Abstract
Den heterogenitet av kreftceller og deres forandring i løpet av sykdommen oppfordrer behovet for sanntids karakterisering av individuelle tumorceller for å forbedre vurderingen av behandling. Nye generasjoner av behandling er ofte forbundet med spesifikke genetiske forandringer som driver behovet for å fastslå den genetiske sammensetningen av tumorceller. Her presenterer vi et mikrofluid anordning for parallell enkelt celle hele genomet forsterkning (pscWGA) for å oppnå nok kopier av en enkelt cellegenomet for å undersøke for tilstedeværelse av behandlings mål og frekvensen for dens forekomst blant tumorceller. Individuelle celler ble først tatt og lastet inn i åtte parallelle forsterkerenhetene. Deretter ble cellene lysert på en brikke, og deres DNA amplifisert ved suksessiv innføring av tilhørende reagenser under blanding aktivt ved hjelp av integrerte knapp-ventiler. Reaksjonskammervolum for scWGA 23,85 nl, og starter 6-7 pg DNA inneholdt i en enkelt celle, rundt 8 ng DNA ble oppnådd etter WGA, representerer over 1000 gangers forsterkning. De forsterkede produkter fra enkelte brystkreftceller ble samlet fra enheten til enten direkte undersøke forsterkningen av spesifikke gener ved qPCR eller for re-forsterkning av DNA for å oppnå tilstrekkelig materiale for hele genomsekvensering. Vår pscWGA enhet gir tilstrekkelig DNA fra individuelle celler for deres genetiske karakterisering, og vil utvilsomt gi rom for automatisert prøveopparbeidelse for enkelt kreftcelle genomisk karakterisering
Citation. Yang Y, Swennenhuis JF, Rho HS, Le Gac S, Terstappen LWMM (2014) Parallell Enkelt Cancer Cell Whole Genome Amplification Bruk Button-Valve pasning Mixing i nanoliter Chambers. PLoS ONE ni (9): e107958. doi: 10,1371 /journal.pone.0107958
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 30 april 2014; Godkjent: 16 august 2014; Publisert: 18.09.2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien er finansiert av NanoNextNL, en mikro og nanoteknologi konsortium av regjeringen i Nederland og 130 partnere. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Denne studien er finansiert av NanoNextNL, en mikro og nanoteknologi konsortium av selskaper, universiteter, kunnskaps institutter og universitets medisinske sentre. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
For karakterisering av svulster, uttrykket av spesifikke proteiner eller gener er vanligvis gitt som til stede eller fraværende, for eksempel, ER + eller ER-, HER2 + eller her-, og EGFR mutasjon til stede eller fraværende. Denne bestemmelsen har viktige konsekvenser for de umiddelbare terapeutiske beslutninger og å utsette pasienter til bestemte behandlinger. For eksempel pasienter med kreft celler har en forsterkning av ErbB2 (Her2) genet er mest sannsynlig å dra nytte Her2 rettet mot stoffer som Trastuzumab. [1] Dessverre, svulster er mye mer kompleks: uttrykk nivåer kan variere i stor utstrekning innenfor en svulst, og kan endres i løpet av sykdommen. [2] – [4] For eksempel, somatiske mutasjoner som kan være til stede bare i en liten del av tumoren [5] og tumorceller kan bli resistente mot terapi forbundet med genetiske forandringer. For å demonstrere tilstedeværelse og omfanget av dette heterogenitet i tumorceller analyse på celle-nivå er nødvendig for ikke å gå glipp av denne viktige informasjonen [5] -. [7]
For å undersøke genomet til en enkelt celle i et omfattende og pålitelig måte, må hele genomet bli amplifisert samtidig opprettholde den opprinnelige fremstilling av genene til å utføre nedstrøms analyse som hele genomsekvensering [6] – [8], rekke sammenlignende genom hybridisering (aCGH) [9], [10] eller sanntids kvantitativ PCR (RT-qPCR) [11], [12]. På dette tidspunkt alle disse teknikkene krever flere titalls nano gram til noen få mikro-gram av materialet i det hele genomet. Multiple forskyvning forsterkning av phi 29 polymerase er en attraktiv metode for enkelt celle hele genomet forsterkning under isoterme forhold. [13] DNA-amplifikasjon ved bruk av phi29 enzymet har den fordel at den kan produsere lange DNA-trådene ( 10 kb) i store mengder (opp til 1~2 ug) i en forholdsvis kort tid (2 timer). [14] – [16] Det er imidlertid den meget lave konsentrasjon av DNA som finnes i en enkelt cellegenomet i det fremdeles store volum av WGA-blanding (20-50 pl) ofte gir opphav til ikke-spesifikt amplifikasjonsprodukt og forsterknings skjevheter. [17] – [19] I tillegg, sortering og manipulering av de enkelte celler for å utføre enkelt celle analyse kan være meget krevende og hver manipulering kan gi opphav til tap av materiale. Fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) [8], [20], micromanipulation [10], [11], laser capture mikrodisseksjon (LCM) [9], [21] og DEP Array [22], [23] har alle vært anvendes for enkelt celle isolasjon, men behandling av cellene for å oppnå DNA for genetisk analyse (for eksempel lysering, nukleinsyreisolering og amplifikasjon) har ikke eller ikke kan integreres. På den annen side, MicroFluidics og microfabricated strukturer tillater enkel celle manipulering som samtidig er lett koplet til en enkelt celle analyse trinn. [24] – [26] Videre presenterer MicroFluidics en nøkkel-fordel for WGA, ettersom reaksjoner foregår i et mye mindre volum enn ved bruk av tradisjonelle pipettering og mikrorør (pico-liter versus mikro-liter). Denne fordelen er spesielt fremhevet for WGA av enkelt bakterielle celler ved hjelp av reaksjonsvolumer av 60 nl resulterer i en lavere bakgrunn og høyere dekning med mindre forsterkning skjevhet [27].
I microfluidic enheter, oppstår blanding naturlig ved passiv diffusjon . Spesielt diffusjon av store molekyler, slik som phi29 polymerase tar lengre tid enn mindre molekyler og begrenser det pålitelige og reaksjonshastigheten i microfluidic enhetene. Roterende blandebatteri har blitt brukt for å øke hastigheten på denne blandeprosessen i microfluidic enheter. [28], [29] Det er imidlertid den totale størrelsen av disse strukturene begrenser antall parallelle reaktorer som kan plasseres på den ene enhet, og prøveblandingen må transporteres til en annen reaktor for det neste trinn av analysen. I tillegg er overflatearealet av en reaktor mye større, noe som kan øke eksempeltapsproblemer på grunn stikker på kanalveggene. Alternativt kan ventilstrukturer være implementert i en kontinuerlig reaktor for aktiv blanding av reagensene.
Her har vi introdusere et mikrofluid anordning for parallell enkelt celle WGA. For demonstrasjons en enhet med 8 parallelle reaksjonskamrene er designet og testet for å laste åtte individuelle tumorceller som senere ble lysert under alkaliske betingelser etterfulgt av nøytralisering trinn og WGA. DNA fra enkeltceller ble amplifisert ved phi29 polymerase i den avgrensede PDMS kammeret for nedstrøms off-chip-analyse. Knapp ventil-assistert blandingen oppnådd WGA av individuelle tumorceller med et reagens volum på ~ 20 nl, sammenlignet med 20 pl i tradisjonelle WGA reaksjoner.
E.coli
DNA ble først brukt som et modellsystem for å tilpasse WGA hjelp phi29 polymerase, etterfulgt av individuelle celler fra brystkreftcellelinjer for svulst scWGA. Kvaliteten på on-chip amplifiserte DNA ble vurdert ved qPCR målrette 10 forskjellige gener.
Eksperimentelle metoder
Chip Fabrication og Device Forberedelse
microfluidic enheter ble fabrikkert av flerlags myk litografi teknikk. [30], [31] Først maske design ble utarbeidet av CleWin programvare (WieWeb programvare, Hengelo, NL) og skrives ut på en 5 «soda lime glass med en maske generator LBPG Heidel DWL200 (Berg Instruments Mikrotechnik GmbH). Hoved formene ble fremstilt ved en fotoresist-baserte fotolitografisk teknikk. positiv fotoresist (AZ 40 XT, Microchem Corp.) ble spinnbelagt på et 4 «silikonplate, og mønstret ved hjelp av fotolitografi. For pålitelig drift av mikroventiler, ble den tverrsnittsformen av mikrokanaler i hovedfluidkanaler avrundet ved oppvarming av støpeformen ved 140 ° C i ett minutt etter fremkalling. Det øverste fluidsjikt ble fremstilt ved å helle uherdet PDMS (GE RTV-615, elastomer: kryssbinder = 5:01) inn i formen for å oppnå en tykkelse på 7 ± 0,5 mm. Den nederste kontrollaget ble gjort ved spinnbelegging uherdet PDMS (elastomer: tverrbinder = 20:01) på hoved formen ved 2500 opm i 1 min. Den resulterende tykkelse av styrelaget var 25 ± 2 um. Den fluid og kontroll lag ble herdet i 45 min og 30 min, henholdsvis, ved 80 ° C. Den fluidic laget ble skrellet av fra formen og hull for innløp og utløp ble stanset med en 25-gauge slag (Syneo Co, Angleton, TX, USA). Deretter ble det fluidiske lag justert over kontrollaget ved hjelp av justeringsmerkene på de to lagene under et stereomikroskop, og de sammenstilte lag ble bundet ved å bake dem ved 80 ° C i 60 min. De bundne lagene ble deretter skrelles av fra formen, og hull for kontrollporter ble stanset. Til slutt ble det flerlags PDMS-enheten er dekket av et pre-renset objektglass (Fisher Scientific, Landsmeer, NL) og holdes i ovnen ved 80 ° C i 12 timer for å forbedre adhesjonen. Før bruk innretningene ble forhåndsbelagt med leding av en BSA-oppløsning (0,5 mg /ml) gjennom kanaler i 20 min. BSA løsninger ble skjøvet ut av luften.
Whole Genome Amplification
Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) ble brukt for WGA. Lysis (400 mM KOH, 10 mM EDTA, 100 mM DTT), nøytralisering (0,4 ml 1 M HCl og 0,6 ml av 1 M Tris-HCL, pH 7,5), og presser buffere (1X Tris-EDTA, 0,2% Tween -20) ble introdusert til dedikerte innganger på enheten. Amplifikasjonsreaksjonen ble gjennomført på en AmpliSpeed lysbilde cycler (Advalytix AG, München, Tyskland) i 2 timer satt til 34 ° C. Etter amplifikasjon, ble prøvene samlet opp fra de enkelte forsterkerenhetene og overført til en PCR-plate, etterfulgt av et inaktiveringstrinn ved 65 ° C i 10 min. For re-amplifikasjon av on-chip-amplifiserte prøver, ble 17 ul WGA-blandingen ble tilsatt til 1 pl av on-chip amplifisert prøve basert på produsentens protokoll og reaksjonen ble utført ved 30 ° C på en Bio-Rad CFX 384 real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA,) for 70 min. Dette ble etterfulgt av en inaktiveringstrinn ved 65 ° C i 10 min.
kvantifisering og kvalifisering
qubit 2,0 fluorometer og qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Breda, NL) ble brukt til å kvantifisere dsDNA. Sanntids SYBR grønn qPCR ble anvendt for kvantifisering av target-spesifikke DNA. For
E.coli
WGA, ble primerne mot en liten subenhet (SSU), 369 bp, av de 16 S-rRNA-genet ble brukt ved en konsentrasjon på 500 nM. For enkelt kreftcelle forsterkning, primere designet for å målrette liten subenhet av GAPDH (12p3), ErbB2 (17p12), CCND1 (11q13), MYC (8q24.21), PRMT2 (21q22.3), URB2 (1q42.13), FGFR1 (8p12), P53 (17p13.1), TRAM1 (8q13.3), og PAK1 (11q13-Q14) ble brukt i en konsentrasjon på 500 nM.
Cell Kultur og klargjøring
brystkreft cellelinje, SKBR-3 (ATCCHTB-30) og MCF-7 (ATCCHTB-22) celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, NL), supplert med 10% føtalt bovint serum (Sigma Aldrich), 2 mM L-Glutamin (Sigma Aldrich), 1% penicillin-streptomycin (Sigma Aldrich) ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære. Før eksperimentering, ble cellene farget med CellTracker Orange CMTMR (Molecular Probes, Breda, NL) ved 37 ° C i 30 minutter og frittliggende med 0,05% Trypsin /EDTA (Gibco, Paisly, UK). Deretter ble cellene vasket en gang med dyrkningsmedium og resuspendert i PBS-løsning.
fluorescens in situ hybridisering (FISH)
SKBR-3 og MCF-7-celler ble dyrket og høstet som beskrevet ovenfor. Begge cellelinjer ble fikset i suspensjon ved hjelp Carnoy sin fiksativ (Metanol (Fisher Scientific, Loughborough, UK): Eddiksyre (Merck, Hohenbrunn, Tyskland), 03:01) og falt på en vanlig objektglass. Platene ble tillatt å tørke i 30 minutter før den ble inkubert i 15 minutter i 2x SSC (20x SSC = 3 M natriumklorid (Merck), 0,3 M natriumcitrat (Merck), pH 7,0), 0,5% Igepal (Sigma Aldrich), hvoretter lysbildene var dehydrert i graderte etanol (70%, 85%, 100%) for ett min hver. 3,5 ul Her2 /neu (ErbB2) (Kreatech, Amsterdam, NL) probe blanding ble påført lysbildene etterfulgt av en Ø12 mm dekkglass (Thermo Scientific, Breda, NL). Etter at kanten av dekkglasset ble forseglet med gummisement (Kreatech), ble prober og target denaturert i 10 minutter ved 76 ° C og tillatt å hybridisere i 16 timer ved 37 ° C. Etter hybridisering av dekkglass ble fjernet og en stringent vask ble påført ved hjelp av 0,4x SSC, 0,3% IGEPAL ved 72 ° C i 2 min. Platene ble skyllet i 5 minutter i 2x SSC 0,1% IGEPAL og dehydrert i graderte Etanol (70%, 85%, 100%) i 1 minutt hver. Lysbilder ble endelig montert i DAPI /Antifade (Kreatech).
Diskusjon
Resultater og
Enhets Karakterisering
Design og virkemåte i parallell enkelt celle WGA enhet er illustrert i Figur 1. anordningen omfatter 8 forsterkerenhetene med 6 innløp (åpne sirkler blå) og 10 utløp (fylte sirkler) blått (figur 1A), og den består av to lag, et fluidisk lag (blått) og en styringslag (i rød og rosa). Hver forsterkningsenhet (se figur 1B) består av tre sirkulære kamre (1,2 nl) og en firkantet kammer (20,25 nl). Stengeventiler (i rødt) drives pneumatisk og gi rom for både manipulering av cellene og lasting av løsningene. Blandeventiler (i rosa) ligger i midten av de tre sirkulære kammere opereres på samme måte. Hovedkanalen har tre innløp for den respektive innføring av cellesuspensjonen, den lyseringsbuffer og nøytralisering buffer, som er forbundet med kanaler multiplekses for å skyve innhold til 8 individuelle forsterkningsenhetene på den motsatte side. WGA-produkter kan hentes på de 8 individuelle uttaket reservoarer. Anordningen drift Prosessen er vist i figur 1C, hvor fargestoffer ble innført i anordningen for visualisering og avbildet under et mikroskop. Den blå farge representerer WGA blandingen, den oransje fargestoff cellesuspensjonen, det grønne fargestoff i lyseringsbuffer, det røde fargestoff nøytraliseringen buffer og den lilla farge skyve buffer. Først den blå fargestoff ble brukt til å fylle alle rektangulære kamre. Deretter ble den oransje fargestoff som er lagt i hovedkanalen og presset på de åtte første sirkulære kamre. Den samme operasjon ble utført for de grønne og røde fargestoffer. Til slutt ble løsningen til stede i de tre sirkulære kammere og det blå fargestoff i kvadrat kammeret ble blandet. Reagenser ble blandet oppnådd ved aktivering av de tre knappe ventiler, og denne operasjonen prosedyren er vist i en film (Movie S1). For scWGA, brukte vi på knappen ventil aktivering bare for WGA reaksjonstrinnet i figur 1 (C-j). På grunn av den lave Reynolds tall finnes i de microfluidic kanaler, opptrer blandingen ved passiv diffusjon. For å forbedre blandeeffektiviteten for DNA-amplifisering, ble knapp-ventiler form integrert i de lukkede forsterkningsenhetene i anordningen, i midten av de tre sirkulære kammere. Trykksetting de tre knappe ventiler sekvensielt hjelper blande reagenser fra runde og firkantede kamre. Blande effektivitet av knapp ventilene ble først undersøkt i blandetester ved anvendelse av en blå farge fargestoff. Etter plassen WGA kammeret ble fylt med blå farge fargestoff, ble de tre sirkulære kamre fylt med MiliQ vann og stengeventilen ble åpnet mellom runde og firkantede kamre. Deretter ble knapp ventiler åpnes og stenges etter hverandre ved en gitt frekvens. Ved å observere den blanding av fargene sekvensen av åpning og lukking av ventilene knapp var optimalisert. For å få tilgang blandeeffektivitet, ble lysstyrkeverdien av den første sirkelen kammer registrert under blanding i området som er angitt som en rød sirkel linje i figur 2A. Tiden for fullstendig blanding ved diffusjon alene ble funnet å være omtrent 30 minutter mens knappen ventil assistert ved å blande 2 Hz var mye raskere og bare tok ca 4 min, som vist i figur 2B. Fullføring av blande ble innstilt slik at lysstyrkeverdi målt ved hjelp av Image J programvare i det første kammer nådde 110 (blå farge) fra 220 målt fra den transparente MilliQ. Driftsventiler ble testet ved frekvenser mellom 0,1 og 30 Hz i 5 minutter og blande resultatene er vist i figur 2C. Blandings effektivitet redusert under 0,5 Hz og over 5 Hz, og minst 4 min betjening av ventiler som var nødvendig for optimal blanding. Etter hvert som molekylvekten påvirker molekyl diffusjonskoeffisient og ettersom molekylvekten av maten farge fargestoff er betydelig mindre enn den for phi29 polymerase (MW 68 000), har vi også brukt rhodamin-konjugert dekstran (MW 70 000) og acridin oransje merkede DNA for å vurdere blande i enheten ved fluorescens mikroskopi. Blanding var faktisk tregere i forhold til mat farge fargestoff og nådde ferdigstillelse i ca 20 min på en Hz. (Figur S1).
(A) Skjematisk visning av enheten. Enheten inneholder 8 forsterker enheter med 6 innganger og 10 utsalgssteder. (B) Forstørret visning av to forsterkningsenheter. Den blå fargen representerer strømningskanalene, den røde fargen representerer kontroll lag for avstengningsventiler og den rosa fargen representerer styre lag for knappe ventiler. Forsterkerenhetene består av tre sirkulære kammere (1,2 nl) for cellesuspensjon, lyseringsbuffer, og nøytralisering buffer og en firkantet kammer (20,25 nl) beregnet for WGA blanding. Blandeventiler er plassert i sentrum av tre sirkulære kammere. (C) -enhet drift prosess. Bright-feltet bilder av en forsterkning enhet med fargestoffer demonstrere drift prosess. (A-j).
(A) Bright-feltet bilde av en forsterkning enhet hvor plassen kammeret er fylt med blå farge fargestoff og tre sirkulære kamre med vann, tatt ved t = 0. Gjennomsnittlig lysstyrkeverdien av det første kammer (rød sirkel) ble overvåket som en funksjon av tid etter åpning av ventilen. (B) Blanding effektivitet knappe ventiler. Målt gjennomsnittlig lysstyrkeverdiene i første runde kammer med shunt drift- angitt som svart og uten blandeventil drift angitt som grønn. (C) Blanding effektivitet test ved forskjellige frekvenser av blandeventildrift. Gjennomsnittlig lysstyrkeverdiene for det første kammeret målt under 5 min.
Whole Genome Amplification på en Chip
Tilpasning av WGA-protokollen for isotermisk DNA-amplifikasjon med phi29 enzymet på en microfluidic enhet ble utført ved hjelp av
E.coli
hele genomet som modell prøve. Først en
E.coli
DNA-oppløsningen (6 ng /ul) ble lastet inn i hovedkanalen, og ved å lukke ventilene på hovedkanalen et nøyaktig volum på 1,2 nl kan bli målt og som er lagt i den første kammere for forsterknings enheter av anordningen, tilsvarende det som finnes i et enkelt kreftcelle mengde DNA (7,2 pg). En bufferoppløsning (1X Tris-EDTA, 0,2% Tween 20) ble presset gjennom det første kammeret til hver forsterkningsenhet for å fylle de tre sirkulære kammere, samtidig som det tas vare ventilene mellom runde og firkantede kamre var skikkelig lukket for å isolere den WGA blanding kamre. WGA blandingen ble deretter innført ved direkte innløpet til alle kvadratiske kammer før reaksjonen. Sideventiler av kvadratkilometer kamre atskilt de enkelte forsterkerenhetene. Etter å ha åpnet isolasjonsventilene mellom sirkulære annet kammer, forsterkning reaksjonsblandingen bestående av phi29 polymerase, tilfeldige heksamer og dNTP på torget kammeret og
E.coli
DNA i de sirkulære kamre begynte å spre og var aktivt blandet med hjelp av knappen ventilene aktiveres ved 1 Hz. Etter 2 timer ble prøvene presset inn i en gel lastepipettespiss plassert ved utløpet av kanalen ved innføring av 5 ul buffer skyve fra innløpet, og innholdet av pipettespissen ble deretter transportert til et PCR-plate. Etter inaktivering av de innsamlede prøvene ved 65 ° C i 10 min, ble qPCR rettet mot den SSU av 16 S rDNA-utført for å kontrollere kvaliteten av det amplifiserte produkt. Disse sanntids qPCR-kurver ved bruk av seksten prøver av 1 pl on-chip amplifisert DNA er presentert i figur 3 (grønne linjer), og de svarer til et gjennomsnitt Cq av 14,77 ± 0,55 (n = 16). For sammenligning ble prøver av fjorten 6 ng /ul DNA-oppløsning i 1,2 nl kammeret analysert uten forsterkning. De som er representert ved de svarte linjer i figur 3, og resulterte i et gjennomsnitt Cq verdi på 23,43 ± 0,02 (n = 14). Større mengder starter DNA-show senere Cq verdi på RT-qPCR og forskjellen på CQ-verdier (ΔCq) kan kvantifisere forskjellen av beløpet mellom prøvene basert på standardkurvene. ΔCq av prøver uten forsterkning og prøver etter amplifisering var tilnærmet 9. Derfor qPCR målretting SSU av 16 S-rRNA-genet som resulterte i en mål-spesifikk DNA-amplifikasjon av 512 ganger (2
ΔCq = 2
9, 100% effektivitet). Lignende eksperimenter utført uten å blande med knappen ventilene resulterte i en gjennomsnittlig Cq verdi på 20,18 ± 2,07 (n = 7), som klart demonstrerer fordelen med aktiv blanding under forsterkningstrinn (fig S2).
Real- tid qPCR kurver rettet mot SSU 16 S rRNA-genet av individuelle innsamlede prøver fra enheten. On-chip amplifiserte prøver er representert som grønne kurver (n = 16), mens kontrollprøver uten forsterkning er representert som sorte kurver (n = 14).
WGA av tumorceller
for å demonstrere gjennomførbarheten av den genetiske karakterisering av individuelle tumorceller i mikrofluid anordningen vi brukte celler fra brystkreftcellelinjen SKBR-3 og MCF-7. Siden mengden av DNA (6-7 pg) inneholdt i en enkelt celle er for lavt for en direkte undersøkelse av dens sammensetning, ble hele genomet amplifisert som beskrevet tidligere. I hovedkanalen morfologien og den immunfenotypen av cellene kan undersøkes, og etter bekreftelse på at cellene passer til våre utvelgelseskriterier enkeltceller kan bli beveget inn i det første kammer av forsterkerenhetene. En cellesuspensjon av SKBR-3 og MCF-7-celler farget med CellTracker Orange ble injisert inn i hovedkanalen, og vi identifiserte cellene til å bli utsatt for ytterligere analyse av deres fluorescens farging og morfologi som størrelse og form. Etter lasting av de enkelte celler i det første kammer i en forsterkningsenhet, ble luft presset for å tømme hovedkanalen. Som multipleksede strømningsledninger er koplet til hovedkanalen hver linje kan åpnes individuelt ved å betjene kombinasjon av ventiler og bare de celler av interesse kan prosesseres videre. [32] bilder fra en SKBR-3-cellen i en forsterkerkammeret er vist i figurene 4A B. Etter at cellen ble beveget inn i forsterkningsenhet en annen, ble det lyseringsbuffer belastet, som vist i figur 1C, måles ved å lukke ventilene, og presset ved hjelp av 1X Tris-EDTA, 0,2% Tween-20 for å blande den med celle . For å få plass til volumet av ventilen mellom det første og andre kammer sirkel ble åpnet og lysering fant sted i de to første kamrene i 10 minutter ved diffusjon. På samme måte ble nøytraliseringen buffer innført og nøytralisering fant sted i de tre sirkel kamre, også i 10 minutter, basert på diffusjon. Betjening av ventiler for blanding var ikke nødvendig for lysering og nøytralisering som diffusjonstiden mellom 2 eller 3 sirkulære kammer var hurtig nok til å gjennomføre reaksjonen. Selve lysering av cellene ble målt ved mikroskopi. WGA Blandingen ble fylt i de firkantede kamre ved hjelp av separate innløp og utløp, og deretter, knappe ventilene ble operert ved 1 Hz i løpet av 2 timer reaksjon for å blande cellelysatet og WGA blandingen, og forsterke DNA. Omtrent 8,27 ng DNA ble oppnådd fra on-chip forsterkning, og, som en enkelt celle inneholder 6-7 pg av DNA, ble mer enn 1000-gangers forsterkning oppnås. Validering av templat-spesifikk DNA ble utført ved å målrette qPCR GAPDH-genet locus som forandringer av GAPDH ikke har blitt rapportert i begge cellelinjer. Brystkreft cellelinjen SKBR-3 og MCF-7 ble anvendt for å demonstrere forskjeller i ErbB2-genamplifikasjon. Figur 4C viser sanntids qPCR kurver av GAPDH for seks individuelle SKBR-3 celler (svarte kurver) og seks individuelle MCF-7 celler (grønne kurver), analysert ved hjelp av to ulike enheter. CQ verdier for GAPDH forsterkning kvantifisert basert på standardkurver var 23,22 ± 0,6. Dette antydet at 33% av den totale mengden av DNA, målt ved qubit assay, var templat-avhengig produkt. I figurene 4D og E FISH bilder etter hybridisering av ErbB2 prober (rød) og cent av kromosom 17 (grønn) av en SKBR-3 og MCF-7 celle vises. Mens 2 eksemplarer av kromosom 17 og 2 eksemplarer av ErbB2 genet ble observert i MCF-7 celle, fire eksemplarer av kromosom 17 og 10 eksemplarer av ErbB2 genet ble funnet i SKBR-3 celle. Deretter ble den samme analysen utføres ved anvendelse av scWGA i vår mikrofluid enhet ved hjelp av ErbB2 spesifikk qPCR, for individuell SKBR-3 og MCF-7 celler. Som vist i figur 4 F, den gjennomsnittlige erbB2 Cq verdi i det amplifiserte DNA av individuelle SKBR-3-celler var 24,95 ± 0,68 (n = 6) mot 29,80 ± 1,96 (n = 5) for de enkelte MCF7-celler, mens den GAPDH Cq verdi for begge cellelinjer var 23,22 ± 0,6 (n = 12) som er vist i figur 4C. Den nedre Cq målte verdien for SKBR-3-celler korrelerer godt med flere kopier av ErbB2-genet observert av FISH (figur 4D), noe som tyder på at våre on-chip WGA fulgt av qPCR for bestemte gener kan benyttes for å fastslå hvorvidt et gen blir amplifisert.
(A) lyse-feltet mikroskopbilde av en enkelt SKBR-3-celle isolert i et mikrofluidkammer, sammen med et fluorescens bilde. (B) fluorescens bilde av en enkelt SKBR-3 cellers farget med CellTracker Orange i mikrofluidkammer. (C og F) qPCR målretting GAPDH og ErbB2 gener i på-chip-amplifisert DNA for kvantifisering og karakterisering ved anvendelse av 1 pl av on-chip amplifiserte prøver (5 pl) fra individ SKBR-3 (n = 6) og MCF-7 (n = 6) som maler. (C) Sanntids qPCR kurver av GAPDH genamplifikasjon. Amplifisert DNA fra enkelt SKBR-3 er representert ved hjelp av sorte kurver, mens det av enkelt MCF-7-celler er representert som grønne kurver. Threshold linjen er i grått. (D og E) Bilder av fluorescens in situ hybridisering (FISH) med ErbB2 prober (rød) og cent av kromosom 17 prober (grønn) for individuell SKBR-3 (D) og MCF-7 (E). Kjerner ble farget med Hoechst (blå) (F) CQ verdier av ErbB2 genet i et boksplott. CQ verdier av ErbB2 ble representert som svarte boksen i SKBR-3 (n = 6) og røde boksen i MCF-7 (n = 5, * Cq av en prøve som mangler på grunn av PCR-feil). . (25% -75%: □, Median verdi: -, middelverdi: □, Min /Max: °, Utvalg av Min /Max: I)
For genetisk analyse som sekvensering eller high-throughput rekke analyse, større mengde DNA (ug) er påkrevd. For å vurdere hensiktsmessigheten av re-forsterkede produkter for gen representasjon, forsterket vi off-chip 1 mL av 5 pl on-chip forsterket DNA fra en enkelt SKBR-3 celle i 17 mL av WGA mix, etterfulgt av qPCR målrette 10 forskjellige loci på hele genomet. For dette velger vi 10 gener som er av interesse for kreftforskning feltet og ligger på forskjellige kromosomer. De forsterkede produkter av disse genene kan gi informasjon om representasjon av start DNA i amplifiserte produkter. 10 ng av 8 re-amplifiserte prøver fra to enhetene (4 prøver per enhet) ble sammenlignet med 10 ng genomisk DNA (gDNA) av SKBR-3. Figur 5A viser koeffisienten av varians (CV,%) av CQ-verdier på 4 prøver i hver enhet framstilt som grønne og svarte stripene for de 10 loci betraktes. Gjennomsnittet av CV for disse 10 gener var 3,8% for den første enheten (grønn) og 2,9% for den andre enheten (svart), og mindre enn 7% variasjon ble observert i any10 gener mellom prøvene i den samme enheten. De ΔCq verdiene for de enkelte 8 prøver, sammenlignet med gDNA ble bestemt for de 10 gener (se figur 5B). De enkelte linjer i figur 5B tilsvarer en omsetning på brikken. ΔCq varierte mellom gener, men alle 10-genene ble amplifisert i 10 ng av scWGA prøver (n = 8). Kopi Numrene på målgener ble estimert basert på qPCR standardkurver av gDNA. De grå søylene i figur 5C representerer kopierings antall individ scWGA i 10 ng DNA mens de svarte stripene representerer kopiantall av genomisk DNA i 10 ng. Den gjennomsnittlige kopiantall for de 10 genene i 10 ng DNA er: 128 kopier av ErbB2, 47 kopier av CCND1, 140 eksemplarer av MYC, 201 eksemplarer av PRMT2, 213 eksemplarer av URB2, 1182 kopier av FGFR1, 42 kopier av P53, 348 kopier av TRAM1, 332 kopier av PAK1 og 513 kopier av GAPDH, som tilsvarer prosentandelene av representasjon av 4,8%, 1,4%, 6,6%, 7,5%, 5,4%, 34,1%, 1,5%, 9,1%, 10,7%, og 15,5%, respektivt. Forsinket CQ verdier og bakgrunn forsterkning resultert i færre kopiantall av gener i forhold til gDNA i 10 ng. Siden det samme resultat ble observert når små kopier av gDNA ble amplifisert, antar vi denne skjevhet er en gjenstand forårsaket av kommersielt sett. I tillegg fluorescens-baserte DNA-kvantifisering, re-amplifikasjon, qPCR prosedyrer, og kvantifisering basert på standardkurver av genomisk DNA kan variere resultatene. Andre ikke-isoterm, og isotermiske DNA-amplifikasjonsmetoder kan implementeres i vårt mikrofluid anordning skjønt reaksjonsvolum og reaksjonstrinnene må være tilpasset og for ikke-isoterm temperaturkontroll må bli innført.
CQ verdiene av 10 ng DNA maler er bestemt av SYBR grønn qPCR målretting 10 gener. (A) Koeffisienten av varians (%) av CQ verdier av 4 prøver amplifiserte på den samme brikken. Prøver på 2 forskjellige enheter angis som grønne og svarte striper. (B) Individuell linje representerer en amplifisert prøve på en brikke fra en enkelt celle. Y-aksen representerer delta-CQ-verdier mellom 10 ng DNA amplifisert på en brikke fra enkelt celle og genomisk DNA. (C) Antatt kopi antall enkeltprøver er representert som grå søyler. (N = 8) Svarte striper representerer estimerte kopiantall av genomisk DNA i 10 ng.
Konklusjoner
Her presenterte vi et mikrofluidanordning for parallell behandling av enkeltceller for å oppnå tilstrekkelige mengder av DNA med hele genomet forsterkning for genetisk analyse. Button-formet membraner ble gjennomført som blandeventiler og sekvensiell aktivering av disse ventilene forbedret blande effektivitet. WGA i en 23,85 us reaksjonsvolum ble optimalisert ved anvendelse av
E. coli
gDNA.
