinuerlig blokkering av feed-back-inhiberende mekanisme ved JNK-indusert NF-kB-aktivering. Dette kan være den mekanismen hvorfor digitoflavone kan sensitiv TNFa. Selvfølgelig, mer eksperimentell verifikasjon inkludert
in vivo
studien var nødvendig.
