Abstract
Bakgrunn
ezrin er medlem av ezrin, radixin, og moesin familie som gir en funksjonell koblingen mellom plasmamembranen og kortikale aktin cytoskjelettet. En korrelasjon mellom ezrin overekspresjon og aggressiv cancer oppførsel er nylig blitt rapportert i forskjellige tumortyper. Men dens roller i mekanismene bak utviklingen av tungen plateepitelkarsinom (SCC) er uklart.
Metode
Vi brukte menneskelige tunge SCC og microarrays noncancerous vev til immunohistochemically analysere ezrin uttrykk nivå og sitt forhold til proliferativ aktivitet. Den humane tunge SCC cellelinje HSC-3 ble anvendt for å bestemme effektene av ezrin RNA interferens (RNAi) på kreftceller i løpet av MTT; sårheling og invasjon analyser; immunfluorescens av aktin cytoskjelettet; og western blotting av E-cadherin, N-cadherin, β-catenin, og aktiv og total RhoA /Rac1 /cdc42.
Resultater
ezrin ble overuttrykt i 46,4% av svulstene undersøkt i menneskelige tungen SCC microarray. Ezrin uttrykk ble korrelert med Ki-67 indeksen. Ezrin uttømming av RNAi i HSC-3 celler betydelig redusert celleproliferasjon, migrering og invasivitet og forstyrret aktin reorganisering under podia formasjon. Dens virkning på RhoA /Rac1 /cdc42 uttrykk var ikke signifikant, mens den forbedrede E-cadherin og β-catenin uttrykk og redusert N-cadherin uttrykk.
Konklusjoner
ezrin er ofte overuttrykt i primær tungen SCCS og kan ha en viktig rolle i deres vekst, migrering og invasivitet eventuelt via dens forbindelse med E-cadherin /β-catenin komplekset og cadherin bryteren. Således ezrin kan være et terapeutisk mål på tungen SCC
relasjon:. Saito S, Yamamoto H, Mukaisho K-i, Sato S, Higo T, Hattori T, et al. (2013) mekanismene bak Cancer Progresjon forårsaket av ezrin Overuttrykte i Tongue Plateepitelkarsinom. PLoS ONE 8 (1): e54881. doi: 10,1371 /journal.pone.0054881
Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 06.09.2012; Akseptert: 17. desember 2012; Publisert: 24 januar 2013
Copyright: © 2013 Saito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er i dag den syvende vanligste kreftformen, med 260.000 nye tilfeller diagnostisert hvert år og ca 128.000 årlige dødsfall på verdensbasis [1], [2]. Tungen er en av de vanligste områdene av opprinnelse for HNSCC i Japan [3]. Neck lymfeknutemetastase er en av de mest kritiske faktorer som bestemmer overlevelse og gir en god guide for behandlingsstrategier [4] – [8]. Men kvaliteten på livet og fem-års overlevelse er lave i avanserte tungesvulster selv med dagens multimodal behandling og kirurgisk fjerning ledsaget av kjemoterapi og strålebehandling. For å forbedre resultatene av avanserte tungen kreft, må vi utvikle nye og mer målrettede behandlingsformer basert på en forståelse av de molekylære mekanismene bak den aggressive oppførselen til tungekreft.
ezrin ble opprinnelig isolert som en cytoskeletal del av intestinal microvilli, og det er kjent for å være et substrat av tyrosin kinase [9]. Ezrin er medlem av ezrin, radixin, og moesin protein familie som knytter F-aktin til celle membran proteiner etter fosforylering [10] – [13]. Denne linker funksjon tyder på at ezrin er viktig for mange grunnleggende cellulære prosesser, herunder bestemmelse av celleformen, polaritet, overflatestruktur, celleadhesjon, motilitet, cytokinese, fagocytose, og integrering av membrantransport gjennom signalveier [14] – [17] . Disse funksjonelle aspektene av ezrin er ventet å fremme tumorprogresjon. Faktisk har nylige studier vist at ezrin kan ha en viktig rolle i tumorgenese, utvikling, invasjon og metastase, sannsynligvis ved regulering av adhesjonsmolekyler, deltakelse i cellesignaloverføring, og signalering til andre cellemembrankanaler i tumoren [18] – [22]. Ezrin er en uunnværlig faktor for tumorcellemetastase i osteosarkomer [23], brystkreft [24], nasofaryngeale karsinomer [25], og prostatisk kreft [26]. Ezrin uttrykk har også vært knyttet til dårlig overlevelse i flere kreftformer, inkludert karsinomer i bryst [21], [27], endometrium [28], og eggstokk [29]; kutane og Uveal melanomer [30]; og bløtvevssarkomer [31], [32]. Men dens roller i munnhulekreft er uklart. Denne studien forsøkte å klargjøre rollene til ezrin i tunge SCC progresjon med ezrin RNA interferens (RNAi) i en cellelinje avledet fra tunge SCC. Vi brukte primærtunge SCCS for å bestemme frekvensen av ezrin overekspresjon og korrelasjonen av ezrin uttrykket med Ki-67-indeksen og den apoptotiske indeksen, som reflekterer bidrag av celleproliferasjon og celle-tap, respektivt, til tumorvekst og aggressivitet. Våre resultater tyder på at ezrin kan være egnet for målrettet genterapi i tunge SCCS.
Materialer og metoder
Immunhistokjemisk farging av ezrin og histologisk undersøkelse
Den normale og tumor tunge vev mikromatriser av mennesker brukt i denne studien ble hentet fra USA Biomaks Company (MD, USA). Av de 79 prøvene, 10 var normale tunge vev og 69 var tunge SCC vev. US Biomaks selskapet fått vev ressurser fra vev banker som garantert at alle menneskelige vev samlingene ble utført ved sertifisert sykehus i henhold til de høyeste etiske standarder. Alle menneskelige vev ble også samlet inn i henhold til protokoller som oppfylte helseforsikring bærbarhet og Accountability Act (HIPPA). De sertifisert at alle vev banker som har gitt menneskelige ressurser vev oppfylt følgende krav i Human materialoverdragelse: donorens identitet ble anonymisert og alle vev og data ble merket ved bruk av et ID-kode for å beskytte identiteten til vev givere. Informert samtykke ble holdt på vev banker og ikke gitt oss Biomaks selskapet, og dermed beskytter giverens privatliv
Immunhistokjemisk farging av de menneskelige tungen SCC microarray ble utført ved hjelp av en anti-ezrin kanin antistoff (# 3145;. Cell signalering, MA, USA) og et monoklonalt muse anti-Ki-67-antistoff (klon: MIB-1; Dako, Glostrup, Danmark). Farging ble utført ved hjelp av en Discovery XT Automated IHC Stainer med en Ventana DABMap Detection Kit (No. 760-124; Ventana Medical System, AZ, USA). Hvert trinn av Ventana DABMap Detection Kit prosedyre var optimalisert på Discovery XT instrument, og forholdene ble innstilt. Antigen henting fra vevsdelene ble utført ved hjelp av varme
Den fargeintensitet av menneskelig tungen SCC vev ble gradert som følger:. 0, negativ; 1+, svak; 2+, moderat; og 3+, intense. Denne gradering brukte følgende kriterier: 1+ indikerte en intensitet lik den som finnes i den normale tunge vev; 3+ indikerte intens farging av membranen og cytoplasma; 2+ indikerte en intensitet mellom 1+ og 3+. Vi dikotomisert kategoriene under statistisk analyse. Dermed vil en svak til moderat fargeintensitet indikerte lav ezrin uttrykk, mens en intens fargeintensitet indikerte høy ekspresjon ezrin.
Ki-67 er vanligvis uttrykt i cellekjernen. Ki-67 indeks (dvs. antallet Ki-67-positive tumorceller dividert med det totale antall tumorcelle x 100%) ble bestemt ved telling av antallet tumorceller i tre tilfeldig valgte kraftige felt (x 400 ).
apoptotiske indeksen ble målt ved hjelp av en In situ apoptose Detection Kit (Takara Bio, Otsu, Japan). De fargingsprosedyrer følges produsentens instruksjoner. Etter rutinemessig deparaffinization ble vevet spaltet med proteinaseK (20 ug /ml i PBS) i 15 minutter ved romtemperatur og vasket med PBS. Objektglass ble deretter inkubert i 3% hydrogenperoksid i 5 min og vasket med PBS. TdT enzym og substrat ble pipettert på seksjonene, som deretter ble inkubert ved 37 ° C i 90 min. Etter vasking ble FITC anti-HRP-konjugat tilsettes til lysbildene i 30 minutter. Platene ble vasket, farget med diaminobenzine (Nichirei, Tokyo, Japan), og kontra med hematoksylin. Den apoptotiske indeks (antall positive tumorceller dividert med det totale antall tumorceller x 100%) ble bestemt ved telling av antallet tumorceller i tre tilfeldig valgte kraftige felt (x 400). Sammenhenger mellom ezrin uttrykk, Ki-67, og den apoptotiske indeksen ble også evaluert i menneskelige tungen SCC vev.
Cell kultur
Tungen SCC cellelinje HSC-3 ble kjøpt fra JCRB Cell Bank og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning (Invitrogen, CA, USA) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære supplert med 5% CO
2.
Små interfering RNA (siRNA)
ezrin siRNA (5′-GAUUUCCUACCUGGCUGAAGCUGGA-3 «) og nonsilencing kontroll (NSC) siRNA ble kjøpt fra Invitrogen . Cellene ble transfektert hjelp Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. De ezrin siRNA-transfekterte HSC-3 celler (ezrin-siRNA) og NSC-transfekterte HSC-3 celler (NSC) ble brukt i alle de
in vitro
eksperimenter.
Kvantitativ revers transkripsjon -polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR)
i QRT-PCR, ble totalt RNA isolert fra cellelinjer ved bruk av RNeasy (Qiagen, Tokyo, Japan) og cDNA ble syntetisert fra 2 ug av det totale RNA. cDNA ble utsatt for PCR (LightCycler480, Roche, Tokyo, Japan) ved hjelp av primere og SYBR Premiks Ex Taq II (Takara Bio). Alle PCR-primere ble innkjøpt fra Takara Bio og deres sekvenser er vist i tabell 1. PCR ble utført ved anvendelse av følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med PCR ved 95 ° C i 5 s, annealing ved 60 ° C i 20 s, og forlengelse ved 72 ° C i 10 sek. MRNA ekspresjonsnivåer ble normalisert mot mRNA-ekspresjonsnivåene av den interne standard-genet glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH).
Western blotting
Sammenflytende celler ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM natriumklorid, 0,5 mM EDTA, 0,09 enheter /ml aprotinin, 1 pg /ml pepstatin, 10 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og 1 ug /ml leupeptin). Protein Lysatene (20 ug per bane) detektert i BCA-proteinanalyse ble separert ved anvendelse av en 4% -12% SDS-PAGE-gradientgel (NuPAGE, Invitrogen) og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Invitrogen). Membranene ble blokkert med 4% fettfri tørrmelk i TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 g /l natriumklorid, og 0,1% Tween 20) før inkubering med primære antistoffer.
Anti- ezrin kanin antistoff (# 3145) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Anti-β-actin mus monoklonalt antistoff (sc-47778) og anti-N-cadherin antistoff fra mus (sc-7939) ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Anti-E-cadherin mus-antistoff (klon 36) og anti-β-catenin mus antistoff (klon 14) ble kjøpt fra Becton Dickinson and Company (BD, NJ, USA). Geit peroksydase-konjugert anti-kanin-IgG (# L3012; Signalway antistoff, TX, USA) og geite-peroksydase-konjugert anti-mus IgG (# AP124P; Millipore, MA, USA) ble anvendt som sekundære antistoffer. β-aktin ble benyttet som intern positiv kontroll. Proteinene ble visualisert ved hjelp av HRP-substrat (Millipore) og skannet med en forbedret chemiluminescence system (Las 4000, Fuji Film, Tokyo, Japan). Bandet intensiteter ble normalisert til p-aktin.
Cellesyklus og apoptose analysen
Cells (1 × 10
5) ble sådd på 75-cm
2 kolber og transfektert med ezrin eller negativ kontroll siRNA. Cellene ble høstet tre dager etter transfeksjon og forberedt for flowcytometrisk analyse. Celler ble fiksert i 30 minutter i 70% etanol og farget med propidiumjodid. Målinger av DNA celleinnholdet ble utført ved hjelp av en FACSCalibur (BD).
Cell vekstanalyse
En MTT-analysen ble brukt til å evaluere cellevekst. Celler ble sådd ut i 12-brønners plater (1 x 10
4 celler /brønn) og MTT-oppløsning (0,25 mg /ml) ble tilsatt til mediet etter inkubering i 24, 48, 72 eller 96 timer. Formazankrystaller ble oppløst i DMSO, og absorpsjonen ble målt ved 570 nm ved anvendelse av en Infinite 200 mikroplateleser (TECAN, Kawasaki, Japan).
Cellemigrering assay
Migrering ble evaluert ved anvendelse av en sårheling analyse. Celler ble dyrket i 12-brønners plater til en nær sammenflytende nivå i DMEM inneholdende 10% FBS. Kryssede streker ble gjort på enlagskultur bruker 200-ul pipettespisser. Cellene ble vasket en gang med DMEM inneholdende 10% FBS for å fjerne de frigjorte celler. Celler ble inkubert i et medium inneholdende mitomycin (3 ug /ml, Nacalai Tesque) i 1 time for å inhibere proliferasjon. Således, den observerte økningen i celletall var ikke skyldes økt cellulær proliferasjon. Cellemigrasjon ble overvåket for 0, 12, 24 og 48 timer, og bildene ble tatt på hvert tidspunkt ved hjelp av et digitalt kamera (Nikon, Tokyo, Japan) som er festet til en omvendt fase kontrast mikroskop (Nikon).
Invasion analysen
invasjonen analysene brukte 24-brønns BD BioCoat Matrigel invasjonen kamre med 8-mikrometer pore innsatser (BD). Celler (5 x 10
4) suspendert i serumfritt DMEM ble sådd ut i de øvre innsatser, mens DMEM inneholdende 10% FBS ble tilsatt til de nedre kamre som et kjemotiltrekkende. Cellene ble fjernet fra den øvre overflaten av filteret ved å skrape med en bomullspinne etter 22 timer i kultur. Celler som infiltrerte gjennom filteret ble fiksert og farget med hematoksylin-eosin (H /E). Middelverdiene for de resultater som ble oppnådd med de tre kammere ble anvendt i analysen.
Immunofluorescence
Celler dyrket i åtte-brønners kulturglass ble fiksert med 3,7% formaldehyd i PBS i 30 minutter, permeabilisert med 0,25% Triton X-100 (Merck Calbiochem, Darmstadt, Tyskland), og blokkert med 1% FBS i PBS. Actin var farget hjelp rhodamine-phalloidin (Invitrogen). Immunofluorescence bildene ble visualisert ved hjelp av et Olympus BX-61 fluorescerende mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan), og bildene ble tatt med et CoolSNAP-HQ kamera (Nippon ROPER, Tokyo, Japan).
Rho familien aktivitetsanalyse
Rho familien aktiveringstest ble også utført med en RhoA /Rac1 /Cdc42 aktivering Combo Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk ble celler vasket, lysert i analysebuffer, og sentrifugert ved 10.000 x
g
i 1 min for å fjerne celleavfall. For å bestemme det totale ekspresjonsnivå av RhoA /Rac1 /Cdc42 ved western blotting, ble 20 ul av hver prøve lagret ved -80 ° C for separat analyse. Et cellelysat inneholdende 500 ug totalt protein ble inkubert i 1 time ved 4 ° C med rotasjon med 40 ul av de agarosekuler, som bandt aktiverte RhoA, Rac1, og Cdc42. Agarosekuler bundet til aktiv RhoA /Rac1 /Cdc42 ble vasket tre ganger ved anvendelse av analysebuffer, resuspendert i 40 pl av 2 x LDS-prøvebuffer og kokt ved 70 ° C i 10 min. Den aktive (GTP-bundet) og total RhoA /Rac1 /Cdc42 protein nivåer i hver prøve ble bestemt ved western blotting.
Statistiske analyser
Hvert eksperiment ble utført i tre eksemplarer. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Excel (Microsoft, WA, USA). Sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av Student
t
-test. Korrelasjonen av de ezrin ekspresjonsnivåene med tungen SCC og lymfeknutemetastase ble analysert ved hjelp av Fishers eksakte test, mens scene og differensierings karakterer ble analysert ved anvendelse av Tukey multiple sammenligningsmetoden. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på
P
. 0,05
Resultater
ezrin uttrykk i tungen kreft og noncancerous vev
ezrin immunoreaktivitets ble observert i cellemembraner, mens den var svakt positiv i cytoplasma av normale tunge slimhinne (fig. 1A). I motsetning til dette, tunge SCC prøvene viste membran og cytoplasmisk farging ezrin, og cytoplasmatisk farge var større på disse prøver enn i de normale tunge mucosa prøver (fig. 1B). Tabell 2 viser resultatene av ezrin farging. I noncancerous menneskelige tunge vev, alle 10 prøvene uttrykt ezrin på lave nivåer. I humane tunge SCC vev, ble imidlertid høye ezrin ekspresjon detektert i 32/69 (46,4%) tumorer, mens lav ekspresjon ble påvist i 37/69 (53,6%) tumorer. Høy ezrin uttrykk var betydelig mer vanlig i menneskelige tunge SCC vev enn i noncancerous vev (
P
= 0,0046). Høy ezrin uttrykk tendens til å bli detektert mer ofte i tilfeller med lymfeknutemetastaser (62,5%) enn i med de uten lymfeknutemetastaser (44,3%), men det var ingen signifikant korrelasjon mellom de ezrin ekspresjonsnivåene og scenen karakter, regional lymfeknutemetastase, og differensiering Karakter (
P
0,05)
(A) ezrin uttrykk var lav i noncancerous vev (forstørrelses 40 × og 200 ×).. (B) ezrin ble sterkt uttrykt i tunge plateepitelkarsinom (forstørrelse 40 × og 200 ×). Ezrin immunoreaktivitets var tydelig i membranen til normal tunge epitel, mens positiv farging for ezrin var først og fremst i cytoplasma eller i membranen og cytoplasma tunge plateepitelkarsinom celler.
Korrelasjon mellom ezrin uttrykk og indeksene av Ki-67 og apoptose i menneskelig tunge SCC vev
Vi har evaluert sammenhengen mellom ezrin uttrykk og Ki-67 og apoptotiske indekser i menneskelige tungen SCC vev. Ki-67-indeksen var 33,0 ± 19,3% i vev med lav ezrin ekspresjonsnivåer og 48,1 ± 15,0% i vev med høy ezrin ekspresjonsnivåer (fig. 2A). Det var en positiv korrelasjon mellom ezrin uttrykk nivåer og Ki-67-indeksen (
P
= 0,0003). Den apoptotiske Indeksen var 0,60 ± 0,74% i vev med lav ezrin ekspresjonsnivåer og 0,70 ± 0,78% i vev med høy ezrin ekspresjonsnivåer (Fig. 2B). Det var ingen signifikant korrelasjon mellom ezrin uttrykk nivåer og apoptotisk indeks (
P
= 0,5776).
(A) Ki-67-indeksen var 33,0 ± 19,3% i vev med lav ezrin uttrykk og 48,1 ± 15,0% i vev med høy ezrin uttrykk. Signifikante forskjeller ble observert i sammenheng mellom ezrin uttrykk og Ki-67-indeksen (
P
= 0,0003). (B) Det var ingen signifikant sammenheng mellom ezrin uttrykk og apoptotiske indekser (
P
= 0.5776).
ezrin genuttrykk i menneske tungen SCC cellelinje HSC-3 etter RNAi
for å undersøke effekten av ezrin siRNA behandling på HSC-3 celler, brukte vi QRT-PCR og Western blotting for å måle ezrin mRNA og proteinnivåer, henholdsvis i HSC-3 celler som ble transfektert med siRNA. Som vist i figur 3A, ble det ezrin mRNA-ekspresjon tydelig hemmet i ezrin-siRNA-celler enn i NSC celler (0,10 ± 0,03 vs 1,06 ± 0,21;
P
0,05). Den vestlige blot analyse viste at RNAi reduserte ezrin protein nivåer (Fig. 3B).
(A) ezrin mRNA uttrykk ble analysert ved hjelp av real-time PCR etter RNAi. Inhiberingen av ezrin mRNA-ekspresjon ble klart observert i ezrin siRNA-transfekterte HSC-3-celler, sammenlignet med det i HSC-3-kontrollceller (0,10 ± 0,03 vs 1,06 ± 0,21;
P
0,05). (B) ezrin protein uttrykk ble oppdaget av western blotting etter RNAi. Uttrykket av ezrin sunket dramatisk i ezrin siRNA-transfekterte HSC-3 celler.
Effekter av ezrin RNAi på cellecyklusprogresjonen og apoptose
Vi transfektert HSC-3 celler med ezrin siRNA og hentet dem etter tre dager for cellesyklusanalyse. Strømningscytometri viste at G0 /G1 fraksjon øket fra 37,7% ± 4,9% til 54,1% ± 0,5% (
P
= 0,0046) i de HSC-3-celler etter RNAi (fig. 4). I motsetning til dette ble det S og G2 /M-fraksjoner ble redusert i HSC-3-celler etter RNAi. Spesielt var andelen av S-faseceller ble redusert fra 50,8% ± 1,6% til 36,6% ± 0,4% (
P
= 0,0018), mens andelen av G2 /M-celler ble redusert fra 11,5% ± 3,3% til 9,3% ± 0,9% (
P
= 0,1155). Ingen preG0 /G1 celler eller apoptotiske legemer ble observert i kontrollgruppen og siRNA-transfekterte celler. Disse resultatene antyder at ezrin siRNA kan hemme celleproliferasjon ved å forstyrre celle mitose og cellesyklusprogresjon.
Andelen av HSC-3-celler i S-fase ble redusert fra 50,8 ± 1,6% til 36,6 ± 0,4% etter RNAi (
P
= 0,0018). Andelen av celler i G0 /G1 fase også økt fra 37,7 ± 4,9% til 54,1 ± 0,5% etter RNAi (
P
= 0,0018). Apoptose ble ikke påvist.
Effekter av ezrin RNAi på cellevekst
Effektene av ezrin protein uttrykk på cellevekst ble testet ved hjelp av en MTT analyse. Veksttakten av ezrin siRNA-behandlede celler ble redusert i en tidsavhengig måte (Fig. 5). Absorbansverdiene for MTT-assay etter 72 timer var 0,36 ± 0,02 og 0,30 ± 0,01 for NSC- og ezrin siRNA-transfektert HSC-3-celler, respektivt. Disse data indikerer at det var en signifikant reduksjon i cellevekst i ezrin siRNA-transfekterte celler enn i kontrollcellene.
Veksten av ezrin siRNA-transfektert HSC-3-celler ble redusert på en tidsavhengig måte. (24 t:
P
= 0,6727, 48 t:
P
= 0,5314, 72 t:
P
= 0,0122, 96 t:
P
= 0,0065).
Effekter av ezrin RNAi på celle migrasjon og invasjon
Sårhelende analyser ble utført for å evaluere cellemotilitet av NSC- og ezrin siRNA-transfekterte celler. Et sår ble opprettet på en celle monolag, og sårheling ble vurdert ved forskjellige tidspunkter. Ezrin stanse i HSC-3 celler svekket deres evne til å helbrede et sår sammenlignet med det i kontrollceller som uttrykte ezrin (Fig. 6). Invasion analyser ble også utført med Matrigel-belagte Transwell kultur kamre, og de invaderende cellene ble telt etter 22 timer. De ezrin siRNA-transfekterte celler oppviste et fire ganger lavere celle invasjon hastighet enn de NSC-transfekterte celler som uttrykte ezrin (564,7 ± 111,8 1969,8 ± vs 126,6;
P
0,05, Fig. 7).
celler ble såret ved å skrape med en pipettespiss, og mitomycin (3 mg /ml) ble tilsatt til mediet i 1 time for å hemme proliferasjonen av kreftceller. Celler ble deretter inkubert med DMEM i 48 timer. Celler ble fotografert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi. HSC-tre cellemigrasjon ble redusert med ezrin siRNA behandling.
(A) Matrigel-belagte Transwell kamre ble brukt til å analysere celle invasjon. Celler som infiltrerte gjennom filteret ble fiksert og farget, og representative feltene ble fotografert. (B) Cellene ble kvantifisert ved telling under et lysmikroskop. Sammenlignet med HSC-3 kontrollceller, de ezrin siRNA-transfekterte HSC-3 celler viste signifikant redusert invasivitet (1969,8 ± 126,6 vs 564,7 ± 111,8;
P
0,05).
effekter av ezrin RNAi på aktin cytoskjelettet omorganisering
Vi har analysert virkningene av ezrin nedregulering på organiseringen av aktin cytoskjelettet. Analyser av phalloidin-fargede celler viste at podia dannelse var tydelig hemmet i ezrin siRNA-transfekterte celler (fig. 8). Disse funn indikerte at fravær av ezrin forårsaket morfologiske forandringer i kreftcellene gjennom aktin cytoskjelettet ombygging.
NSC- og ezrin siRNA-transfektert HSC-3-celler ble merket med et antistoff mot aktin. Ezrin uttømming av HSC-3 celler førte til reduserte ezrin protein nivåer. Dette downregulation var assosiert med tap av fremspring (piler).
Rho familie proteiner, E-cadherin, N-cadherin og β-catenin uttrykk i ezrin-utarmet celler
Det var ingen forskjeller i den totale proteinnivåer RhoA, Rac1, og Cdc42 (fig. 9), og nivåene av sine aktive formene var for lavt til å bli oppdaget i NSC- og ezrin siRNA-transfekterte celler.
ekspresjon av E-cadherin og β-catenin ble økt og ekspresjon av N-cadherin ble redusert i ezrin siRNA-transfekterte HSC-3-celler sammenlignet med de NSC-transfekterte celler. Det var ingen signifikant forskjell i den totale proteinnivåer RhoA, Rac1 og Cdc42.
Vi testet om uttrykket nivåer av E-cadherin, N-cadherin og β-catenin ble påvirket av ezrin uttømming i HSC-3 celler ved å kvantifisere deres uttrykk ved hjelp av western blotting. Som vist i figur 9, ble E-cadherin og β-catenin uttrykk økt, mens N-cadherin ekspresjon ble redusert i ezrin siRNA-transfekterte celler enn i de NSC-transfekterte celler. Disse resultater indikerer at undertrykkelse av ezrin protein ekspresjon indusert oppregulering av E-cadherin og β-catenin, men den nedregulering av N-cadherin i HSC-3-celler.
diskusjon
Tissue mikromatriseanalyse viste at høy ezrin uttrykk var betydelig mer vanlig i den menneskelige tungen SCC vev enn noncancerous vev (
P
= 0,0046). Det var også en positiv sammenheng mellom ezrin uttrykk og Ki-67-indeksen i denne studien. Ki-67-antigenet uttrykt av prolifererende celler i løpet av G1, S, G2 og M fasene, men ikke i løpet av G0 fase (hvilende celler) [33]. Ki-67 blir brukt som en markør av tumor proliferasjon og aggressivitet, og det kan ha en stor effekt på prognosen for pasienter med HNSCC [34]. Høy ezrin uttrykk tendens til å bli oppdaget oftere i tilfeller med lymfeknutemetastase (62,5%) enn hos de uten lymfeknutemetastase (44,3%). Vår
in vitro
eksperimenter med den menneskelige tungen SCC cellelinje HSC-3 med og uten RNAi behandling også påvist en sammenheng mellom ezrin overekspresjon og mer aggressiv atferd, mens det var ingen signifikante sammenhenger mellom ezrin uttrykk mønstre og TNM iscenesettelse i menneskelige tungen SCC vev. Nicolas et al. rapporterte også ingen signifikant forskjell i ezrin ekspresjon i avanserte og nedre TNM scene tumorer, mens høye nivåer av ezrin og moesin ekspresjon var assosiert med dårlig overlevelse etter kreft [35], [36]. Disse funnene tyder på at ezrin overekspresjon kan brukes som en prognostisk markør uavhengig av TNM staging.
in vitro
roller ezrin i mobilnettet oppførsel ikke er blitt evaluert i tunge SCCS. Våre RNAi eksperimenter oppdaget sterk undertrykkelse av cellevekst, motilitet, og invasivitet i HSC-3 tunge SCC celler. Analysen cellesyklusen viste at ezrin uttømming økte G0 /G1 fraksjon men reduserte G2-M fraksjon ved å forstyrre celle mitose og cellesyklusprogresjon. Disse resultatene er enig med de som er rapportert av Zhang et al. i leverkreft [37]. De viste også at ezrin kan øke veksten av kreftceller ved å støtte celledeling og cellesyklusprogresjon fra G0 /G1 til S og G2 /M-fasene. Dette avtales med resultatene av vevet microarray Ki-67 indeksen. Vi har også observert at ezrin uttømming hemmet cellevekst i et MTT-assay.
Cell migrering og invasjon er viktige prosesser i metastasen av kreftceller. Trekkende kreftceller gjennomgå en rekke morfologiske endringer via omorganisering av adhesjonsmolekyler og aktin fibre [38]. Det er nå vidt akseptert at prosessen med kreftcellemigrering omfatter fire hovedtrinn-dannelse og utvidelse av filopodia og lamellipodia ved den fremre kant, etablering av nye klebe områder på forsiden, sammentrekning av cellelegemet, og avløsning av adhesjoner i bak [39]. Vi observerte at ezrin uttømming redusert kreftcelle motilitet og invasivitet og hemmet podia formasjon. Disse resultater indikerer at inhibering ezrin forstyrret ombygging av aktin cytoskjelettet, noe som reduserte motilitet og invasivitet av HSC-3-celler. Disse funnene er enig med tidligere rapporter som viste at endringer i cytoskjelettet kan være en viktig faktor i reguleringen av neoplastiske progresjon og tumorvekst [24], [40] – [43]. En tidligere studie oppdaget også en dramatisk reduksjon i antallet av kreft i bukspyttkjertelen celler med podosomal rosetter etter ezrin RNAi behandling og rapporterte at dannelsen av podosomes og deres rosetter ble drevet av en ezrin-cortactin interaksjon, som har en rolle i bukspyttkjertelkreft invasjon [44 ]. En annen rapport viste at pseudopod formasjonen ble klart redusert med ezrin RNAi behandling i fire leverkreft cellelinjer [37].
Våre resultater tyder på at ezrin spiller en viktig rolle i invasiv vekst av tunge SCCS. Vi har også undersøkt aktin, Rho familie proteiner, E-cadherin, N-cadherin og β-catenin å undersøke de molekylære mekanismene bak disse observasjonene. Vi fant ut at ezrin undertrykkelse indusert forsterket uttrykking av E-cadherin og β-catenin i HSC-3 celler. Det er kjent at E-cadherin spiller en sentral rolle i epitelial celle-celle adhesjon og opprettholdelse av epitelceller koloni integritet [45]. Det er godt dokumentert at tapet eller inhibering av E-cadherin funksjon, eller dens tilhørende catenins, fører til redusert intercellulær adhesjon og en økt invasiv potensiell [46]. Videre har flere studier av epiteliale maligniteter, inkludert oral SCCS, antydet at E-cadherin /β-catenin kompleks regulerer kreft invasjon og metastasering [47], [48]. Cadherin adhesjons komplekser samvirke med aktin cytoskjelettet på en kompleks måte, noe som er dårlig forstått. Den nåværende oppfatning er at E-cadherin er bundet til aktin cytoskjelettet gjennom dets interaksjon med β-catenin, noe som i sin tur binder aktin-bindende protein α-catenin [49]. Nyere bevis tyder på at ezrin er viktig for lokalisering av E-cadherin til plasmamembranen [24]. Dermed hypotese vi at E-cadherin og β-catenin downregulation knyttet til ezrin overekspresjon kan ha blitt assosiert med aktin ombygging og dannelse av Podia extensions.
Det er allment kjent at aktin omorganiseringen er regulert av Rho familie små GTPases som Rho, Rac, og Cdc42 [50], dvs. regulerer Rho stresset fiber og fokal heft montering, Rac regulerer dannelsen av lamellipodia fremspring og membran volanger, og Cdc42 utløser filopodial utvidelser på celle periferien [51]. Vi undersøkte uttrykk og aktivitet av RhoA, Rac1, og Cdc42 i ezrin siRNA- og NSC-transfekterte HSC-3 celler.
