Abstract
Nylig har vi vist at trichosanthin (TCS), en lovende middel for behandling av cervikal adenokarsinom, hemmet HeLa celleproliferasjon gjennom PKC /MAPK /CREB signalveien. Videre TCS nedregulert BCL-2 uttrykk ble opphevet ved en lokkedue oligonukleotid (OGN) til syklisk AMP-responsive element (CRE). Den lokkefugl OGN blokkert bindingen av CRE-bindende protein (CREB) til BCL-2. Disse resultatene antydet at CRE-formidlet gen-ekspresjon kan spille en sentral rolle i HeLa celleformering. Men lite er kjent om effekten av TCS på cellesyklus arrestasjoner, spesielt om involvert i cellesyklus gener ble regulert av CRE. Vår nåværende studie viser at arrestasjonene av S, G1 og G2 /M faser ble ledsaget av betydelig nedregulering av cyclin A, D1 og CDK 2, 4 i HeLa-celler, cyclin D1, E og CDK 2, 4 i Caski og C33a celler og cyclin A, B1, E og CDK 2 i SW1990 celler. Imidlertid cellesyklus arrestert ble reversert med en betydelig oppregulering av cyklin A og D1, ved den kombinerte behandling av TCS og CRE. Som konklusjon Disse data demonstrerer for første gang at spesifikke cellesyklus arrestert i kreftceller kan bli indusert av TCS ved å inhibere bindingen av CREB til CRE på gener relatert til cellevekst
relasjon:. Wang P, Huang S, Wang F, Ren Y, Hehir M, Wang X, et al. (2013) Syklisk AMP-Response Element regulert cellesyklus Arrestasjoner i kreftceller. PLoS ONE 8 (6): e65661. doi: 10,1371 /journal.pone.0065661
Redaktør: Hong Wanjin, Institutt for molekylær og cellebiologi, Biopolis, USA
mottatt: 18 november 2012; Akseptert: 25. april 2013, Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddene fra Natural Science Foundation National of China (81071653), Science Foundation Natural i Zhejiang-provinsen (Y2111136), Advanced Key vitenskapelige og teknologiske programmer av Ningbo (2011C51005), Science Foundation Natural av Ningbo City (2011A610050) og KC Wong Magna Fund i Ningbo University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Trichosanthin (TCS), en aktiv komponent isolert fra roten knoller kinesisk medisinsk urt
Trichosanthes kirilowii product: [1], er en lovende middel for behandling av kreft [2]. Våre tidligere rapporter viste at TCS hemmet livmorhals adenokarsinom HeLa celleproliferasjon [3] gjennom PKC /MAPK /CREB signalveien [4]. Videre TCS nedregulert BCL-2 uttrykk [5], som ble opphevet ved en syklisk AMP-responsive element (CRE, TGACGTCA) decoy oligonukleotid (OGN), blokkerer CRE-bindende protein (CREB) bindingssetet på BCL-2 [6]. Disse resultatene tyder på at CRE-mediert genuttrykk kan spille en sentral rolle i HeLa cellevekst.
Men lite er kjent om effekten av TCS på cellesyklus arrest av HeLa celle, cervical squamous karsinom (Caski og C33a celle), og human bukspyttkjertelkreft (SW1990 celle), spesielt, om gener relatert til cellesyklus ble regulert av CRE lokkedue OGN.
i denne studien har vi ytterligere utforsket effekten av TCS på spredning av kreftceller, cellesyklus arrestasjoner i fremdriften av celleproliferasjon og rollen til CRE i cellesyklusregulering.
Formålet med denne studien var å undersøke effekten av TCS på kreftcelle spredning og effekt av CRE på TCS-indusert cellesyklus arrestasjoner. Et viktig spørsmål var om CRE-kombinert cykliner spilte en avgjørende rolle i regulering av cellesyklus arrest i disse kreftcellene.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
livmorhalsen (HeLa, Caski, C33a) og SW1990 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). HeLa, Caski, C33a [7] og SW1990 celle [8] ble dyrket i monolag i RPMI 1640-medium (Gibco, NY, USA) og Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD, USA), i en CO
2 inkubator (Forma Scientific, USA). Mediet ble byttet ut to ganger i uken, og cellene ble passert hver 4-5 dager i forholdet 1:03.
Cell behandling
Celler ble sådd ut i 2 x 10
6 celler /skål på 100 mm skåler i basalmedium. Ved samløpet, ble de vasket kort med PBS og deretter behandlet med TCS (Jinshan apotek selskap, Shanghai, Kina). Kontroll celler ble inkubert i TCS fritt medium.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble vurdert med Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ved hjelp av metodene beskrevet tidligere [3 ], [4], [9].
Behandling av celler med CRE-OGNs
CRE decoy OGN (5′-TGACGTCAGAGAGCGCTCTCTGACGTCA-3 «) og kontroll OGN (5’TGACGTCATGACGTCATGACGTCA- 3 «) ble konvertert til phosphorothioate OGNs (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) som tidligere beskrevet [5], [6], [10].
Utarbeidelse av cytosoliske og nukleære proteiner
preparater av cytosoliske og nukleære proteiner ble utført som tidligere beskrevet [6], [11], [12]. I korthet, ved slutten av hvert utpekt behandling, ble cellene vasket en kort stund med kald PBS og lysert ved skraping dem i 0,5 ml kald hypotonisk buffer (10 mM HEPES, 40 mM KCI, 3 mM MgCl
2, 1 mM ditiotreitol, 0,2 % NP-40, 1 ug /ml aprotinin, 2 mM leupeptin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 40 mM p-nitrofenylfosfat, 1 mM natriumortovanadat og 50% glycerol). Lysatene ble samlet opp og inkubert på is i 5 min, deretter sentrifugert ved 15 000 x g i 20 sek. Supernatanten ble oppsamlet og lagret som de cytosoliske fraksjoner. Pelleten (dvs. cellekjerner) ble resuspendert i hypertonisk buffer (20 mM HEPES, 420 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 0.2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitol, 0,2% NP-40, 1 ug /ml aprotinin, 2 uM leupeptin, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 40 mM p-nitrofenylfosfat, 1 mM natriumortovanadat og 25% glycerol). Etter inkubering på is i 60 minutter, ble prøvene sentrifugert ved 15.000 x g i 20 minutter og supernatantene ble samlet opp og lagret som nukleære ekstrakter. De cytosoliske fraksjoner og nukleære ekstrakter ble kokt i 10 minutter og oppløst i 8% SDS-PAGE.
cellesyklusanalyse
For flowcytometri analyse av cellesyklusen, 1 x 10
6 celler ble høstet ved sentrifugering, vasket med PBS og fiksert med iskald 70% etanol over natten. Fikserte celler ble behandlet med 25 pg /ml RNase A ved 37 ° C i 30 minutter og deretter farget med propidiumjodid (PI) (50 ug /ml, Sigma) løsning i 30 minutter i mørket. Fluorescensintensiteten av enkeltceller ble målt ved hjelp av et strømningscytometer (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA). Minst 10.000 celler ble tellet [13].
Western blot-analyse
Totale cellelysater ble fremstilt ved lysis av cellene med radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av proteinanalysesett (Bio -Rad). For Western blot-analyse, ble 50 ug av hver prøve behandlet som beskrevet [14]. De følgende antistoffer ble anvendt: anti-cyklin A, B1, D1, E, anti-CDK2, 4 og anti-actin (Cell signale Thehnology, Inc., Beverly, MA). De sekundære antistoff ble koblet til pepperrotperoksidase og detektert av kjemiluminescens (Bio-Rad, Hercules, CA). De relative mengder immunoreactive protein i hvert bånd ble bestemt ved å skanne densitometrisk analyse av X-ray filmer.
Statistisk analyse
Alle forsøk ble gjentatt tre ganger. Dataene ble uttrykt som middel ± SD. ANOVA ble brukt til å evaluere forskjellene mellom gruppene. Data rapportert som middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Forskjeller ble betraktet som signifikant hvis
p
. 0,05
Resultater
Effekter av TCS på spredning av kreft celler
TCS av 20-100 mikrogram /ml inhiberte proliferasjonen av celler med 3% til 70% etter behandling i 24 timer (fig. 1). Den 50% inhiberende konsentrasjon (IC
50) av TCS på Caski og C33a-celler ble funnet å være 60 pg /ml, mindre enn det på HeLa og SW1990-celler (100 ug /ml) (Tabell 1).
TCS hemmet celleproliferasjon i en doseavhengig måte. Data representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (*
p
0,05 sammenlignet med kontroll).
Effekter av TCS på cellesyklus fremgang og cellesyklusregulerende proteiner
TCS-behandlede kreftceller ble analysert ved flowcytometri. En dose-avhengig celle-tallet øker fra S, G1, G2 /M fase ble vist i HeLa, Caski, og SW1990 celler henholdsvis, etter at de ble behandlet i 24 timer, (tabell 2). Nivåene av cellesyklusrelaterte proteiner ble bestemt ved Western blot-analyse. TCS redusert overflod av cyklin A, D1 og CDK 2, 4, mens den ikke hadde noen merkbar effekt på ekspresjonen av cyclin B1 og E i HeLa celle (Fig. 2). I Caski celle, cyklin D1, E og CDK 2, ble 4 betydelig redusert, mens det ikke markerte endringer ble vist i uttrykket av cyklin A og B1 (fig. 3). Lignende resultater ble funnet i C33a-celler (data ikke vist). I SW1990 celle, cyclin A, B1, E og CDK 2 var signifikant nedregulert, ingen tydelige effekter ble observert i uttrykket av cyclin D1 og CDK4 (Fig. 4).
HeLa-celler ble behandlet med angitt doser av TCS i 24 timer. Celle antall S-fasen økt betraktelig (A) og uttrykk for cyklin A, D1 og CDK2, 4 signifikant redusert (B). Data representerer middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (*
p
0,05 sammenlignet med kontroll)
Caski-celler ble behandlet med angitte doser av TCS i 24 timer.. Celle tall på G1 fase økt betraktelig (A) og uttrykk for cyklin D1, E og CDK2, 4 signifikant redusert (B). Data representerer middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (*
p
0,05 sammenlignet med kontroll).
SW1990-celler ble behandlet med angitte doser av TCS i 24 timer. Celle tall på G2 /M fase økt betraktelig (A), uttrykk for cyklin A, B1, E og CDK2 betydelig redusert (B). Data representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (*
p
0,05 sammenlignet med kontroll).
Effekter av CRE-lokkefugl på cellesyklusen fremgang og forskrifter proteiner
arrestasjoner av S, G1 og G2 /M faser indusert av TCS i HeLa (fig. 5), Caski (fig. 6) og SW1990 (fig. 7) celler, ble betydelig svekket av den kombinerte behandling av TCS og CRE (A, B). Det ble funnet at de TCS-induserte reduksjon av cyklin A og D1 ble markert reversert ved tilsetning av CRE, i HeLa-celler (fig. 5, C, D), Caski celler (Fig. 6 C, D) og SW1990 celler ( fig. 7 C, D).
TCS-induserte økningen av celleantallet i S-fasen ble betydelig svekket ved den kombinerte behandling av TCS + CRE (A, B). Den nedregulert uttrykk for cyclin A og D1 ble reversert av TCS + CRE. Ingen effekt ble observert på andre proteiner (C, D). Data representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (*
p
0,05 sammenlignet med kontroll,
#
p
0,05 sammenlignet med TCS).
TCS-induserte økning i celle tall i G1 fase ble betydelig svekket av TCS + CRE (A, B). Ned-regulert ekspresjon av cyclin D1 ble reversert ved behandling av TCS + CRE. Ingen effekt ble observert på andre proteiner (C, D). Data representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (*
p
0,05 sammenlignet med kontroll,
#
p
0,05 sammenlignet med TCS).
TCS-indusert økning av celletallet i G2 /M fasen ble signifikant svekket ved behandling av TCS + CRE (A, B). Nedregulert ekspresjon av cyklin A ble reversert ved behandling av TCS + CRE. Det var ingen effekt på andre proteiner (C, D). Data representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (*
p
0,05 sammenlignet med kontroll,
#
p
0,05 sammenlignet med TCS).
diskusjon
Denne studien viste, for første gang, at TCS som utøves cytotoksiske effekter på kreftcellelevedyktighet på en doseavhengig måte (fig. 1). Caski og C33a-celler var følsomme for dens hemmende virkning på celleformering (tabell 1). Resultatene av det anticancer mekanismer viser klart at økningen av S-fase i HeLa-celler i følge reduksjonen av G
en faseceller, mens antall G
2-faseceller ble ikke endret. I Caski og C33a celler, betydelig økning av G
1 fase og reduksjon av S og G
2 fase celler ble observert. I SW1990 celler, en økning på G
2 /M-faseceller var ledsaget av en reduksjon av G
en faseceller, uten å endre seg i samme antall S-fase-celler (tabell 2).
å undersøke endringene i flere regulatoriske molekyler som er involvert i cellesyklusen viste at uttrykket av cyklin A, D1 og CDK 2, 4 i HeLa-celler (fig. 2), cyklin D1, E og CDK 2, 4 i Caski og C33a -celler (fig. 3), cyklin A, B1, E og CDK 2 i SW1990-celler (fig. 4) var signifikant nedregulert. Blokkerer bindingssetet av cellesyklus gener til CREB av OGN, en grobunn lokkefugl, hindret TCS-arrestert S, G1 og G2 /M cellesykluser i HeLa (Fig. 5 A, B), Caski (Fig. 6 A, B ) og SW1990 (fig. 7 A, B) -celler, respektivt. TCS-mediert nedregulering av cyklin A, D1 i HeLa-celler (Fig. 5 C, D), cyklin D1 i Caski celler (Fig. 6 C, D) og cyklin A i SW1990 celler (Fig. 7 C, D) ble reversert ved kombinasjonen av CRE og TCS.
Disse resultatene bekreftet og utvidet våre tidligere rapporter som viser at TCS har en cytotoksisk virkning på kreftceller [3], [4], og delvis avdekket de mekanismer som ligger til grunn for aktivering av CREB protein [5], [6]. Men det har ikke tidligere blitt rapportert om TCS-mediert cellesyklus arrest skjer gjennom en kombinasjon av CRE og målgener. Denne studien viser at CRE lokkedue OGN dempet nedgangen av de uttrykk for cyclin A og D1 følge av TCS behandling, og reversert cellesyklus arrestasjoner.
cellesyklus er tett formidlet gjennom et komplekst nettverk av positive og negativ cellesyklusregulerende molekyler som CDK, CKIs og cykliner [15], [16]. Det har blitt rapportert at dannelsen av aktive cyklin D /CDK4 og Cyclin E /CDK2 komplekser regulerer progresjon gjennom G1 fase (G1 /S overgang). Videre cyclin A binder seg til og aktiverer CDK2, fremme G1 /S og G2 /M cellesyklus overganger. I slutten av G2, cyclin B /CDK2 er aktivert, slik inntreden i mitose [17]. I denne studien fant vi at redusert uttrykk for cyclin A, D1 og CDK2, fire var assosiert S-fasen arrest i HeLa-celler (fig. 2). Den reduserte uttrykkene for cyclin D, E og CDK2, fire var knyttet til G1 fase i Caski og C33a celler (Fig. 3). Uttrykkene av cyklin A, B1 og CDK2 var signifikant nedregulert i celler SW1990, arrestert i G2 /M fase (Fig. 4). Vi fant også at CDK2 ble signifikant redusert i cellelinjer. Dette resultatet er i tråd med den oppfatningen at CDK2 har en tydelig og viktig funksjon i pattedyrcellesyklus, og dens mutasjon eller hemming fører en G1-fase blokk [18].
aktivering av gener som bærer CRE er rapportert å skje ved å fosforylere Ser CREB ved 133 og binding til CRE konsensussekvenser i promoterregionen av gener [19], [20]. CREB fosforylering topper i løpet av G1-S-overgang, og deretter gradvis avtar fra S-fasen til M fase [21]. Kombinert med våre tidligere rapporterte resultater [4] – [6], [9], er det logisk å hypoteser om at celleproliferasjonsprosesser gener, bærer CRE område, binder seg til CREB og påvirke dets fosforylering nivå, for derved å påvirke celledeling
CRE lokalisert oppstrøms av mRNA-startsetene. Den har en nøkkelrolle i den cyklin A [22], [23] og D1 [24], [25] uttrykk via CREB-aktivering [26] – [28]. En tidligere studie viste at foreningen av CREB med vaccinia relaterte kinase 1 (VRK1) oppstod i en celle-syklus-avhengig måte fra slutten av G1 til S-fasen. Videre VRK1 forbedret spesielt aktiviteten til CRE i cyclin D1 promoter ved å lette rekrutteringen av fosforylert CREB til dette locus [29]. Giampuzzi et al fant også at en betydelig reduksjon av CREB proteinbinding til cyclin D1 arrangøren førte til en dramatisk hemming av cyclin D1 protein uttrykk i lysyl oxidase (LOX) -up-regulerte celler [30]. Dette fenomenet ble også bekreftet i fibroblast-celler [31], endometrial celle [32], INS celle [33], hepatocytt-celle [34] og andre cellelinjer [21], [35], [36]. I tillegg er en rekke observasjoner antydet cyklin A spiller en sentral rolle på S- og G2 /M overgang i pattedyrceller, og denne rolle er forenlig med sin primære tilknytning til CDK2, istedenfor CDC2, i S-fasen [37], [38] . CRE ble bekreftet å være nødvendig for effektiv aktivering av cyklin A-promoteren i glatte muskelceller fra aorta [39], fibroblast-celler [40] og humane embryonale karsinom-celler [22]. Denne studien viser tydelig at kombinert behandling av TCS og CRE svekket den avtar av cyclin A og D1 uttrykk, og dermed reversere effekten av TCS på cellesyklus arrest. Derfor foreslår vi at transkripsjonsfaktor CREB er en av de oppstrøms regulatorer av TCS-indusert cellesyklus arrest i kreftceller.
Konklusjon
Våre funn viser, for første gang, at TCS induserer spesifikke cellesyklus arrestert i kreftceller ved å hemme bindingen av CREB til CRE på gener relatert til celleproliferasjon.
