Abstract
Ccs3
locus på mus kromosom 3 regulerer differensial mottakelighet av A /J (A, utsatt) og C57BL /6J (B6, resistente) musestammer til kjemisk indusert tykktarmskreft (CRC). Her rapporterer vi den høyoppløselige posisjons kartlegging av genet som ligger under
Ccs3
effekt. Bruke fenotype /genotype sammenheng i en serie på 33 ACB /BCA rekombinante congenic musestammer, samt i grupper på backcross populasjoner som bærer unike rekombinante kromosomer for intervallet, og i subcongenic stammer, vi har avgrenset den maksimale størrelsen på
Ccs3
fysisk intervallet på en ~2.15 Mb segment. Dette intervallet inneholder 12 kommenterte transkripsjoner. Sekvensering av posisjonelle kandidater i A og B6 identifisert mange enten lavt prioriterte kodeendringer eller ikke-proteinkodende varianter. Vi fant et unikt eksemplar nummer variant (CNV) i intron 15 av
Nfkb1
genet. Den CNV består av to kopier av en 54 bp sekvens umiddelbart tilstøtende til exon 15 spleisesetet, mens bare ett eksemplar finnes i CRC-følsomme A. Nfkb1 proteinet (P105 /P50) uttrykket er mye redusert i en tumorer sammenliknet med normal En kolonepitelet som analysert ved immunohistokjemi. Studier i primærmakrofager fra A og B6 mus viser en markert differensial aktivering av NFkB veien ved lipopolysakkarid (kinetikken for stimulering og maksimale nivåer av fosforylert IκBα), med en mer robust aktivering bli assosiert med resistens overfor CRC. NFkB har tidligere blitt implisert i regulering av homeostase og inflammatorisk respons i tarmslimhinnen. Intervallet inneholder en annen posisjonell kandidat
Slc39a8 Hotell som er forskjellig uttrykt i A vs B6 kolon, og det har nylig vært forbundet i CRC tumor aggressivitet hos mennesker
Citation. Meunier C, Van Der Kraak L, Turbide C, Groulx N, Labouba jeg, Cingolani P, et al. (2013) Posisjons Kartlegging og Candidate Gene Analyse av Mouse
Ccs3
Locus som regulerer Differential Mottakelighet for kreftfremkallende-indusert tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (3): e58733. doi: 10,1371 /journal.pone.0058733
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 06.12.2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 14 mars 2013
Copyright: © 2013 Meunier et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler til PG og NB fra den kanadiske Cancer Society Research Institute [www.cancer.ca/Research.aspx], den Cancer Research Society Inc. [www.src-crs.ca/en-CA] og Canderel Initiative Program [www.deficanderel.com/3/donate.htm] av Goodman Cancer Research Centre [cancercentre.mcgill.ca/research/]. PG er en James McGill professor i biokjemi. CM fikk student støtte og reise utmerkelser fra McGill Integrated Cancer Research Training Program (MICRTP) og Peter Quinlan Foundation [www.mcgill.ca/gcc-research/funding/] gjennom McGill University Faculty of Medicine. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
patogenesen av tykktarmskreft (CRC) er forbundet med den sekvensielle akkumulering av mutasjoner i spesifikke gener, noe som fører til trinnvis progresjon fra pre-neoplastiske lesjoner for å fullverdig adenokarsinom [1]. Histopatologiske stadier samkjøre med somatiske molekylære rearrangements er godt beskrevet [1], [2]. Men bare de siste årene, og med bruk av genomassosiasjonsstudier har graden av kompleksitet i samspillet mellom genetiske og miljømessige komponenter som bidrar til etiologien av menneskelig tykktarmskreft blitt satt pris på [3], [4], [5] [6]
for en liten andel av CRC tilfeller ( 10%)., en klar og svært penetrant genetisk determinant kan observeres i arvelige kreftsyndromer, viktigst Familiær adenomatøs polypose (FAP), Lynch syndrom (arvelig ikke-polypose colon cancer) og vekselvis, inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) -bundne CRC [7], [8]. På den annen side, de fleste tilfeller CRC ( 90%) er sporadiske uten forutgående familiehistorie. Etiologien av sporadisk CRC involverer to-veis interaksjoner mellom en kompleks genetisk komponent, og dårlig definerte miljøfaktorer [3], [6]. Hittil har så mange som 16-20 vanlige lav penetrans varianter blitt identifisert i genom-wide assosiasjonsstudier (GWAS) for mennesker sporadisk CRC [9], [10]. Nesten halvparten av disse loci er tett koblet eller allel med komponenter av TGFß signalveien: SMAD7, GREM1, BNIP2, BMP4, RHPN2 og LAMA5 ([11], [12], anmeldt i [13]). På den annen side er det foreslått at så mange som 170 slike loci kan bidra til CRC følsomhet hos mennesker [13].
Over 25% av alle kreftformer er antatt å være assosiert med kronisk infeksjon, betennelse eller andre typer av inflammatorisk reaksjon [14]. Kronisk betennelse har nylig blitt verdsatt som en viktig bidragsyter til etiologien av CRC hos mennesker [15], [16], anmeldt i [13]. Således, pasienter som lider av inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) har en mye høyere risiko for å utvikle kolitt-assosiert (CA) CRC, omfanget av kolitt manifestasjon korrelere med forekomsten av CA-CRC [17]. I tillegg, ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) viser en beskyttende effekt mot forskjellige typer av kreft [18]. Interessant nok har flere viktige komponenter av TGFp-mediert Th17 og Th1-immunrespons trasé nylig blitt identifisert som lav-pene loci forbundet med IBD utbruddet, som kan implisere TGFp signalering i begge IBD-bundne, så vel som sporadiske CRC ([15], [ ,,,0],16], anmeldt i [19], [20]).
musen representerer en verdifull eksperimentell modell for å dissekere kompleks genetisk komponent av menneskelig CRC. Mus er tilgjengelig som innavlede stammer faste for homozygosity for ulike allele varianter som representerer bred genetisk variasjon på viktige gener og stier som er relevante for CRC patogenesen. I tillegg kan CRC bli indusert i en reproduserbar og godt kontrollert måte ved hjelp av kjemiske mutagener slik som azoxymethane (AOM) [21], [22]. De resulterende tumorer likne sine menneskelige motstykke med hensyn til histopatologi (fra avvikende krypten foci til carcinoma
in situ
) og underliggende genetiske forandringer (mutasjoner i
Apc
,
Kras
og
SS-catenin
) [23], [24]. Innavlede musestammer viser store forskjeller i mottakelighet for kreftfremkallende-indusert CRC og klassisk kobling analyser i informative kors har lokalisert flere loci som regulerer inter belastningsskader forskjeller i mottakelighet [25], for eksempel
Ccs1 product: [26],
Ssic1 product: [27], og
Ccs2 product: [28]. Parallelle studier i congenic stammer avledet fra BALB /Chea og STS /A foreslo en rekke ekstra loci (
Scc1
til
Scc15
) påvirker respons på kreftfremkall-indusert CRC [29], [30 ]. Av disse, den posisjonelle kloning av
Scc1
locus førte til identifisering av
Ptprj
som utløsende genet, og somatiske rearrangements i menneske homolog
PTPRJ
ble identifisert i humant CRC [31], [32].
i AOM kjemisk kreftutvikling modell, C57BL /6J stamme (B6) er motstandsdyktig med få CRC tumorer 18 uker etter behandlingsstart (typisk 0-5 svulster), mens A /J (A) er svært utsatt med tumor multiplisitet varierende mellom 20-50 [33]. I vårt laboratorium har vi benyttet et sett med ACB /BCA rekombinante congenic mus linjer (RCS) som stammer fra CRC-resistente B6 og CRC-utsatt A for å identifisere genetiske determinanter som er ansvarlige for differensial mottakelighet av disse stammene til AOM-indusert CRC. De 13 ACB og 22 BCA stammer ble avledet av systematisk innavl fra en dobbel backcross (N3), og hver stamme inneholder en liten mengde (12,5%) av DNA fra en av foreldrene fast som et sett av diskrete congenic segmenter (kartlagt av genotyping) på bakgrunnen (87,5%) av den andre forelder. Individuelle motstand /resistens loci som bidrar til en kompleks egenskap kan skille i enkelt RCS og kan studeres isolert, tilrettelegging genet identifikasjon studier. Dette førte til kartlegging av tre loci (
Ccs3
,
Ccs4
,
Ccs5
) regulerer respons til AOM-indusert CRC i disse stammene [33], [34] , [35].
Ccs3
locus bestemmer innledende mottakelighet for FDV-indusert CRC (utseende adenomer), mens
Ccs5
locus modulerer svulst mangfaldet i dyr som bærer resistens alleler i
Ccs3 product: [ ,,,0],34].
Ccs3
locus ble kartlagt til en 14 Mb segment på den sentrale delen av kromosom 3. Dette intervallet inneholder 94 kommenterte transkripsjoner, og flere av disse genene viser robust uttrykk i tykktarmen, selv regulert i en påkjenning spesifikk fashion.
i denne studien har vi gjennomført genetiske analyser i ACB /BCA stammer og i kors avledet fra dem til å ytterligere begrense størrelsen på
Ccs3
genetisk intervallet til 2,2 Mb. Vi har videre karakterisert genene i intervallet av uttrykket profilering og genomisk DNA-sekvensering.
Resultater
Avgrensning av Ccs3 intervall i ACB /BCA rekombinant congenic og AxB /BXA rekombinante innavlede stammer
fenotyping en undergruppe av 23 ACB /BCA stammer for mottakelighet for AOM-indusert CRC utgangspunktet viste at differensial mottakelighet for A og B6 musestammer til CRC er regulert av en enkelt locus utpekt
Ccs3
. I disse studiene,
Ccs3
ble kartlagt til et 14 Mb segment på den sentrale del av kromosom 3 [33]. For bedre å avgrense
Ccs3
genetisk intervall, vi fenotypiseres ytterligere ACB /BCA stammer (og det totale til 33 stammer), samt en undergruppe av AxB /BXA stammer (AXB19, AXB24, BXA2, BXA8, BXA12 ), med noen av disse stammene bærer informative rekombinante haplotyper i
Ccs3
regionen. Grupper av mus ble behandlet med en ukentlig dose av AOM injeksjon i 8 uker og 11 uker senere ble dyrene avlivet, kolon ble samlet og tumorer ble scoret. Stammer ble stratifisert i henhold til antall svulster oppdages, enten som lav /middels (eller under 10 svulster) eller høy ( 15 svulster) [33]. Dette bimodal belastningen distribusjonsmønsteret ble deretter lagt over den kjente haplotype kombinasjon av A og B6 lene for distal kromosom 3 (
Ccs3
) i disse stammene. Et sammendrag av alle tilgjengelige data fra ACB /BCA og AXB /BXA stammer som er vist i figur 1A. Denne analysen bekreftet den kritiske rollen
Ccs3
alleler i CRC mottakelighet egenskap, og ytterligere identifiserte stammer AcB52 og AcB60 som bærer informative rekombinante haplotyper videre avgrense grensene for locus på de proksimale og distale sider, henholdsvis. For bedre å avgrense rekombinasjon stoppunkter i disse stammene, har vi utviklet flere andre informative markører (mikro og SNP markører) i denne regionen av genomisk DNA-sekvensering av A og B6 foreldre (se Materialer og metoder). Ved hjelp av disse markørene, vi videre avgrenset rekombinasjon stoppunkter på den proksimale side (AcB52), mellom markører P3-17 (PST. 132,558 Mb) og P3-19 (PST. 132,562 Mb), og på den distale side (AcB60) mellom markørene D4-11 (pst. 136,18 Mb) og rs30215915 (pst. 136,20 Mb) (fig. 1B). Disse studiene ytterligere redusert størrelsen av den maksimale fysiske intervallet for
Ccs3
locus til 3,64 Mb (P3-17 til rs30215915).
A. Kromosom 3 haplotyper av ACB /BCA stammer vises sammen med sin motstand (hvit) eller mottakelighet (svart) status for FDV-indusert CRC (bunnlisten). B6-avledede kromosomale segmenter er angitt i grå (2), mens A-haplotyper er annotert i hvitt (1). Piler (↓) indikerer viktige RCS stammer avgrense minimum kromosom intervallet for
Ccs3
locus. B. Detaljert haplotype kart over
Ccs3
locus, herunder avgrensning av nære og fjerne grenser ved høy tetthet SNP genotyping i viktige informative congenic stammer (AcB52, AcB60).
høy oppløsning posisjon kartlegging av Ccs3 locus av avkomsgransking av informative backcross mus
i disse studiene, produserte vi (B6xA) F2 dyr, som ble genotypet å identifisere informative rekombinanter i
Ccs3
intervall , ved hjelp av markører rs30055788 på proksimale side og rs30215915 på den distale side. Blant et sett av 240 F2 dyr skjermede, identifiserte vi 3 informative rekombinanter som ble utpekt RecA, RecB og recc. Hver rekombinant ble deretter backcrossed på både B6 og en bakgrunn, og multiple avkom fra individuelle kors deretter ble genotypet for markører i intervallet og fenotypiseres for mottakelighet for CRC (fig. 2A, 2B). I denne analysen vises avkommet av backcross mellom individ Rec mus (A, B, C) og enten A eller B6 foreldre en blanding av rekombinante haplotyper i regionen med kombinasjoner av homozygosity for A eller B6 alleler eller heterozygositet for A /B-alleler (fig. 2B). Vi så sammenlignet genotypen av de rekombinante kromosomer med fenotypen av A og B6 tilbakekrysninger avledet fra dem (fig. 2A, 2B). Foreldre A kontroller utviklet høy krefttall (X = 45.5 Fig. 2A) mens B6 kontrollene var lav (X = 1,0; p 0,0001). Avkomsgransking av RecB og recc backcrossed til B6 viste samlede krefttall i disse musene ligner B6 kontroller, i samråd med homozygosity for B6 haplotyper i den distale delen av den tidligere definerte
Ccs3
regionen. Omvendt, avkom testing av RecA og RecB passet til A viste tumortall i disse dyrene som ikke var statistisk forskjellig fra de som er registrert i sperre A kontroll (selv om RecB XA var mer mellomprodukt), i overensstemmelse med homozygositet for A-allel på den distale parti av
Ccs3 plakater (Mb134.0-136.2). Til slutt, observerte vi en tredje gruppe av dyr som viste mellomliggende svulst multiplisitet mellom den for de to sperre ytterpunktene (X = 8,5;
p
0,001 for hver sammenligning); disse inkludert RecA x B6 (genotype BB proksimale /AB distal; genotype AB proksimale /AB distal), RecB X B6 (AB proksimale, AB distal), RecB XA (AA proksimale /AB distal), og recc XA (AB proksimale, AB distal). I denne gruppen av dyr, var det en sterk sammenheng mellom mellom svulst mangfold og heterozygositet for A /B-haplotyper på den distale delen av
Ccs3
intervall, i samsvar med co-dominant arvemønster av
Ccs3
lene vi tidligere rapportert [33]. Den kombinerte effekten av A /A, A /B og B /B-alleler på den distale delen av
Ccs3
er vist i figur 2C. Disse eksperimentene ytterligere redusert størrelsen på
Ccs3
intervallet til ~2.15 Mb, som avgrenset på den proksimale side ved gjensidige rekombinasjon i RecA og RecB (i rs31197594 og rs52356981 intervall) og på den distale siden rekombinasjon hendelse i AcB60 (i rs31197594 til rs30215915 intervall) (fra fig. 1).
A. Etter AOM behandling, ble kolon dissekert, fast og antall svulster ble scoret (enkelte mus vist som «•»). Kontroller og backcross mus tilsvarende nøkkel rekombinanter (Rec A, Rec B og Rec C) hvor avlet til A /J (indikert A) og C57BL6 /J (indikert som B). Mus ble gruppert etter haplotype på
Ccs3
locus og rekombinante dyr bære en annen haplotype på hver halvdel av
Ccs3
intervall. Grupper som viser tumor tallene statistisk forskjellig form En foreldregruppe er identifisert (#). B.
Ccs3
haplotype på distal kromosom 3 av hver gruppe mus fenotypiseres i panelet (A) er vist i svart (B6), hvit (A /J) eller stripete (heterozygoter). Stiplede linjer viser den første intervallet er identifisert i RCS (pil), så vel som redusert genetisk intervallet for
Ccs3
foreslått av en rekombinasjon i Rec A og B Rec mellom markører rs31197594 og rs52356981, på den proksimale side (boks ). Den fjerne grensen ble estimert fra studier i rekombinante congenic stammer fra Figur 1B. C. Aggregate genotype /fenotype korrelasjon av samlet backcross mus for den reduserte
Ccs3
intervall (Mb134.0-136.2).
posisjon kandidater til Ccs3 locus
Den ~2.15 Mb
Ccs3
intervall inneholder 12 gener, en mikro-RNA (
Mir1895
), samt flere lange ikke-kodende RNA (lincRNA) og en retroposon (fig. 3A , og data ikke vist). Sekvensen av 2,15 Mb segmentet ble sammenlignet mellom A og B6 bruker referansen genomsekvenser som er tilgjengelige fra Wellcome Trust Sanger Institute [36], og en fullstendig liste over alle exonic, intronic og intergeniske varianter er presentert i tabell S1. Det er ingen SNPs som skiller A og B6 i enten
Mir1895 plakater (PST 133903469-133903547) eller i lincRNAs og retroposon funnet i posisjonene 134810372-134810477 (105 NT), 135099190-135100723 (1537 nt), 135158617 -135 158 847 (231 nt), 135188928-135189496 (569 nt), 135390302-135391702 (1401 nt), 135626423-135626782 (360 nt) i ENSEMBL datasett. Derfor er det lite sannsynlig at disse ikke-kodende RNA er ansvarlig for
Ccs3
effekt, selv om et bidrag på slike ikke-kodende RNA kan ennå ikke formelt utelukkes. Blant de 12 kommenterte gener i intervallet (
Cxxc4
,
Tacr3
,
Cenpe
,
Bdh2
,
Nhedc2
,
Nhedc1
,
Cisd2
,
Ube2d3
,
Manba
,
Nfkb1
,
Slc39a8
,
Bank1
), et antall nukleotid-varianter skjelne A og B6 (tabell 1; tabell S1), med enkelt ikke-synonym aminosyre varianter i Manba (L844F) og Bank1 (A375M). Manosidase beta en (Manba) er en lysosomal-enzym, inaktivering av noe som fører til beta-manosidosis, en lysosomal lagringsforstyrrelse med et bredt spektrum av neurologisk involvering [37]. Dermed er det lite sannsynlig å forårsake mottakelighet for CRC en patologisk variant i dette genet. På den annen side, A375M variant i Bank1 (B-celle scaffoldprotein med ankyrin gjentakelser) er en konservativ substitusjon som påvirker en rest som ikke er konservert i Bank1 slektninger (data ikke vist), og dermed er usannsynlig å være patologisk.
A.
Ccs3
locus inneholder 12 kommenterte karakterutskrifter, hvilken posisjon, retning av transkripsjon (pil), og posisjonen til referanse SNP markører vises. B. Plasseringen av langtrekkende amplifiseringsprodukter som brukes for dyp sekvensering av
Nfκb1
er vist i riktig målestokk sammen med posisjonen til de 25 kodende og ikke-kodende eksoner av
Nfκb1
. Posisjonen til 54 bp delesjon intronic identifisert i A /J er vist. Det svarer til tapet av en direkte 54 bp gjenta som er til stede i to kopier i B6 (skyggelagt i grått), som i seg selv består av en tre-repeat struktur (identifisert ved piler over sekvensen). Posisjonen av kopiantallet variant med hensyn til ekson 15 av genet er vist, sammen med en projeksjon av ekson 15 oversatt sekvens på forutsagte proteinstruktur. Forutsagt p50 og IκBγ partier av proteinet er vist, sammen med Rel homologi domene (RHD), ankyrin-gjentakelser (ANK), død domene (DEAD) og glycin-rik region (G) separering p50 og p105 (kalt IκBγ).
Vi har tidligere rapportert RNA transkripsjon profilering studier, sammenligne uttrykket av gener i
Ccs3
intervall både for A vs B6 normal slimhinne, og for normal slimhinne vs. svulster fra mus A [33]. Re-sekvensering av alle kommenterte koding eksoner og ekson /intron grensene ble foretatt for gener som viser høy uttrykk i normal tarmslimhinnen (
Cisd2, Ube2d3
,
Nfκb1 Hotell og
Slc39a8
). På grunn av sin tidligere tilknytning kolonepitelet homeostase, og inflammatorisk respons
in situ
,
Nfκb1
gen av vår En mus lager ble sekvensert i sin helhet (130 kb). Denne kombinerte analysen mislyktes i å identifisere nukleotid-varianter som påvirkes konsensus spleisesetesekvenser (Tabell S1), med unntak av et kopitall variant (CNV) som består av et 54 bp element som ligger 13 nukleotider nedstrøms 3′-spleisesetet av exon 15 ( fig. 3B). Dette elementet er til stede som to eksemplarer i B6 genomisk DNA, men en kopi mangler fra tilsvarende stilling i A. duplisert 54 bp element som finnes i B6 er i seg selv en del av en repeterende DNA motiv består av 3 nær-til-identisk DNA gjentar som inkluderer 3 «spleisesetet av
Nfκb1
ekson 15 i B6 genomet (fig. 3B). Slettingen av en av de to 54 bp elementer i A ødelegger integriteten av 3-repeat motiv som finnes i B6 DNA. Variasjonen i antallet av disse nær-til-identiske DNA-gjentar antydet en mulig forskyvning i sekundær sekvens konformasjon ved dette krysningspunktet mellom exon 15 /intron 15 i genomisk DNA og /eller RNA-forløper. Faktisk foreløpig analyse av sekundærstruktur av et DNA-fragment i løpet av 350 bp som spenner over 3-repeat motiv viser tilstedeværelsen av en antatt pseudoknot i B6 mus (fig. 4A) som er fraværende fra den Et genomisk DNA (fig. 4B). Videre er fraværende i A den 54 bp-element, en kopi av disse, viser kryss-arter sekvenslikhet mellom mus, menneske og flere andre arter (fig. 5A), noe som tyder på en mulig konservert rollen til dette element og tilhørende sekundærstruktur tvers flere arter. Interessant er det synes å være betydelig sekvenskonservering av intron 15 på tvers av arter, mens nukleotidsekvensen og forutsagt
Nfκb1
exon 15 aminosyresekvens som viser dårlig tverr art bevaring (Fig. 5A, 5B). Den spesifikke rolle som denne CNV ville regulere Nfkb1 funksjon ble undersøkt, men så langt har ingen klar mekanisme blitt identifisert (se diskusjon).
pknotsRG verktøy [77] ble brukt til å generere sekundære strukturer for 350 nukleotider segment som spenner over 3-repeat struktur av B6 (A) og sletting variant karakteristisk for A /J (B). Uparede baser er angitt i blått, gult baser identifisere nukleotider involvert i pseudoknot strukturer. Denne analysen identifiserer en pseudoknot med forseggjort intra-molekylær komplementaritet som blir forstyrret i A /J variant allel.
A. ClustalW justering (EBI) av
Nfκb1
intron 15 sekvenser fra forskjellige arter (vist til venstre i justeringen). Referansemusesekvensen fra B6 er vist på toppen, herunder enkelt bokstav aminosyre kode for polypeptidet segmentet kodet av ekson 15. Den genomiske sekvens av A er vist nøyaktig som i fig. 3B, inkludert den slettede 54 bp duplisering ( «—«) og 3-repeat DNA-motiv som overlapper 3»-spleisesetet av exon 15 (piler). Begge muse sekvenser (B6 og A) har blitt justert til tilsvarende rotte, hund, hest og menneske genomiske sekvenser. Bevaring av hver mus nukleotid er representert som skyggebokser nederst med høy (svart) til lav (hvit) nivå bevaring. B.
Nfκb1
cDNA sekvens kodet av ekson 13 til ekson 17 (vises som alternerende understreket og vanlig format for hver ekson) av mus og menneskelige gener har blitt justert. Den minst konservert del av sekvensen som er kodet for av exon 15, hvilken sekvens er i fet skrift. Konserverte nukleotider på tvers av sekvensen er identifisert (*).
Aktivering av NFkB Pathway
Vi undersøkte også aktivering av NFkB bane i A og B6-stammer, ved hjelp av en standard LPS induksjons analyse i primærmakrofager (BMDM). Induksjon av NFkB i makrofager og i intestinale epitelceller er meget like med hensyn til induksjon signaler som er aktive i begge celler (LPS /TLR4, NOD1 /peptidoglykan; TNFa /TNFa-R) og tidskinetikk [38]. BMDM ble utsatt for LPS, og ved forskjellige tidspunkter ble cellene lysert og analysert ved hjelp av western blot for ekspresjon av P50 og p105 Nfκb1 isoformer, total og phospohorylated (p) Iκbα samt total og fosforylert IKB-kinase (p -) Iκkβ (fig 6).. Disse eksperimentene viste tilsvarende nivåer av uttrykk for Nfκb1 p50 og P105 proteiner, og total Iκkβ. Disse nivåene forble uendret under hele behandlingen. Imidlertid aktivering av NFkB veien ved hjelp av LPS var mye sterkere i B6 enn i en makrofager, som bestemmes av utseendet av aktivert p-Iκkβ og samtidig reduksjon i Iκbα langs deteksjon av p-Iκbα, målrettet for degradering. I B6 makrofager, NFKB aktivering forekom raskere og var mer robust enn i A BMDM (Skinetikk av utseende og total mengde p-Iκbα og p-Iκkβ). Samlet viser disse resultater identifisere svakere NFKB aktivering av A-cellene i forhold til B6-celler i respons til stimulering av mikrobiell LPS.
benmarg-avledede makrofager ble fremstilt fra A (
Ccs3
S
) og B6 (
Ccs3
R
) mus og ble stimulert i nærvær av lipopolysakkarid (LPS). På de angitte tidsintervaller (minutter, vist på toppen), ble cellene høstet, lysert og totale proteinekstrakter ble forberedt. Prøvene ble løst på 10% SDS-PAGE og analysert ved immunoblotting med antistoffer mot NFkB (p50, P105), Total og phospohorylated (p-) IκBα samt total og fosforylerte IKB kinaser, (p-) IKKα /β og β- aktin som lasting kontroll. Molekylvekten av individuelle proteiner er vist på høyre side av hver montert panel, som hver er representativ for 3 uavhengige eksperimenter.
uttrykk for Nfκb1 P105 /P50 proteiner i normal slimhinne og i svulster fra A /J
Vi undersøkte uttrykk for Nfκb1 P105 forløper ved immunhistokjemi, ved hjelp av et antistoff (se Materialer og metoder) som gjenkjenner både P105 og p50 Nfκb1 produktet. I denne analysen har vi tatt med på de samme seksjonene både normal slimhinne, dysplastiske lesjoner og mer avanserte adenokarsinomer enten intramucosal eller protubing i intestinal lumen, alt oppnådd ved obduksjon fra en mus 18 uker etter behandling. Flere representative bilder er vist i figur 7. I normal slimhinne, er NFkB proteinfarging sett i kryptene, først og fremst i kjernene i intestinale epitelceller (IEC), og kan også detekteres i sub-populasjon av lamina propria celler. Denne farging er stort sett fraværende i tilstøtende områder av vev hyperplasi /adenomer (fig. 7f /h), så vel som i seksjoner med ytterligere utviklet tumorer (adenokarsinomer) sett i tarmlumen (figur 7b /d). Disse resultatene indikerer et tap av Nfκb1 protein uttrykk i til kreft med lav og høy grad av dysplasi observert i A /J-mus.
Representant immunhistokjemisk farging (IHC) for P105 /P50 Nfkb1 protein i tumorer og tilstøtende kolonepitelet fra mus som bærer homozygot A /J-haplotype på Ccs3. 5 × forstørrelse (a, c, e, g) og tilsvarende 20 × forstørrelse (b, d, f, h) er vist i fem representative svulster.
Diskusjoner
I De siste årene har genom-wide assosiasjonsstudier (GWAS) pekte på en imponerende rekke genetiske faktorer som bidrar til CRC mottakelighet hos mennesker [4], [5]. I tillegg er det stadig mer anerkjent at miljøfaktorer som kosthold, livsstil og mikrobiell flora kan videre bidra til å modulere pene eller uttrykksfullhet genetisk pre-disposisjon. Bidraget av individuelle gener til CRC følsomhet kan vurderes i relevante musemodeller, hvor både genetiske og miljømessige faktorer kan kontrolleres [6]. Likeledes kan «frem genetiske «disseksjon av differensial mottakelighet av innavlede stammer til CRC identifisere nye genet effekter, relevansen av disse kan i ettertid testet for menneskelig CRC [21].
I denne studien har vi redusert størrelsen på
Ccs3 anbefale til ~2.15 Mb, en størrelse mottagelig for posisjonell kloning [39]. Dette intervallet inneholder 12 kommenterte transkripsjoner, hvorav seks er uttrykt i tarmen (Fig. 3A). En av dem koder P105 Nfκb1, en sterk posisjonell kandidat og sentral komponent i NFkB signalering. Selv om mange polymorfe varianter ble identifisert mellom A og B6 for gener i intervallet, ble ikke åpenbart patologiske missense eller tull varianter identifisert i sine kodende områder. Immunhistokjemisk farging (IHC) viste sterke kjerne Nfκb1 ekspresjon i normale kolonepitelet, mens tilstøtende tumorer i det samme vev uttrykt meget lavt nivå Nfkb1-proteinet (fig. 7). Dette tyder på at kolon tumorigenesis er assosiert med nedregulering av P105 Nfκb1 i vårt musemodell av AOM-induserte CRC. I tillegg har vi oppdaget en sletting nær
Nfκb1
ekson 15 i A mus. De 54 bp intronic sletting kart innen en tre-enhet gjenta struktur som overlapper 3 «spleisesetet av
Nfκb1
ekson 15. Den tilsvarende sekvens av intron 15 viser bemerkelsesverdig cross-arter bevaring, og segmentet påvirkes av sletting er anslått til å danne en meget stabil sekundær struktur som er forstyrret i A-genomet. DNA-elementer til stede i introner er kjent for å påvirke RNA-prosessering som sekvenselementer [40] eller som sekundære strukturer som kan bli bundet av dsrna bindende proteiner [41], [42]. I tillegg kan sekundær DNA struktur som ssDNA hårnål sløyfer også påvirke DNA-protein anerkjennelse [43], genekspresjon og DNA rekombinasjon [44]. Hårnåler dannet i DNA gjentar har vært forbundet med en rekke genetiske sykdommer [45], [46], [47]. Viktigere, protein ekspresjonsstudier i LPS-behandlede primære makrofager fra A og B6 mus demonstrere differensial aktivering av NFkB reaksjonsveien i disse cellene. Ved overvåking av tidsavhengig aktivering og maksimal akkumulering av aktivert p-Iκkβ og p-Iκbα målrettet for nedbrytning vi registrert at en mer robust aktivering av NFkB vei er assosiert med en markert reduksjon i følsomhet for CRC. Derfor konvergens av genetisk kartlegging data anbringelse
Nfκb1
innenfor ~2.15 Mb intervallet
Ccs3
, den kjente rollen til NFkB veien i homeostase av tarmslimhinnen (se nedenfor), i påvist tap av NFkB P105 /p50 protein ekspresjon i tumorer sammenliknet med normal slimhinne, den observerte differensial aktivering av denne reaksjonsvei i dyr av forskjellig
Ccs3
haplotyper, og tilstedeværelsen av et skille genetisk endring i genet, sammen peker på
Nfκb1
som en meget sterk kandidat til
Ccs3
effekt.
Nfκb1 er medlem av NFkB familien av transkripsjonsfaktorer som deler en amino-terminal DNA-binding og dimerization Rel homologi domene. Men det mangler en transkripsjon aktiveringsdomene (TAD) og er avhengig av heterodimerisering med TAD-holdige NFkB familiemedlemmer (p65 /RELA, relB, c-Rel) for å aktivere transkripsjon [48]. Nfκb1 blir syntetisert som en forløper P105.
