Abstract
Bakgrunn
Kreft i bukspyttkjertelen er en svært aggressiv sykdom med dystre prognose; særegne er svulsten mikromiljøet preget av en omfattende fibrotisk stroma, noe som favoriserer rask tumorprogresjon. Vi har tidligere rapportert at bukspyttkjertelcancerpasienter har en selektiv Th2 forskyvnings i anti-carcinoembryonic antigen (CEA) CD4
+ T-celle-immunitet, som korrelerer med tilstedeværelsen av en fremherskende Gata-3
+ tumor lymfoid infiltrat. Dette har negative effekter på både effektive anti-tumor immunitet og ytterligere favorisering fibrinogenesis. Hensikten med denne studien var å vurdere om Th2 polarisering av CEA-spesifikke CD4
+ T celler fra bukspyttkjertelen kreftpasienter er stabil eller kan tilbakestilles ved immunmoduler cytokiner.
metodikk /hovedfunnene
Vi først undersøkt innvirkningen av IL-12 og IL-27, som enkle midler og i forbindelse, på polarisasjonen av CEA-spesifikke CD4 Th2
+ T-cellekloner fra en kreft i bukspyttkjertelen pasient. Vi fant at bare kombinasjonen av IL-12 og IL-27 modifisert polarisasjonen av Th2-effektorer ved begge reduksjon av IL-5, GM-CSF og IL-13 og induksjon av IFN-γ produksjonen, som varte etter cytokin fjerning. For det andre, evaluerte vi virkningen av den kombinerte behandling med polyklonalt CEA-spesifikke CD4
+ T-celler i korte tids re-stimulering analyser. Etter avtale med data innhentet med kloner, fant vi at den kombinerte behandlingen funksjonelt modulert Th2 polarisering av CEA-spesifikke CD4
+ T-celler og forbedret eksisterende Th1 typen immunitet.
Konklusjoner /Betydning
Samlet våre resultater viser at tumor antigen spesifikke Th2 CD4
+ T-celler i bukspyttkjertelen er utstyrt med funksjonelle plastisitet. . Derfor lokoregionalt cytokiner levering eller målrettet terapi basert på antistoffer eller molekyler rettet mot svulsten stroma kan forbedre anti-tumor immunitet og lindre fibrose, uten systemisk toksisitet
Citation: Tassi E, Braga M, Longhi R , Gavazzi F, G Parmiani, Di Carlo V, et al. (2009) Ikke-Redundant rolle for IL-12 og IL-27 i Moduler Th2 Polarisering av carcinoembryonic antigenspesifikk CD4 T-celler fra bukspyttkjertelen kreftpasienter. PLoS ONE 4 (10): e7234. doi: 10,1371 /journal.pone.0007234
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA
mottatt: 17 juli 2009; Godkjent: 09.09.2009; Publisert: 02.10.2009
Copyright: © 2009 Tassi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av det europeiske fellesskap (DC-THERA), den italienske Ministry of Health, det italienske departementet for universitet og forskning og Rich Foundation (LDP Pancreas Cancer Research Project). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en svært aggressiv sykdom med dystre prognose [1]. Peculiar er svulsten mikromiljøet, som består av fibroblaster, bukspyttkjertelen stelceller, endotelceller, immunsystemet og endokrine celler og perinevral spredning og det antas å spille en aktiv rolle i sykdomsutviklingen og aggressivitet [2].
Nylig [3], undersøkte vi kvaliteten på det anti-tumor CD4
+ T-celleresponser i PC-pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon, ved å sammenligne den anti-carcinoembryonic (CEA) og anti-viral CD4
+ T-celle immunitet. Vi har funnet at anti-CEA CD4
+ T-celle-immunitet var tilstede i et vesentlig lavere antall PC-pasienter sammenlignet med normale donorer. Viktigst, mens CD4
+ T-celler fra normale donorer produseres hovedsakelig granulocytter makrofager kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og pro-inflammatoriske (
ie
, Th1) cytokin interferon-γ (IFN-γ ), CD4
+ T-celler fra pasienter som produseres hovedsakelig interleukin (IL) -5 og IL-13, som viser en skjevhet mot en anti-inflammatorisk (
dvs.
, Th2) type. Tvert imot, den grad av anti-virus-CD4
+ T-celleimmunitet var sammenlignbare mellom de to gruppene, og viste en Th1 type. Etter avtale med Th2 Forskyvning observert i sirkulerende CEA spesifikke CD4
+ T-celler, immunhistokjemisk analyse av tumor infiltrere lymfocytter viste et betydelig høyere antall GATA-3
+ (Th2) sammenlignet med T-bet
+ (Th1) lymfoide celler, som støtter en Th2 skew også på svulststedet.
det har vist seg at fibrose, som er et kjennetegn på PC, er sterkt knyttet til utviklingen av Th2-responser gjennom aktivering av Th2-cytokiner av kollagen syntese av fibroblaster og samtidig redusert nedbrytning av kollagen i fravær av Th1 cytokiner [4]. Derfor er nærværet av Gata-3
+ lymfoide celler, som vi observerte [3] i pankreatisk tumor mikromiljøet, kan ytterligere bidra til fibrose og lokal behandling for å redusere nærværet av Th2-cytokiner kan være fordelaktig.
Blant de ulike faktorer som fremmer CD4
+ T celler polarisering, cytokiner har en avgjørende rolle [5]. IL-12, et produkt av fagocytter og dendrittiske celler som svar på mikrobiell stimulering, har en viktig rolle i å fremme Th1 polarisering og i å forbedre CD4
+ T-celler proliferasjon [6]. Dessuten har IL-12 blitt vist å forårsake reversering av Th2 polarisering i humane allergen-spesifikke Th2-celler [7], [8] og, i synergi med IL-18, for å stimulere IFN-γ produksjon av perifert blod mononukleære celler (PBMC ) fra lepromatous spedalske [9]. IL-27, et nylig identifisert medlem av IL-12-familien [10], stimulerer også proliferasjon og synergizes med IL-12 i å utløse IFN-γ produksjon av naive CD4
+ T-celler [10], [11]. Mer nylig er det blitt vist [12] på at IL-27 inhiberer Th2 polarisering av naive CD4 murint
+ T-celler og undertrykker Th2 cytokiner produksjon fra
in vitro
polariserte Th2-celler.
i denne studien undersøkte vi muligheten for å hente den Th2 polarisering av
bona fide in vivo
primet CEA-spesifikke CD4
+ T celler fra PC-pasienter ved hjelp av IL-12 og IL-27 som immunmoduler midler. Vi har funnet at tilstedeværelsen av IL-27 alene var tilstrekkelig til å hemme IL-5 og IL-13 sekresjon, mens IL-12 sterkt stimulert IFN-γ produksjon med mindre effekter på Th2-cytokiner sekresjon; kombinasjonen av de to cytokiner indusert en funksjonell modulering av Th2 polarisering.
Materialer og metoder
emner og cellelinjer
PBMC ble oppnådd fra to pasienter PC (pt # 15 og pt # 43) og en frisk donor (ND # 11) av en kohort av fag der vi tidligere har oppdaget at anti-CEA CD4
+ T-celler [3]. Pasientene ble trukket før operasjonen og iscenesettelse av sykdommen var T3N1M0 i begge tilfeller. Den institusjonelle etiske komité (Comitato Etico Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele) hadde godkjent studieprotokollen og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle givere før blodprøvetaking. EBV-transformerte lymfoblastoide cellelinjer (LCL) brukt og deres human leukocytt antigen (HLA) dr typen var: SKP-LCL (β1 * 0405 *, 1401; β3 * 02), som ble etablert i vårt laboratorium fra en frisk donor; BM21 (β1 * 1101; β3 * 0202) og Pitout (β1 * 0701; β4 * 0101), vennlig levert av K. Fleischhauer (San Raffaele Scientific Institute, Milan). LCL ble dyrket i RPMI 1640 (BioWhittaker) inneholdende 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 50 mg /ml streptomycin (BioWhittaker), og 10% FCS (BioWhittaker).
Syntese av CEA peptider
CEA
99-111, CEA
117-129, CEA
177-189 /355-367, CEA
425-437, CEA
568-582, og CEA
666-678 sekvenser ble syntetisert ved hjelp av den trinnvise fastfase-metode som tidligere beskrevet [13]; peptidene ble lyofilisert, rekonstituert i DMSO (Sigma-Aldrich) ved 10 mg /ml og fortynnet i RPMI 1640 etter behov.
In vitro
forplantning av CD4
+ T-cellekloner
Polyclonal CEA
177-189 /355-367 spesifikke CD4
+ T-celler fra pt # 15, oppnådd etter 13 dager med kortsiktig kultur med den spesifikke peptid og autologe CD4
+ -depleted PBMC som antigenpresenterende celler (APC), ble klonet ved begrensende fortynning som beskrevet i [14]. Klonene ble dyrket i X-VIVO 15 (BioWhittaker) supplert med 5% varmeinaktivert sammenslått humant serum (BioWhittaker), penicillin (100 U /ml; BioWhittaker), streptomycin (50 mg /ml, BioWhittaker), og IL-2- (250 IE /ml; Proleukine, Novartis). Klonene ble re-stimulert hver 15-21 dager med phytohemagglutinin (PHA) (0,5 mikrogram /ml, Sigma-Aldrich) og bestrålt allogenic PBMC
CD4
+ T-cellekloner stimulering analysen
CD4
+ T-celler (10
4 /brønn) ble dyrket i triplikat i 96-U bunnplatene i nærvær av bestrålt LCL (5 x 10
4 /brønn), eller bestrålt autologe eller HLA-DRβ3 * 02 avstemt PBMC (10
5 /brønn) som APC pulsert med CEA
177-189 /355-367 peptid (10 pg /ml), eller det rensede CEA-protein (30 ug /ml, BiosPacific), eller normalt humant IgG (30 ug /ml, Venimmun N, Aventis Behring), som negativ kontroll. I hemmingsforsøk de følgende monoklonale antistoffer (mAbs) (Beckton Dickinson) ble anvendt: anti-HLA-DR (100 ng /ml), anti-HLA-DP (3 ug /ml) og anti-HLA-DQ (125 ng /ml). I peptid-titrering eksperimenter ble de følgende konsentrasjoner av peptid tilsettes: 20-10-5-1-0,5-0,1-0,05-0,01 og 0005 ug /ml. I forsøkene med immunmodulerende cytokiner, rekombinant, humant IL-12 og /eller IL-27 (R IL-27, som monoterapi (0,01-1-10-100 ng /ml); kombinerte IL-12 og IL-27-behandling (5 ng /ml + 100 ng /ml, henholdsvis). Etter 48 timer ble supernatanten fra hver brønn fjernet og slått sammen for cytokiner «deteksjon ved hjelp av ELISA, i henhold til produsentens instruksjoner: GM-CSF (sensitivitetsterskelen: 31,25 pg /ml) og transformerende vekstfaktor (TGF) -β1 ( sensitivitetsterskelen: 62,5 pg /ml) (Biosource International Inc.); IFN-γ, IL-5 og IL-13 (sensitivitetsterskelen: 15,6 pg /ml) (Mabtech) og IL-17 (eBioscience) (sensitivitetsterskelen: 7,8 pg /ml). IFN-γ, tumor nekrose faktor (TNF) -α, IL-10, IL-4, IL-5 og IL-2-frigjøring ble også bestemt ved hjelp av cytometrisk Perler Array (CBA) Humant Th1-Th2 cytokiner Kit (sensitivitetsterskelen .: 20 pg /ml), (Becton Dickinson), etter produsentens instruksjoner
Kortsiktig kultur og cytokine release assay
Purified CD4
+ T-celler ble stimulert gang
in vitro
i nærvær av CEA-peptider som tidligere beskrevet [3]. I korthet, CD4
+ T-celler (3 x 10
4 /brønn), ble renset fra total PBMC av magnetiske kuler (Miltenyi Biotec) ble sådd ut i 96-brønners plater i fem replikater for hver tilstand og dyrket i X -VIVO 15 supplert med penicillin (100 U /ml), streptomycin (50 mg /ml) og 3% varme-inaktivert sammenslått humant serum (vevskulturmedium, TCM), i nærvær av bestrålt CD4
+ – uttømt PBMC som APC, ved en CD4
+ APC-forhold på 01:03. Stimuli var: PHA (10 ug /ml; Sigma-Aldrich), som positiv kontroll; CD4
+ T-celler i nærvær av APC bare, som basislinje (blank); og hver enkelt peptid (10 pg /ml). Rekombinant humant IL-12 (5 ng /ml) og IL-27 (100 ng /ml) ble tilsatt er angitt. På dag 7, ble halvparten medium fra hver brønn fjernet og etterfylt med frisk TCM inneholdende IL-2 (25 IE /ml) og IL-12 og IL-27 der det er angitt, uten noen ytterligere antigen stimulering. På dag 14, ble supernatanten oppsamlet for IFN-γ, IL-5, IL-13 og GM-CSF-frigivelse ved hjelp av ELISA, som beskrevet ovenfor.
Strømningscytometri
Cytofluorimetric analyser ble utført på en FACSCalibur og analysert ved hjelp av FlowJo programvare (Tre Star, Inc.). De følgende antistoffer ble anvendt: anti-CD3-APC, anti-CD4-PercP, anti-CCR4-PE, anti-CCR5-FITC (Pharmingen) og anti-CRTH2-PE (Miltenyi Biotec). TCRVβ ble bestemt med IO Test Beta Mark kit (Immunotech), etter produsentens anvisninger.
Resultater
Karakterisering av CEA
177-189 /355-367 spesifikke Th2-cytokiner fremstilling av CD4
+ T-cellekloner
Vi har tidligere rapportert at pasienter har PC-en Th2 skew i anti-CEA CD4
+ T-celle-immunitet og samtidig opprettholde en intakt repertoar av antivirale Th1-celler [3- ]. For bedre å karakterisere trekk ved denne anti-CEA responsen vi klonet ved begrenset fortynning CEA
177-189 /355-367 spesifikke polyklonale CD4
+ T celler fra pt # 15, oppnås etter en
in vitro
kortsiktig re-stimulering av CD4
+ T celler med autolog APC pulset med relevant peptid; en metode som vi tidligere viste ikke å favorisere
in vitro
priming [15]. Polyklonale cellene produserte høye nivåer av IL-5 og svært lite av GM-CSF, men ingen IFN-γ [3], noe som tyder på tilstedeværelsen av
in vivo
primet CD4
+ T-celler med Th2-egenskaper. To kloner ble oppnådd, som uttrykk for det samme T-celle reseptor (TCR) vp-kjeden,
dvs.
Vβ17 (Fig. 1E), og derfor har vi brukt dem likegyldig i de følgende forsøk blir
bona fide
samme klon.
Profil cytokin utskilt (A)
. CD4
+ T-celler ble dyrket sammen med bestrålt APC i nærvær eller fravær av det aktuelle peptid på en 2-dagers stimulering analysen, og konsentrasjonen av de angitte cytokiner i supernatantene ble bestemt enten ved CBA (øvre panel) eller ELISA (nedre panel). Dataene er representative for minst seks eksperimenter; for ELISA-analyser, er dataene hjelp av duplikat bestemmelse ± SD.
HLA begrensning (B)
. CD4
+ T-celler ble dyrket sammen med bestrålt autolog PBMC eller HLA-DR matchet LCL, som angitt, i nærvær eller fravær av det aktuelle peptid (10 pg /ml) og i fravær eller nærvær av anti-HLA dr, anti-HLA-DP og anti-HLA-DQ mAbs: etter 2 dager IL-5 ble testet. Øvre panel:% inhibering ble beregnet på grunnlag av IL-5 sekresjon av CD4
+ -T-celler i nærvær av det aktuelle peptid (2 ng /ml i 0 ng /ml av bakgrunnsnivå). Dataene er representative for to (øvre panel) og fire (nedre panel) eksperimenter og er hjelp av duplikat besluttsomhet ± SD. Responses betydelig høyere enn de blanke feltene (
dvs.
, basal nivåer av cytokiner sekresjon fra CD4
+ T celler i nærvær av LCL bare) er angitt som: ***, p 0,001 (bestemt av uparet, ensidige Student t-test).
Dose-responskurver (C)
. CD4
+ T-celler ble dyrket med titrerte doser av det relevante peptidet i nærvær av bestrålt APC i en 2-dagers stimulering analysen og testet med hensyn til IL-5 og IL-13 frigivelse. Dataene er hjelp av duplikat besluttsomhet ± SD.
Anerkjennelse av de innfødte protein (D)
. CD4
+ T-celler ble dyrket i nærvær av bestrålte PBMC, som APC pulsert med enten det relevante peptid (10 pg /ml) som positiv kontroll, eller det rensede CEA-protein (30 ug /ml) eller humant IgG ( 30 ug /ml) som negativ kontroll i en 2-dagers stimulering analysen og testet med hensyn til IL-13 frigivelse. Dataene er hjelp av duplikat besluttsomhet ± SD. Responses betydelig høyere enn de blanke feltene (
vil si
, basal nivåer av cytokiner sekresjon fra CD4
+ T-celler i nærvær av PBMC bare.) Er angitt som: **, 0,001 p 0,05; ***, P 0,001 (bestemt av uparet, ensidige Student t-test).
TCRVβ uttrykk (E)
. Testen ble utført med IO Test Beta Mark kit. Kvadranter ble satt basert på isotypekontrollantistoff farging.
Surface uttrykk for Th2 (CRTH2 og CCR4) og Th1 (CCR5) markører (F)
. Fylt histogrammet representerer isotype kontroller; åpne histogrammer prøver farget med de angitte markører.
karakterisering av CEA
177-189 /355-367 spesifikke CD4
+ T-kloner er avbildet i Figur 1. CD4
+ T-cellekloner som er produsert hovedsakelig IL-5, IL-13 og GM-CSF, samtidig som de frigjøres lav mengde av IL-4 og IFN-γ og ikke noe IL-2, TNF-α, TGF-β1, IL-10 eller IL-17 (fig. 1A). Selv om cellene produserer liten mengde av IL-4, dette mønsteret av cytokinutskillelse er konsistent med en Th2 polarisering.
Å identifisere begrensning element vi først testet anerkjennelse av CD4
+ T celler av peptid lastet autolog APC i fravær eller i nærvær av anti-HLA-DR, anti-HLA-DP og anti-HLA-DQ mAbs. Som vist på fig. 1B (øvre panel), tilsetning av anti-DR mAb hemmet (65,5%) IL-5 produksjon av CD4
+ T-celler, noe som bekrefter at en HLA-DR-molekylet presentert peptidet. For å identifisere HLA-DR presentere allel, ble cellene deretter utfordret med det relevante peptidet i nærvær av LCL som uttrykker forskjellige kombinasjoner av de HLA-DRB1, B3 og ß4 alleler som uttrykkes av pasienten (angitt i fig. 1B) og testet for IL-5 release. Som vist på fig. 1B (nedre panel), CD4
+ T-celler gjenkjente peptidet i forbindelse med HLA-DRβ3 * 02, som er allele deles mellom pasienten og de to presentere LCL (BM21 og SKP).
Vi utførte også peptid titreringskurven hvori CD4
+ T-celler ble utfordret med økende konsentrasjon av det relevante peptidet (fig. 1C). Forsøkene viste at uttrykket av klone av en svært lav affinitet TCR.
Vi viste tidligere at CEA sekvensen gjentas i posisjonene 177-189 og 355-367 inneholder en
in vitro
naturlig behandlet epitop presentert i forbindelse med flere HLA-DR-alleler [16]. For å bekrefte disse data, ble CD4
+ T-cellekloner utfordret med CEA-protein eller normalt humant IgG, som en negativ kontroll, og analysert for IL-13 frigivelse. Som vist på fig. 1D, CD4
+ T-celler som spesifikt produseres IL-13 i nærvær av peptidet og, viktigst av alt, i nærvær av CEA, men ikke av kontroll-protein (
ie
, humant IgG), viser at selv om CEA
177-189 /355-367 spesifikke CD4
+ T-cellekloner bære en lav affinitet TCR de anerkjenner den innfødte epitop.
til slutt, for å verifisere om Th2 cytokin profilen korrelert med den fenotypiske markører for Th1 og Th2-celler, ble klonene testet for ekspresjon av CCR5, som fortrinnsvis uttrykkes av Th1-celler [17] og av CRTH2 og CCR4, hvis ekspresjon karakteriserer Th2-celler [17], [18]. Som forventet fra cytokin profilen, CD4
+ T-celler uttrykt på overflaten både CRTH2 og CCR4 mens CCR5 ekspresjon var fraværende (fig. 1F).
Kombinert IL-27 og IL-12 hemmer utskillelsen av Th2-cytokiner og stimulerer IFN-γ produksjon av CEA-spesifikke CD4
+ T-celler
Vi testet ved muligheten for å modulere polarisasjonen av CEA
177-189 /355-367 spesifikk Th2 celler ved de immunmoduler cytokinene IL-27 og IL-12.
for å oppnå dette målet vi evaluert første effekten av økende konsentrasjoner av IL-27 eller IL-12, som enkle midler, på produksjon av CD4
+ T-celler til Th1 og Th2-cytokiner i nærvær av det aktuelle peptid. Tilsetningen av IL-27 ble redusert på en doseavhengig måte-IL-5 og IL-13 produksjon, mens ingen effekt ble observert for IL-4 og IFN-γ (fig. 2A). Tilsetningen av IL-12 nådd sin platå effekt allerede ved en dose på 5 ng /ml (figur 2B.): IL-5 produksjon er redusert også i nærvær av IL-12, mens, ved forskjell i IL-27, effekten på IL-13 var marginal som om IL-4. Viktigere, og ved forskjell i IL-27, IFN-γ produksjon ble sterkt øket (fig. 2B). Disse data viser at både cytokiner påvirker effektor funksjon av CEA-spesifikke CD4
+ T-cellekloner, men verken IL-27 eller IL-12, som enkle midler, var optimal ved modulering av deres Th polarisasjon.
(A).
CD4
+ T-celler ble dyrket med det relevante peptidet og bestrålt LCL som APC i nærvær av økende konsentrasjoner av IL-27 (0-0,1-1-10- 100 ng /ml); etter 2 dager cytokin frigivelse ble evaluert ved CBA (IL-5 IL-4 og IFN-γ) eller ELISA (IL-13). Dataene for IL-13 er hjelp av duplikat besluttsomhet ± SD. CD4
+ T
(B).
-Celler ble dyrket og testet som beskrevet ovenfor, i nærvær av økende konsentrasjoner av IL-12 (0-5-20 ng /ml). Den basale nivået av cytokiner sekresjon av CD4
+ -T-celler i nærvær av LCL bare ble subtrahert fra de samplingsverdier og er omfattet mellom 0 og 0,018 ng /ml. Dataene er representative for minst tre forsøk.
For det andre, vurderte vi effekten av den kombinerte behandlingen med de to cytokiner (fig. 3). Når de anvendes ved 5 ng /ml, IL-12, som et enkelt middel, induserte 61% inhibering av IL-5, og hadde ingen effekt på IL-13 og GM-CSF, mens IFN-γ produksjon hadde nesten en 10-ganger økning . IL-27 behandlingen alene ved den høyeste konsentrasjon viste 78%, 30% og 53% inhibering av IL-5, IL-13 og GM-CSF, henholdsvis; mens bare 1,4 ganger økning i IFN-γ produksjon. Når de brukes i kombinasjon ved de beste konsentrasjoner, ble en synergistisk effekt som observeres ved inhibering av IL-5 (91%) og IL-13 (48%), mens, som forventet fra resultatene av enkle midler, GM-CSF-sekresjon ble ikke ytterligere hemmet og IFN-γ produksjon ble ikke ytterligere øket.
CD4
+ T-celler ble dyrket med det relevante peptidet i fravær (basal) eller i nærvær av IL-12 (5 ng /ml), som monoterapi; eller IL-27 (100 ng /ml), som monoterapi; eller kombinerte IL-12 og IL-27 i en to-dagers stimulering analysen og deretter testet med hensyn til cytokin frigivelse av CBA (IL-5 og IFN-γ) eller ELISA (IL-13 og GM-CSF). Dataene for IL-13 og GM-CSF er middel for duplikat bestemmelse ± SD. Den basale nivået av cytokiner sekresjon av CD4
+ -T-celler i nærvær av LCL bare ble subtrahert fra de samplingsverdier og er omfattet mellom 0 og 0,006 ng /ml. Dataene er representative for fem forsøk.
Modulation av Th2 polarisering av IL-12 og IL-27 varer etter cytokiner fjerning
For å verifisere om modulering av Th2 polarisering innhentet av kombinert behandling med IL-12 og IL-27 var stabil, utviklet vi et eksperiment hvori CEA-spesifikke CD4
+ T-celler ble først stimulert med det relevante peptidet i fravær eller i nærvær av IL-12 og IL- 27 (5 og 100 ng /ml, henholdsvis). For det andre, ble cellene stimulert i fravær av cytokinene holdt i kultur i 14 dager i TCM pluss IL-2 og anvendt som kontroller. Celler ble behandlet med cytokiner ble delt i to porsjoner og dyrket under forskjellige betingelser for de følgende 14 dager: i en tilstand cytokinene ble fjernet etter 2 dager, og cellene dyrket som kontrollene i TCM pluss IL-2, i den andre tilstanden cytokiner ble holdt i kultur hele tiden og erstattes hver to til tre dager. Ved dag 14 ble celler fra hver av de tre betingelsene testet i en to-dagers stimulering analysen med det relevante peptid og frigjøring av cytokiner testet. De oppnådde resultater er vist i figur 4. Kontrollceller bekreftet produksjon av IL-5, IL-13, og ingen IFN-γ, mens cellene holdt i kultur kontinuerlig med cytokinene bekreftet 98% og 74% inhibering av IL-5 og IL- 13 produksjon, henholdsvis, og en 11-ganger økning for IFN-γ. Viktigere, celler som cytokiner ble fjernet etter 2 dager med kultur viste fortsatt 70% og 47% hemming i IL-5 og IL-13 produksjon, henholdsvis, og en 5-dobling i IFN-γ utgivelse.
(A)
. CD4
+ T-celler ble dyrket med det relevante peptidet og enten venstre ubehandlet (peptid) eller behandlet i 2 dager med kombinerte IL-12 (5 ng /ml) og IL-27 (100 ng /ml) og deretter vasket og ubehandlet (IL-12 + IL-27 (2 dager)) eller behandlet kontinuerlig med IL-12 og IL-27 ved de samme doser på 2 uker (IL-12 + IL-27 (14 dager)). På dag 14 ble cellene undersøkt på nærvær eller fravær av det relevante peptidet og den spesifikke IL-5, IL-13 og IFN-γ frigivelse i supernatanten testet ved hjelp av ELISA. Dataene er hjelp av duplikat besluttsomhet ± SD. Den basale nivået av cytokiner sekresjon av CD4
+ T-celler i nærvær av LCL bare ble subtrahert fra de samplingsverdier, og var som følger: IL-5 (0093 ± 0006 ng /ml), IL-13 (0468 ± 0028 ng /ml) og IFN-γ (0 ng /ml). Dataene er representative for fire eksperimenter. (
B
). Surface uttrykk for CRTH2, CCR4 CCR5 av CD4
+ T-celler etter behandling med kombinert IL-12 + IL-27. Analyse ble utført på celler behandlet i 2 dager og deretter til venstre ubehandlet for en ytterligere uke. Fylt histogrammet representerer isotype kontroller; åpne histogrammer prøver farget med de angitte markører.
For å verifisere om den kombinerte behandlingen også påvirket Th2 overflaten fenotype, CD4
+ T-celler, som hadde vært re-stimulert i nærvær av cytokiner i 2 dager og deretter dyrket i ytterligere syv dager i fravær av cytokiner ble testet for ekspresjon av CRTH2, CCR4 og CCR5. Som vist i figur 4B, cellene, samtidig som CRTH2 og CCR4 som i fravær av behandling (fig. 1F), ervervet ekspresjon av CCR5.
Samlet viser disse resultatene at modulering av Th2 polarisering av CEA -spesifikke CD4
+ T-cellekloner som oppnås med den kombinerte behandling er varig, men med redusert effektivitet, selv etter fjerning av cytokiner og er forbundet med funksjonelle og fenotypiske trekk ved Th0 eller både Th1 og Th2-celler.
IL-12 og IL-27 kombinasjon forbedrer Th1 og modulerer Th2 polarisering av spontan anti-CEA CD4
+ T-celle responser
for å verifisere effekten av kombinert IL-12 og IL-27-behandling på polarisering av CEA-spesifikke CD4
+ T-celler i en mer fysiologisk miljø og på polyklonalt nivå, CD4
+ T-celler fra pasient (pt # 43) og normal donor (ND # 11) ble testet i en 14-dagers
in vitro
re-stimulering analysen for anerkjennelse av de aktuelle peptider i fravær eller i nærvær av de to immunmoduler cytokiner (figur 5). Som tidligere rapportert i [3], i fravær av de immunmodulerende cytokiner CD4
+ T-celler fra pt # 43 fremstilt IL-5 i nærvær av CEA
425-437; IL-13 i nærvær av CEA
568-582; GM-CSF i nærvær av CEA
568-582 og IFN-γ i nærvær av CEA
568-582 og, skjønt i en mye lavere, men betydelig grad, av CEA
177-189 /355 -367 (fig. 5,
venstre panel
s, grå søyler
). Kombinasjonen av IL-12 og IL-27 nesten opphevet IL-5 (99% inhibering) og IL-13 (76% inhibering), mens indusert
de novo
IFN-γ sekresjon i nærvær av CEA
425-437, forsterket (9-gangers økning) IFN-γ produksjon i nærvær av CEA
177-189 /355-367 og bekreftet IFN-γ mens sterkt redusert IL-13 (98% inhibering) og GM- CSF (80% hemming) produksjon i nærvær av CEA
568-582 (fig. 5,
venstre panel
s, svarte striper
). Som tidligere rapportert [3], i fravær av de immunmodulerende cytokiner CD4
+ T-celler fra ND # 11 viste signifikant proliferasjon [3] og meget liten mengde av IFN-γ sekresjon i nærvær av CEA
99- 111, mens ingen signifikant produksjonen av IL-5 og GM-CSF ble observert i nærvær av ethvert peptid (fig. 5,
panel rett
s, grå søyler
). IL-13 meldingen ble ikke testet. Cytokin behandling sterkt utvidet (23 gangers økning) IFN-γ frigivelse mot CEA
99-111, mens, som forventet, ingen effekt på IL-5 og GM-CSF-produksjon ble observert (fig. 5,
rett panel
s, svarte striper
). I begge tilfeller er de to cytokiner indusert modulering av Th2 eller forsterkning av Th1-responser som allerede var til stede, selv ved meget lavt nivå, i fravær av cytokiner kombinasjon, mens det ikke var noen tegn på
de-novo
innpassing av CEA peptider.
CD4
+ T celler fra pt # 43 og ND # 11 ble dyrket i fem paralleller, som beskrevet i materialer og metoder, med de følsomme CEA peptider, i fravær ( grå søyler) eller i nærvær (svarte søyler) av den kombinerte behandling med IL-12 (5 ng /ml) pluss IL-27 (100 ng /ml). Etter 14 dager, IL-5, IL-13, GM-CSF og IFN-γ frigivelse ble testet ved hjelp av ELISA. Innrapporterte data er hjelp av duplikat besluttsomhet ± SD. Stiplede linjer identifisere det basale nivået av cytokin sekresjon i nærvær av APC bare. n.d. = Ikke bestemt.
Sammen er disse resultatene tyder på at IL-12 og IL-27 fremme funksjonell modulering av Th2-type og forsterkning av eksisterende Th1-type anti-CEA svar.
Diskusjoner
i denne studien rapporterer vi at foreningen av immunmoduler cytokiner IL-12 og IL-27 er i stand til å modulere funksjonell polarisering av anti-CEA Th2 CD4
+ T-celler fra PC-pasienter og for å forbedre pre-eksisterende Th1 typen anti-CEA CD4
+ T-celler.
Vi viser at behandling med IL-27 som monoterapi hemmet både IL-5 og IL-13 utgivelse av CEA-spesifikke Th2-celler. Dette bekrefter i det menneskelige systemet en tidligere rapport som beskrev IL-27 som kunne undertrykke Th2 cytokiner produksjon fra
in vitro
polarisert muse Th2-celler [12]; men på forskjellen med denne rapporten, i vårt system hvor vi avtale med
bona fide in vivo
polarisert CD4
+ T-celler IL-27 ikke hadde noen effekt på IFN-γ sekresjon. Viktigere, vi avslørte også en ny funksjon for IL-27 som er inhiberingen av GM-CSF-dannelse. Når IL-12 ble anvendt som et enkelt middel, det sterkt forbedret IFN-γ produksjon, mens hadde bare en marginal virkning i å undertrykke frigjøring av Th2-cytokiner, og av IL-13 spesielt og ingen effekt på GM-CSF. Dette er også til forskjell fra tidligere rapporter [7], [8], hvori IL-12 ble vist å vende tilbake polarisering av human allergenspesifikke Th2-celler ved indusering av IFN-γ og inhibering av IL-4-produksjonen. Faktisk, i tilfelle av de kloner IL-4, som imidlertid ikke ble produsert i store mengder, ikke ble inhibert hverken av IL-27 eller IL-12. Den eneste Th2 cytokin påvirket av IL-12 var IL-5; denne funksjonen ble også tidligere rapportert for T-celle kloner hentet fra bronchoalveolar utskylling av astmapasienter [19].
Sammen viser vi at i vårt system IL-12 og IL-27 ikke-redundante roller i modulere polarisasjonen etablert CEA-spesifikt Th2 CD4
+ T-celler, og at modulering av den funksjonelle og fenotypiske Th2 polarisering av anti-tumor CD4
+ effektorer inn i en Th0 typen ble oppnådd bare i nærvær av det kombinerte synergistisk behandling med de to cytokiner. Modulering av cytokinene «produksjon var, i det minste i tilfelle av klonene, for det meste funksjonell med induksjon av en ganske særegen fenotype hvor CCR4, CCR5 CRTH2 og uttrykk side om side (
ie
, ikke typisk av enten Th1 eller Th0 celler). Preliminære eksperimenter (data ikke vist), hvor vi evaluert cytokiner «produksjon på enkeltcelle-nivå av intracellulær farging, indikerte at:
i
) IL-27 alene påvirket ikke prosentandelen av IL-5 og IL-
