Abstract
stromal elementer i en svulst samhandle med kreftceller for å skape en mikromiljøet som støtter tumorvekst og overlevelse. Adrenomedullin (ADM) er en autokrin /parakrint faktor produseres av både stromale celler og kreftceller til å lage en slik mikromiljøet. Under differensiering av makrofager, blir ADM produsert som respons på proinflammatoriske stimuli og hypoksi. I denne studien undersøkte vi rollen til ADM som en vekstfaktor for eggstokkreft celler og som en modulator av makrofager. Vi har også analysert ADM uttrykk nivåer i en retrospektiv klinisk studie med nanofluidic teknologi og vurdering av ADM på gennivå i 220 kreftpasienter på eggstokkene. For å studere effektene av ADM, eggstokkreft cellelinjer A2780, OVCAR-3, og HEY og deres multiresistent kolleger ble brukt til spredning analyser, mens monocytter fra friske donorer ble differensiert in vitro. ADM var en svak vekstfaktor, som avslørt av spredning analyser og cellesyklusanalyse. Etter dyrking kreftceller i henhold til spenn forhold, slik som serum sult og /eller hypoksi, ble ADM funnet å være en overlevelsesfaktor i HEI, men ikke i andre cellelinjer. I makrofager, ADM viste aktivitet på spredning /differensiering, først og fremst i type 2 makrofager (M2). Uventet, klinisk studie viste at høyt uttrykk for ADM var knyttet til positive utfall og til kreft med lav CA125. Som konklusjon, selv om in vitro-ADM var en mulig faktor i biologisk aggressivitet, denne muligheten ble ikke bekreftet hos pasienter. Derfor vil bruk av ADM antagonist være upassende i å håndtere ovarian kreftpasienter
Citation. Baranello C, Mariani M, Andreoli M, Fanelli M, Martinelli E, Ferrandina G, et al. (2012) Adrenomedullin i Ovarian Cancer: Foe In Vitro og Friend In Vivo? PLoS ONE syv (7): e40678. doi: 10,1371 /journal.pone.0040678
Redaktør: Konradin metze, University of Campinas, Brasil
mottatt: 19 mars 2012; Akseptert: 12. juni 2012; Publisert: 30.07.2012
Copyright: © Baranello et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av en bevilgning fra Associazione Oppo e le sue stanze ONLUS (www.oppostanze.it), av Ruth C. Donovan Cancer Research Program og av en sjenerøs donasjon fra Mr. og Mrs. Ruggles. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft mikromiljøet er et tema som nylig har begynt å interesse etterforskere. For års forskning fokusert på kreftcellen i seg selv, men en fast tumor inneholder også ikke-ondartede stromale elementer, inkludert makrofager, lymfocytter, mastceller, endotelceller, fibroblaster, myofibroblasts, pericytes og stamceller, som alle interagerer med cancerceller til skape en mikromiljøet som støtter tumorvekst og overlevelse [1], [2]. Å forstå den nøyaktige sammensetning av tumoren mikromiljøet kan være nyttig for utvikling av rasjonelle terapeutiske tilnærminger.
ovarialcancer oppviser en kompleks cytokin-kjemokin nettverk [3]. Reseptorer for kjemokiner er uttrykt i en rekke av infiltrerende celler, innbefattende makrofager, som er rekruttert av kjemokiner [4]. Denne interaksjonen er en to-veis prosess: ovarian cancer celler er også i stand til å modulere makrofag fenotype, siden cytokiner og celleoverflatereseptorer som induseres i ko-dyrkede makrofager in vitro er også påvist i human eggstokk-kreft [5]. ADM er i stand til å fremme angiogenese og melanoma vekst [6] både via parakrin virkning, mediert av endotelisk nitrogenoksidsyntase signalveien, og ved den autokrin virkning, som stimulerer polarisasjonen av makrofager mot et alternativt aktivert fenotype (M2).
ADM er en 52-amino-syreløselig peptid som ble renset for første gang fra feokromocytom [7] og antas å være i hovedsak produsert av binyremargen. Men i dag er det velkjent at ADM er nesten allestedsnærværende, med utbredt vev distribusjon som er veiledende av sine mange biologiske aktiviteter [8]. ADM er produsert av både stromal (dvs. endotel, vaskulær glatt muskulatur, myokardial, og sentralnervesystem) og tumorceller som en autokrin /parakrin faktor. Det er også produsert under differensiering av makrofager i respons til pro-inflammatoriske stimuli og hypoksi, og det har i hovedsak anti-inflammatorisk virkning, ettersom ADM hemmer TNF-α produksjon ved hjelp av aktiverte makrofager, reduserer vaskulær permeabilitet, og nedregulerer Th1-mediert autoimmunrespons [ ,,,0],9].
A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, og OVCAR-EPO10-celler ble behandlet med ADM 1, 10 og 100 nM i 72 timer og tellet. Celletall er vist som absolutte antall celler. En beskjeden effekt på cellevekst ble lagt merke til i noen cellelinjer, slik som A2780 (A), TC1 (B), og OVCAR-3 (D) -celler.
Strukturelt ADM er karakterisert ved en typisk 6-amino-syre-ring, på grunn av en disulfidbro mellom cysteinene 16 og 21, og det blir amidert ved C-terminus. Både disulfidbinding og amidering er avgjørende for sin aktivitet. ADM er homolog med calcitonin-gen-relatert peptid (CGRP) og amylin, begge medlemmer av kalsitonin /CGRP /amylin super [10]. Denne homologi gjør det mulig betydelig kryss-reaktivitet med reseptorene på disse andre peptider, så vel som med kalsitonin seg selv. To reseptorene er blitt identifisert for ADM: ADM-R1 og ADM-R2, som begge er dannet av en felles hoved-underenhet og et tilbehør protein. Hoved subenheten er calcitonin reseptor like receptor (CRLR); tilbehøret protein er det reseptoraktivitet-modifiserende protein 2 (RAMP2) i ADM-R1 og RAMP3 i ADM-R2 [11].
Siden eggstokkreft er en sykdom som spres i et miljø rikt på makrofager, noe antas å være hovedkilden til ADM produksjon, i denne studien vi undersøkt rollen til ADM som en vekstfaktor for kreftceller og som en modulerende faktor i makrofager. Selv om in vitro vi merke til dens delvise aktivitet som en faktor som fremmer vekst i kreftceller, i en retrospektiv klinisk studie vi observert at høye nivåer av ADM er knyttet til et positivt resultat, og til en kreft med lav CA125 uttrykk.
cellene ble sultet i 36 timer med eller uten tilsetning av ADM 100 nM, høstes etter 0 (T1), 4 (T2), 8 (T3) og 24 timer (T4), fiksert, farget med propidiumjodid og ervervet ved hjelp av en cens . Data ble analysert som histogram plott. Ved å plotte celletallet sammenlignet med propidiumjodid (PI) fluorescens, ble prosentandelen av celler i hver fase evaluert. Data fra A2780 og OVCAR-3-celler alene er vist som en prosentandel av den totale G1 + G2 + S (A-B). Celledød ble også evaluert ved å analysere DNA-fragmentering som inngår i sub-G
0/1 topp (C-D). Effekten av ADM på cellesyklus og på celledød er ikke påvisbar. Dette eksperimentet ble gjentatt to ganger med samme resultat.
Resultater
ADM er en svak vekstfaktor for eggstokkreft cellelinjer
For å evaluere effekten av ADM på veksten av ovarian cancer cellelinjer, OVCAR-3, OVCAR-EPO10, og A2780 og dens paclitaxel-motstandsdyktig motstykker TC1 og TC3 celler ble behandlet med rekombinant humant ADM ved 1, 10 og 100 nM konsentrasjon i 72 timer. Etter høsting ble cellene tellet. En beskjeden effekt på cellevekst ble lagt merke til i noen cellelinjer, slik som A2780, TC1, og OVCAR-3-celler (fig. 1). Deretter ble effekten på cellesyklusen analysert ved supplementering med eksogen ADM og samtidig serum sult. Celler ble sådd ut i 24-brønners plater og serum-sultet i 36 timer med eller uten tilsetning av ADM 100 nM. Etter 36 timer (T1), 5 × 10
5 celler fra hver tilstand ble høstet og DNA-analyse ble utført. Å måle utvinning av cellene, i de andre brønnene medium ble erstattet med FBS-inneholdende medium. Cellene ble høstet etter 4 (T2), 8 (T3), og 24 timer (T4), og på nytt DNA-analyse ble utført. Prosentandelen av celler i hver fase ble bestemt og representative data er vist for A2780 og OVCAR-3-celler (fig. 2A-B) og for deres resistente motstykker A2780CIS og OVCAR-EPO (Fig. 3 A-B), som er motstandsdyktig mot cisplatin og patupilone, respektivt. En liten økning i S-fasen ble lagt merke til i de prøvene som ble behandlet med ADM. DNA-fragmentering, blant annet i det sub-G
0/1 topp, ble også evaluert som en indikator på celledød (fig. 2 C-D, 3C-D). Effekten av ADM på celledød var ikke påvisbart. Samlet utgjør disse funnene tyder på at ADM har en beskjeden rolle som vekst og overlevelse faktor i eggstokkreft cellelinjer analysert.
Celler ble behandlet som beskrevet i figur 2. Ingen relevante effekter ble lagt merke til i disse to celle linjer i form av modulering av cellesyklus og død forårsaket av ADM. Dette eksperimentet ble gjentatt to ganger med samme resultat.
A2780 og OVCAR-3-celler ble dyrket under hypoksiske betingelser for 72 timer med og uten å legge ADM 100 nM. RNA ekstrahert fra cellepelletene ble analysert ved qPCR. I A2780 celler, som er følsomme overfor hypoksi, ble ADM ADM og reseptorer nedregulert i hypoksiske forhold. I OVCAR-3-celler, som er mindre følsom for hypoksi ble ADM ADM og reseptorer oppreguleres (A). A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, OVCAR og EPO-10 celler ble dyrket som beskrevet ovenfor og telles. Behandling med ADM ikke modulerer ovarian cancer celle vekst i enten normale eller hypoksiske betingelser, med det unntak at i den OVCAR EPO 10 linje var det en 2,4 ganger økning i henhold til vekst hypoksiske betingelser. Foreldre OVCAR-3 celler ble sensibilisert for hypoksi av ADM. Som sammenlignet med normoksiske kontroll, hypoksi redusert antall celler med omtrent 50%. Bar og feilfelt refererer til mener og SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
ADM er en selektiv Survival Factor
Effekten av hypoksi ble undersøkt i A2780 og OVCAR-3 -celler (fig. 4A). I A2780 celler, som er følsomme overfor hypoksi, ble ADM ADM og reseptorer nedregulert i hypoksiske forhold. I OVCAR-3, som er mer motstandsdyktig mot hypoksi, ble ADM ADM og reseptorer oppregulert. A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, OVCAR og EPO-10 ble dyrket i hypoksiske tilstander, med eller uten supplementering med ADM 100 nM (fig. 4B). Blant de analyserte cellelinjer, la vi merke til at bare for OVCAR EPO 10 var det en 2,4 ganger økning i hypoksiske forhold i nærvær av ADM, en annen atferd fra foreldrenes cellelinje OVCAR-3, som ADM syntes å bevisst til hypoksi, siden det ble ikke observert bare halvparten av antallet celler i forhold til antall som finnes i prøven utsettes for hypoksi uten ADM. Ingen relevante endringer ble påvist i de andre modellene.
OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEY (C), og HEY-EPO8 (D) celler ble dyrket i serum sult forhold (uten FBS) i et passende intervall (slik at bare omtrent 50% av cellene til å formere), med eller uten tilsetning av ADM 50 nM, 100 nM og 500 nM. Celletall er vist som det totale antall celler. Bemerkelsesverdig, tilstedeværelse av ADM ikke merkbart påvirke celleveksten. Hvert datapunkt og feiling bar refererer til mener og SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEY (C), og HEY-EPO8 ( D) cellesuspensjoner fra serum sult forsøket ble fortynnet og belagt på petriskåler på 3 forskjellige cellebestander per parabolen. Effekten av ADM på klonogene kapasitet etter 14 dager er vist som antallet kolonier. Bare HEI celler viste noen konsistent virkning av beskyttelse fra serum sult etter ADM behandling i denne analysen, mens deres epotilon-resistente motstykker oppviste den motsatte effekt. Bar og feilfelt referere til å bety og SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
For å studere effekten av ADM-behandlinger i en annen spenning modell, ble cellene sådd ut i 6-brønns plater og serumsultede. En inkubasjonstid ble etablert etter foreløpige analyser (36 timer for HEY og OVCAR EPO10, 48 timer for HEY EPO8, og 60 timer for OVCAR-3). Serum sult betingelser alene, uten ADM, indusert minst 50% av veksthemning. ADM ble lagt på 3 forskjellige konsentrasjoner (50 nm, 100 nm og 500 nm). Data fra de proliferasjonsanalyser i serumsulte betingelser er vist i figur 5A-D. Celler fra hver analyse ble deretter belagt i petriskåler på 3 forskjellige celle seeding tettheter per tallerken (90, 180, og 360 celler ble sådd i hver tallerken for HEY EPO 8, OVCAR-3, og OVCAR EPO10, 150, 300 og 600 celler /skål for HEI), og kolonier ble talt etter 14 dager. Som med hypoksi, serum sult var effektive i å redusere antall celler i kortsiktige 3-dagers vekstmålinger. En beskjeden, ikke statistisk signifikant økning ble notert når ADM ble lagt til lavest konsentrasjon. For å vurdere nærværet av en beskyttende virkning av ADM i den klonogene rommet, etter eksponering til serum sult, ble cellene sådd ut ved begrensende fortynninger, og koloniene tellet etter 10-14 dager (fig. 6A-D). I denne analysen bare i HEI celler en gjennomgående beskyttende effekt av serum sult ble notert med ADM behandling, mens i de andre celletyper ingen endringer ble registrert. Samlet utgjør disse funn viste at bare i visse cellelinjer ble ADM stand til å mediere vekst eller overlevelsesfaktorer.
Type 1 (A) og type 2 (B) makrofager ble behandlet med ADM 1 nM, 10 nM, og 100 nM i 72 timer og tellet. Celletall er vist som det absolutte antall celler. Type 2-celler dyrket i nærvær av ADM nådd et tall opp til 3,8 ganger høyere enn den teller for ubehandlede celler, mens en mindre økning kan observeres i type 1-makrofager (1,3 ganger høyere med ADM 10 nM). Uttrykk av endogen ADM, IL1β, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNγR, CCL22, TGFfi, IL10 og IL13Rα ble evaluert ved qPCR (C) etter behandling av type 1 og type 2 makrofager med rhADM 100 nM i 24 timer. I begge typer celler, blir endogent ADM, IL-12 og TNF-α oppregulert. IL1β og IL8 ble nedregulert mens CCL22 er oppregulert i type 2 makrofager versus type 1. Ingen andre relevante forskjeller i uttrykket av de andre cytokiner, kjemokiner og reseptorer ble lagt merke til. Bar og feilfelt refererer til mener og SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
Kaplan-Meier analyse av 220 eggstokkreft pasienter (A) viste at høyt uttrykk nivåer av ADM var knyttet til en positiv utfallet i form av OS, selv om forskjellen ikke oppnå statistisk signifikans (
p
= 0,07). Den samme analysen, med en endelig sluttpunkt av PFS, viste samme trend (B), dvs. pasienter med lavere uttrykk for ADM tilbakefall tidligere enn de med høyere nivåer (
p
= 0,01). Multivariat analyse viste at alder, klinisk stadium, histotype, og gradering ble ikke signifikant relatert til ADM uttrykk, mens det var en sterk signifikant invers assosiasjon (
p
0,001) mellom nivåer av CA125 og ADM uttrykk (C ). Også nivåene av PLK1 genet, som er relatert til antall celler i M fase, ble betydelig redusert i gruppen med lav ADM uttrykk (D).
ADM Påvirker Monocyte /Macrophage spredning og differensiering
Fordi makrofager er sentrale i produksjonen av ADM i stroma, type 1 (M1) og type 2 (M2) makrofager ble behandlet med 3 ulike konsentrasjoner av ADM (1 nm, 10 nm, og 100 nM ) i 72 timer. Cellene ble høstet ved trypsinisering og tellet. M2 dyrket i nærvær av ADM nådd en telling opp til 3,8 ganger høyere enn den teller for ubehandlede celler, mens en lavere økning ble observert i M1 (1.3 med ADM 10 nM), som indikerer at en eller annen måte ADM var i stand til å modulere makrofag differensiering og spredning (fig. 7A). Som bekreftelse av kapasiteten av ADM til å modulere makrofag differensiering, ble M1 og M2 behandlet med ADM 100 nM i 24 timer. Genekspresjon av ADM, IL1β, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNR, CCL22, TGFfi, IL10 og IL13R ble vurdert gjennom qPCR. Oppregulering av endogent ADM ble observert i M1 og M2, samt oppregulering av IL-12 og TNF-α (fig. 7B), som indikerer at ADM var i stand til å regulere ekspresjon i makrofager på en autokrin måte. Den eneste forskjellen er nevnt i cytokin /chemokin uttrykk som svar på ADM var nedregulering av IL1β og IL8 og oppregulering av CCL22 i M2 vs. M1.
Høy uttrykk nivåer av ADM var en positiv Prognostic faktor i eggstokkreft pasienter
for å få innsikt i rollen som ADM i eggstokkreft, ble en klinisk kohort av 220 kreftpasienter på eggstokkene analysert retrospektivt ved hjelp av en nanofluidic genetisk analysator og en 48.48 chip. CA125 analyse og pasientprøver ble samlet inn ved første operasjonen, før noen behandling. GAPDH fungerte som husholdningsgenet og resultatene var normalisert for uttrykket nivåer påvist i OVCAR-3 celler. Beskrivelsen av pasientene som deltok i denne studien er oppsummert i Tabell 1. En foreløpig resultat analyse ble utført under anvendelse av Kaplan-Meier-metoden. Høye uttrykk nivåer av ADM synes å være knyttet til bedre overlevelse, selv om forskjellen ikke oppnå statistisk signifikans (
p
= 0,07) (fig. 8A). Den samme analysen, med sin endelige endepunkt progresjonsfri overlevelse (PFS), avslørte den samme trenden (Fig. 8B), og pasientene hadde lavere uttrykk for ADM relapsing tidligere enn de med høyere nivåer (
p
= 0,01 ). For å få innsikt i disse funnene, ansatt vi multivariat analyse for å vurdere de kliniske parametre som ble knyttet til ADM uttrykk. Spearmans korrelasjon ble brukt for å vurdere forholdet mellom ADM, CA125, og alder tatt som kontinuerlige variabler. Ingen signifikant korrelasjon ble oppdaget mellom ADM og alder (
ρ
= -0,008,
p
= 0,91) og ca125 og alder
(ρ
= -0,139,
p
= 0,17), mens en signifikant invers korrelasjon ble funnet mellom CA125 og ADM (
ρ
= -0,23,
p
= 0,003). ADM verdier ble også analysert ved histologisk type og stadium av sykdommen ved hjelp av Kruskal-Wallis test. ADM uttrykk endret seg ikke sammenlignet mellom histotypes (χ
2 = 5,14,
p
= 0,39) eller klinisk stadium (χ
2 = 3,94,
p
= 0,14) . Når pasientene ble stratifisert i høye og lave nivåer, var det igjen en signifikant invers assosiasjon (χ
2 = 10,7,
p
0,01) mellom nivåer av CA125 og ADM uttrykk (Fig. 8C) . Disse dataene tyder på at tumorer med lavere ekspresjon av ADM har en større masse enn de med høyere ADM uttrykk. I tråd med denne hypotesen, nivåene av PLK1-en faktor knyttet til antall celler i M fase ble også betydelig redusert (χ
2 = 4,6,
p
= 0,03) i gruppen med lav ADM uttrykket (fig. 8D). Disse funnene tyder på at høy uttrykk for ADM utøver vekst-undertrykkende effekt på eggstokkreft celler og er knyttet til positivt utfall. For å vurdere denne hypotesen, Cox univariat analyse, som tok hensyn til klinisk stadium, histotype, alder, CA125, ADM, og PLK1 (sistnevnte 4 parametrene ble tatt som kontinuerlige variabler) ble utført ved hjelp av både OS og PFS som variabler for utfallet (tabell 2). Variabler som er i stand til å forutsi utfallet i univariate analyse ble valgt for å utføre Cox multivariat analyse. Som tidligere rapportert [12], klinisk stadium var den viktigste variabel for å forutsi risikoen for død i ovarian kreftpasienter. Dette faktum var tydelig i både OS og PFS univariat og multivariat analyse. Den histotype endometrioid var karakteristisk for de pasientene med et bedre OS og PFS i univariat analyse, en effekt opprettholdes i multivariat analyse for OS. Høye uttrykk nivåer av ADM var knyttet til bedre OS og PFS. Denne effekten, selv om beskjeden i form av risiko, ble opprettholdt i både univariat og multivariat analyse, støtter hypotesen om at høy uttrykk nivåer av ADM er prediktive for positivt utfall i eggstokkene kreftpasienter.
Diskusjoner
Sterk prekliniske og translasjonsforskning studier støtter hypotesen om at stromal komponenter spille en sentral rolle i å drive en aggressiv svulst fenotype. I denne sammenheng er ADM et allestedsnærværende regulerende peptid med en rekke biologiske funksjoner, slik som vaskulær handling, vekststimulerende effekter, og immun-modulerende aktivitet. ADM er sterkt uttrykt i en rekke forskjellige maligniteter, for eksempel glioblastom [13], klar-celle nyrekarsinom [14] og kreft i bukspyttkjertelen [15]. I alle disse sykdommene ADM har vært betraktet som en biomarkør for dårlig resultat. Denne karakteristikken av ADM er blitt tilskrives hovedsakelig dets mitogene egenskaper, og til dens evne til å fungere som en overlevelsesfaktor indusert ved hypoksi. Sammen med sine direkte effekter på kreftcellenes overlevelse, en ekstra faktor i tumor aggressivitet består i egenskap av ADM å stimulere angiogenese inne i svulsten. Denne mekanisme virker særlig relevant i klar-celle nyrekarsinom, en sykdom karakterisert ved intensivert vaskularisering inne i svulsten [16]. Noen rapporter er tilgjengelige på om dette fenomenet forekommer i eggstokkreft og om den nøyaktige funksjon av ADM i denne sykdommen. I en liten klinisk setting av 60 kreftpasienter på eggstokkene, ved hjelp nonquantitative PCR-analyse i 2000 rapporterte Hata og kolleger at ADM var en faktor prediktiv dårligere prognose [17]. Bortsett fra denne rapporten, ingen andre translasjonsforskning studier adressert rollen ADM i eggstokkreft. Effektene av ADM på eggstokkreft celler i in vitro kulturer er kontroversielt. Giacalone og kolleger rapporterte at ADM var ikke i stand til å stimulere cellevekst i BG-1, PEO4, og PEO14 eggstokkreft celler [18]. Motsatt, en fersk studie rapporterte at stanse av ADM-genet i HO8910 eggstokkreft celler ble ledsaget av veksthemming og chemosensitization gjennom nedregulering av ERK og BCL-2 uttrykk [19]. Disse funnene bedt oss om å undersøke om ADM er en mitogen overlevelse faktor i et panel av kreftceller som utviser ulike grader av legemiddelresistens. In vitro-analysen viste at ADM viste minimal aktivitet som en vekstfaktor, en effekt som varierte i henhold til cellelinje, med en moderat økning i celler i S-fasen av cellesyklusen. Aktiviteten av ADM som en overlevelsesfaktor ble kraftig differensiert i henhold til cellelinjen. I Hei-celler, etter serum sult var det en kontinuerlig økning i antall celler som er i stand til å overleve og danne kolonier, mens i andre cellemodeller slik virkning var knapt synlig. Ekstrem variasjon ble også observert i form av respons på hypoksi. I denne reaksjon er angitt vi en reduksjon i ekspresjonen av ADM og dets reseptorer i celler som er følsomme for hypoksi, slik som A2780, mens i OVCAR-3 de motsatte tendenser ble observert. Ved å kombinere resultatene rapportert i litteraturen og egne funn vi konkluderte med at ADM utøver en beskjeden effekt som en vekst og overlevelsesfaktor i eggstokkreft celler, med ekstrem variasjon avhengig av den cellemodell analysert.
En fersk rapport på melanom antydet at den største kilden til ADM er makrofager [6]. For å bekrefte en slik hypotese, har vi sett på muligheten for ADM å stimulere veksten av polarisert M1 og M2 makrofager. ADM var i stand til å regulere produksjonen på en autokrin måte og selektivt forbedret spredning av M2, som har en lav IL-12 /høy IL-10 fenotype, og som oppviste svekket ekspresjon av reaktive nitrogenmellomprodukter, lavere antigen presentasjon og tumorici-dal kapasitet, og høy ekspresjon av angiogene faktorer, slik som VEGF, EGF, og semaphorin 4D [20]. Høy ekspresjon av M2 er derfor vanligvis assosiert med en immun miljø som gjengir kreft mer aggressiv.
Til tross for disse in vitro-funnene, vår translasjonell studien viste overraskende at pasienter med høyere ekspresjon av ADM-genet hadde en tendens til å ha lengre PFS og et bedre resultat. Vi har lagt merke til, spesielt, en invers korrelasjon mellom ekspresjonsnivåer av ADM og CA125 målt ved tidspunktet for første operasjonen. Det er allment akseptert at CA125 er en markør for tumorvolumet. I eggstokkreft som reagerer på behandling, er en reduksjon i ekspresjonen av CA125 bemerkelsesverdig. Tumorer er karakterisert ved lave nivåer av ADM oppviser også høyere ekspresjon av PLK1, en markør mitotisk aktivitet. Derfor er det sannsynlig at i pasienter, ADM utøver, direkte eller indirekte, en vekstundertrykkende effekt, med en reduksjon av celler i M-fasen av cellesyklusen antydet ved ekspresjon av PLK1. I et stort antall studier, er den viktigste effekten sett for in vivo-ADM-stimulerte celler var en økning i cAMP (oversikt i [8]). Midler som øker cAMP i kreftceller har ofte vært forbundet med hemning av celleproliferasjon [21], og flere legemidler i stand til å etterligne cAMP er i klinisk utvikling som antikreftmidler [22]. Sammen med en direkte effekt på cancerceller via cAMP, er det også mulig at pasienter med høyere nivåer av ADM oppviser tumorer med bedre vaskularisering, som demonstrert i klar-celle nyrekarsinom [16]. Siden eggstokkreft er et kjemosensitiv sykdom hos de fleste pasienter [12] vi kan spekulere at vevet konsentrasjonen av kjemoterapeutiske øker når nivået av ADM er forhøyet, noe som fører til bedre kontroll av sykdommen, og en lengre sykdomsfritt intervall.
i sammendrag, denne studien viste at selv om ADM kan oppføre seg som en vekst /overlevelsesfaktor in vitro, og som et middel med evne til selektivt å stimulere M2 polarisasjon, er disse egenskaper ble ikke bekreftet hos pasienter. Derfor denne studien støtter ikke bruk av ADM-antagonister som et verktøy for å bedre forvaltningen av eggstokkreft kreftpasienter.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
A2780 og OVCAR-3 cellelinjer ble erholdt fra ATCC. A2780 er en human ovarian cancer cellelinje avledet fra tumorvev hos en ubehandlet pasient. A2780 TC1 og A2780 TC3 er Paclitaxel-resistente cellelinjer hentet fra A2780 etter langvarig behandling med ciklosporin og Paclitaxel (vennlig levert av Indena). OVCAR EPO10 og HEY EPO8 er epotilon B (EpoB) -resistente cellelinjer hentet fra OVCAR-3 og HEY henholdsvis etter langvarig behandling med EpoB. Alle disse cellelinjene er blitt beskrevet tidligere [23]. Cellelinjer ble dyrket under standard betingelser (37 ° C, 5% CO
2) i RPMI 1640 med glutamin supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM MEM ikke-essensielle aminosyrer og 0,1 mg /ml kanamycin. Alle reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich dersom andre leverandører ikke ble spesifisert. Eksperimenter i hypoksi ble utført som tidligere beskrevet [24].
Fremstilling av makrofager Primære kulturer
Lymphomonocytes ble isolert fra buffy coat fra en frisk donor ved tetthetssentrifugering ved hjelp av gradient Histopaque-1077 (Sigma -Aldrich) og resuspendert i RPMI 1640 supplementert med 10% humant AB serum (Sigma-Aldrich), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (GIBCO). Omtrent 10
7 lymphomonocytes pr brønn ble sådd ut i 6-brønns primære dyrkningsplater (BD Falcon) og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 2 timer for å tillate monocytter (10% til 30%) for å følge til bunnen av brønnene. Ferskt kulturmedium inneholdende enten 50 ng /ml rekombinant, human GM-CSF eller 50 ng /ml rekombinant humant M-CSF (R OVCAR-3 og HEY EPO8: 10
5 /brønn). Rekombinant human ADM ble tilsatt til mediet etter adhesjon av celler til bunnen av brønnene. Etter 72 timer ble flytende celler i supernatanten høstet. Adherente celler ble behandlet med trypsin-EDTA og oppsamlet, sammen med deres tilsvarende supernatanter. Totale celletall ble utført ved hjelp av en hemocytometer (Burker kammer, Nalgene). Hypoksiske forhold ble utført ved å inkubere cellene i en Billrop kammer.
I noen eksperimenter, hei, hei EPO8, OVCAR, og OVCAR EPO10 cellene ble dyrket under sult forhold (uten FBS) for forhåndsbestemte tidspunkter, med eller uten å legge ADM. Den positive kontrollen er dannet av celler dyrket i komplett medium.
type 1 og type 2 makrofager ble behandlet med rhADM i 72 timer, deretter høstet etter behandling med trypsin-EDTA og tellet i et Burker kammer.
klonogene Analyser
Etter å telle OVCAR-3, OVCAR EPO10, HEY, og HEY EPO8 celler fra serum sult eksperimenter, hver cellesuspensjon ble fortynnet i FBS holdig medium til svært lave celletettheter. For OVCAR-3, OVCAR EPO10, og HEI EPO8, ble hver oppløsning fortynnet til 36, 18 og 9 celler /ml, ble deretter 10-ml porsjoner av hver cellesuspensjon plassert i Petri-skåler, slik at brønnene ble fylt med 360, 180
