Abstract
Cellular motilitet er grunnlaget for kreft celle invasjon og metastasering. I tilfelle av brystkreft, er den vanligste typen av kreft blant kvinner, representerer metastase den mest ødeleggende stadium av sykdommen. Den sentrale rolle cellular motilitet i kreftutvikling understreker viktigheten av å forstå de spesifikke mekanismene som er involvert i denne prosessen. I denne sammenheng vil tumorutvikling og metastase bli konsekvensen av et tap eller mangel av mekanismene som styrer cytoskeletal ombygging. Profilin Jeg tilhører en familie av små aktin bindende proteiner som er tenkt å bistå i aktin filament forlengelse ved forkanten av trekkende celler. Tradisjonelt har profilin jeg vært ansett for å være et viktig reguleringselementet for aktin polymerisering og cellemigrasjon. Expression of profilin jeg er nedregulert i bryst og diverse andre kreftceller. I MDA-MB-231 celler, en brystkreft cellelinje, ytterligere hemming av profilin jeg uttrykk fremmer hypermotilitet og metastatisk spredning, et funn som står i kontrast til den foreslåtte rolle profilin i å forbedre polymerisasjon. I denne rapporten har vi tatt fordel av fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP) av GFP-aktin å kvantifisere og sammenligne aktin dynamikk i forkant nivå i både kreft og ikke-kreft cellemodeller. Våre resultater tyder på at (i) et høyt nivå av aktin dynamikk (dvs. en stor mobil fraksjon av aktin filamenter og en rask omsetning) er en vanlig egenskap ved enkelte kreftceller; (Ii) aktin polymerisasjon viser en høy grad av uavhengighet fra tilstedeværelsen av ekstracellulære vekstfaktorer; og (iii) resultatene underbygge også rollen profilin jeg i å regulere aktin polymerisasjon, som heve intracellulære nivåer av profilin jeg redusert mobil brøkdel forholdet mellom aktin filamenter og bremset deres reaksjonshastigheten; Videre økte profilin nivåer førte også til redusert individuell celle hastighet og retnings
Citation. Lorente G, Syriani E, Morales M (2014) aktin filamenter i forkant av kreftceller blir preget av en høy Mobile Fraction og Omsetning Regulering av profilin I. PLoS ONE 9 (1): e85817. doi: 10,1371 /journal.pone.0085817
Redaktør: Yulia Komarova, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: May 30, 2013; Godkjent: 03.12.2013; Publisert: 17 januar 2014
Copyright: © 2014 Lorente et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det spanske departementet for forskning (SAF2010-16024, BFU 2012-17537, ONCE 2010 og 2011) og Fundación Rioja midler. GL var fellesskap innehaveren av Universidad de Barcelona. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cellulær motilitet er en kompleks prosess som forekommer i alle celletyper [1]. Migrasjon over et flatt underlag innebærer utstikket av en tynn membran mantelen, lamellen, fylt med et intrikat aktin forgrenet nettverk. Kraften for membranen fremspringet og forlengelsen er forsynt med kontrollert og begrenset aktin polymerisering ved den nærmeste kant av membranen, den såkalte forkanten. Under forlengelse, er actinfilamenter polarisert med sine mothaker ende (eller i tillegg til slutt) peker mot membranen [2], som er presset av filamentene, tvinger forlengelsen av lamellen. Lamellen forlengelse, derfor er det som bestemmer retningen, og bevegelse av cellen [3]. Lukk regulering av cellemigrasjon er avgjørende for utvikling, sårheling og immunresponser, mens avvikende og ukontrollert cellemotilitet er et gjennomgående trekk i flere typer kreftceller.
En rekke studier viser at profilin I (PfnI) , en vesentlig actin-bindende protein, kan spille en viktig regulatorisk rolle i prosessen med cellulær motilitet. Dermed
Dictyostelium amøber
mutanter for PfnI utstillings motilitet og cytokinese defekter [4], som betyr «chickadee», null mutant for homolog av PfnI i
Drosophila product: [5]. Likeledes stanse PfnI i humane vaskulære endotelceller induserer hemming av motilitet og defekter i membran protrusion [6]. Videre har PfnI knockout blitt vist å resultere i tidlig embryonisk celledød hos mus [7].
Av de medlemmene av familien profilin (PfnI til PFN IV), er PfnI den mest uttrykt. Det ble opprinnelig identifisert som en G-aktin sequestering protein [8], og siden da har det blitt tildelt flere andre funksjoner, inkludert atom cytoplasma trafikk av aktin ved binding til exportin 6 [9], mRNA spleising [10], samt vesikulær endocytose ved å samhandle med clathrin og valosin holdig protein [11]. I dag er det allment akseptert at dens viktigste rolle er å fremme aktin polymerisasjon av kata utveksling av ADP til ATP på G-aktin monomer [12]. Videre er strukturen av PfnI inneholder en poly-bindende domene (PLP) [13], [14], og to phosphoinositide bindingsseter [15] – [17]. I kraft av det tidligere, samhandler PfnI med et vell av prolin-rike proteiner. Blant annet det binder direkte til Ena /VASP [18], N-WASP [19], WAVE [20] og aktin kimdannende familie av formins [21]. Alle disse proteinene rekruttere PfnI til de soner av dynamisk remodellering aktin, som for eksempel den fremre kant av den lamellipodia. Den intracellulære lokalisering av PfnI bekrefter sin tilknytning til områder med intens aktin polymerisasjon, og dermed PfnI er funnet i PTk2 microfilaments av pungdyr fibroblaster [22], igle nevronale vekst kjegler [23], Bovine trabekelverket lameller [24], utstående områder av rotte fibroblast [25], og i nærheten av den fremrykkende kant av endoteliale celler [26].
et grunnleggende trekk ved tumorcelleinvasjon og metastase er en økt bevegelighet og spredningsevne av cellene. Interessant, ekspresjonsnivåene av PfnI er nedregulert i flere invasiv brystkreft, bukspyttkjertel og leverkreft celletyper [27] – [31]. Ytterligere reduksjon av PfnI nivåer ved å kneble sine uttrykk resulterer i enda høyere motilitet [29], [32] og tumorprogresjon [33]. Det motsatte er også tilfelle: en økning i PfnI nivåer reduserer celle invasivitet og motilitet, fulgt av en opp-regulering av stress-fibre og fokal adhesjon [27], [29]. Videre undertrykker PfnI overekspresjon både utenfor livmoren og orthotopic tumorigenicity og mikrometastaser [32]. For tumor suppresjon aktivitet oppnås via denne mekanismen, både aktin og phosphoinositide bindingsseter i PfnI må være funksjonell [30], [32], [34]. Videre har PfnI overekspresjon blitt rapportert å opp-regulere PTEN uttrykk, derfor indirekte undertrykke Akt aktivitet ved å kontrollere phosphoinositide produksjon [35].
phosphoinositide binding av PfnI er viktigere enn tidligere antatt. Den Ena /VASP familie av proteiner uncaps de frie piggete ender av aktin, slik at deres progressive forlengelse [36]. Lamellipodin (LPD) binder Ena /VASP gjennom en EVH1 domene, og spesielt samhandle med PI (3,4) P
2. På denne måten er membranen målet for LPD i stand til å rekruttere Ena /VASP til membranen. En serie nye funn tyder på at PfnI begrenser tilgjengelig pool av PI (3,4) P
2. På denne måten vil PfnI negativt regulere phosphoinositide nivåer på membranen, og indirekte begrenser LPD-Ena /VASP målretting til membran [37]. I MDA-MB-231 celler, regulerer PfnI utarming LPD opphopning, indirekte øke Ena /VASP konsentrasjon i forkant, og dermed fremme aktin polymerisasjon og rapporterte hypermotilitet etter PfnI uttømming [38]. Men de underliggende konsekvensene av disse PfnI undertrykkende handlinger på actin omsetningen fortsatt ikke klarlagt. Eksperimentelle bevis indikerer at en funksjonell aktin-bindende domene av PfnI er avgjørende for å redusere kreftcelle motilitet og tumor fenotype [29], [30]. Gitt mengde eksperimentelle bevis som støtter betydningen av PfnI i å regulere aktin polymerisasjon og cellemigrasjon, det er rart hvordan lave nivåer av PfnI er assosiert med økt cellular motilitet, og hvordan aktin treadmilling kan reguleres.
I denne rapporten, omsetningen av lamellipodial aktin ble undersøkt med fluorescens Recovery Etter fotobleking (FRAP) [39]. Våre resultater tyder på at cytoskjelettet ved den fremre kant av kreftceller er mye mer dynamisk enn den av ikke-tumorceller. Videre øker PfnI nivåer i kreftceller fører til redusert aktin treadmilling og nedsatt cellulær motilitet. Til slutt fant vi også bevis som tyder på at aktin treadmilling i kreftceller er ufølsom for ekstracellulært regulering av vekstfaktorer.
Materialer og metoder
Cellekulturer
MDA-MB-231 humane brysttumorcellelinjer ble dyrket i DMEM F12-medium og Ham 10% FBS (Sigma). Den MCF10A human bryst epitelial cellelinje ble dyrket i følgende kulturmedium: HEPES 15 mM, hesteserum 5%, EGF 20 ng /ml hydrokortison 0,5 mg /ml, koleratoksin 100 ng /ml humant insulin 10 mg /ml, 50 mg /ml penicillin og 50 U /ml streptomycin i DMEM-F12 HAM (alle levert av Sigma). Den A549 humane lunge tumorcellelinje, MEF mus embryonale fibroblaster og HeLa human cervix tumorcellelinje ble dyrket i DMEM, supplert med 50 mg /ml penicillin, 50 U /ml streptomycin og 10% FBS (Sigma Aldrich). MDA-MB-231 celler ble kjøpt fra ATTC (USA, Ref HTB-26.). MCF10A celler, passasje 8, var en generøs gave fra LP Saucedo (CNIO, Madrid, Spania). A549 og HeLa-celler, passasje 10, var en generøs gave skjema H. Aguilar (ICO, Barcelona, Spania). MEF celler, passasje 6, var sjenerøs gave fra A. Angulo (IDIBAPS, Barcelona).
Immunocytochemistry og bildeanalyse
I korthet, for immunocytokjemiske analyser, cellekulturer ble skylt i PBS og faste for 15 min i 4% paraformaldehyde /PBS. Objektglassene ble deretter vasket tre ganger i PBS og inkuberes i 30 minutter i blokkeringsløsning (2% geiteserum, 2% serum albumin, 0,1% Triton X-100 i PBS). Antistoffer ble fortynnet til passende konsentrasjon i blokkeringsløsning. Objektglassene ble inkubert i 60 minutter i antistoffløsningen. Prøvene ble deretter vasket tre ganger og inkubert i 30 minutter med de passende fluorescens-konjugerte sekundære antistoffer. Til slutt, Dekkglass ble vasket fem ganger og montert med Mowiol. Fluorescens bilder ble oppnådd med et invertert mikroskop (Olympus IX70), ved hjelp av en TILL monokromator som lyskilde. Bildene ble tatt med et vedlagt avkjølt CCD-kamera (Orca II-ER, Hamamatsu)
Følgende antistoffer ble brukt. Anti-vinculin monoklonalt antistoff (. Chemicon, ref MAB3574) og anti-profilin polyklonale og monoklonale antistoffer (Cell Signaling, ref. 3237 og Synaptic system, ref. 308 011). Sekundære antistoffer, Oregon grønn Phalloidin og Phalloidin-Alexa Fluor® 594 ble kjøpt fra Invitrogen. Bilde J analyse programvare (National Institutes of Health) ble brukt til å kvantifisere spredning og fokus vedheft.
målinger Cell området og focal voksn kvantifisering
Kort, opp til 10000 celler ble sådd på 12 mm Dekk i 24 brønner plater. Etter at den tilsvarende behandling ble cellene fiksert i 4% PFA og farget med Oregon-grønn Phalloidin eller Phalloidin-Alexa Fluor® 594. Til tross for mangelen av stress fibre, Phalloidin farging muliggjorde måling av hele celleoverflaten. Celleområdet ble kvantifisert ved digital terskel-analyse ved hjelp av Image J programvare.
Rekombinant protein
I noen eksperimenter, de intracellulære nivåene av profilin ble modifisert ved anvendelse av en membran som er gjennomtrengelig versjon av PfnI [24], [ ,,,0],40]. PTD4-profilin (21 kDa) ble generert ved å fusjonere en transduksjon domene, PTD4 [41], til profilin. Det rekombinante protein ble uttrykt i
E. Coli
og renset som tidligere beskrevet [40]. Kort, kompetent
E. Coli
BL21-plys transformert med pRSETA-PTD4-pFN I vektoren ble indusert ved tilsetning av 1 mM IPTG (Sigma) ved 37 ° C i 6 timer. Bakterielle pelleter ble lysated ved frysing og tining protokoll i flytende N
2, fulgt av ultralydbehandling på is i nærvær av DNAse og en protein-inhibitor cocktail (Sigma). Cellulære lysater ble løst ved sentrifugering, og det oppløselige protein ble isolert ved anvendelse av Ni-NTA harpiks-pakkede kolonner (Quiagen). Protein vask og eluering ble utført med høye konsentrasjoner av imidazol. Bufferbytte og konsentrasjonen av det rekombinante protein ble utført ved sentrifugering i Amicon ultra-15 10 000 MWCO sentrifugal- filtre (Millipore), ved å erstatte elueringen media med PBS. Proteiner ble frosset i flytende N
2 og lagret ved -80 ° C i 10-15% glycerol-PBS. Bakterier og proteiner ble håndtert i henhold til sikkerhetsforskriftene for Laboratory personell som arbeider med Trans-Aktivere Transduksjon (TAT) Protein Transduksjon domener.
Transfeksjon
Transfeksjon ble utført ved hjelp av Efectene Transfeksjon Reagens kit fra Qiagen etter produsentens anvisninger. Flere ekspresjonsvektorer ble brukt: CMV-GFP, CMV-GFP-aktin og CMV-MembraneCherry vennlig levert av Dr. F Tebar (University of Barcelona, Spania), og CMV-GFP-PfnI vennlig levert av Dr. Hitomi Mimuro (Universitetet i Tokyo, Japan).
stabile cellelinjer
Stabile cellelinjer ble generert fra MDA-MB-231 kreftcellelinje transfektert med plasmider som uttrykker GFP-aktin, GFP-PfnI, MembraneCherry-PfnI og GFP under en CMV-promoter kontroll (alt arbeid ble utført med celle passasjer fra 6 til 8). Transfeksjoner ble utført med Efectene Transfection Reagent (Qiagen), som beskrevet i protokollen. Transfekterte celler ble utvalgt med tre ukers inkubasjon på gentamicin 1 mg /ml (Sigma). FACS ble brukt til å skille høy- og lav-uttrykker GFP-aktin celler. Buffercellesortering oppløsning anvendt besto av 5 mM EDTA, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% FBS (varmeinaktivert) og PBS uten Ca
2 + /Mg
2 +. Relative nivåer av rekombinant protein ekspresjon ble analysert ved hjelp av Western blot.
Cell motilitet assay
MDA-MB-231-celler ble sådd ut på 6-brønners plater (Nunc) ved 40% konfluens og merket med Draq5, en langt-rødt fluorescerende fargestoff celle-permeabel DNA, i 5 minutter (Cell Signaling Technology). Kultur platene ble montert på scenen av en Leica DMITCS SL laserskanning confocal spektral mikroskop (Leica Microheidelberg, GmbH) festet til en Leica DMIRE2 invertert mikroskop utstyrt med en inkubasjonstid system med temperatur og CO
2 kontroll. Alle forsøkene ble utført ved 35 ° C og 5% CO
2. For visualisering av Draq5 farget kjerner, ble bildene anskaffet ved hjelp av en 40 × objektiv (NA 1,32) og spent med en 633 nm laser linje. Det konfokale pinhole ble innstilt på 4,94 Airy-enheter for å minimere tap av fluorescens. Bildene ble tatt hvert 5. minutt i 8 timer. Bilde J analyse programvare (NIH) ble brukt for hastighet og retnings kvantifisering. Retnings data ble presentert som den lineære avstanden (End) dividert med totale avstanden lengde i løpet av 8 timer, som beskrevet av Pankov et al., 2005 [42].
fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP)
FRAP eksperimenter ble utført ved hjelp av følgende protocol:10 enkelt skanner (pre-bleke) ble kjøpt på 300 ms intervaller, etterfulgt av 20 bleike skanner ved full laser makt ved hjelp av et firkantet område på 24 mikrometer
2. I løpet av post-blekeperioden ble 30-60 skanninger kjøpt til 300 ms intervaller, etterfulgt av 100 bilder tatt ved 5 s intervaller, denne tidsperioden var nødvendig for at fluorescensen til å nå likevekt. For å løse den innledende rask gjenvinning, ble noen eksperimenter utført ved anvendelse av Leica fly oppfangningsmodus; bleking ble utført i løpet av X fly frem skanning ved hjelp av 100% laser makt, og i løpet bakover skanning, ble fluorescens lese med laser intensitet satt til bilde verdier (185 ms bilder intervall), mens post-bleke bilder (30-60 s) ble ervervet på det samme tidsintervall. For å unngå betydelig fotobleking ble eksitasjon intensitet dempes til ~ 5% av laser makt under bildet oppkjøpet. Fluorescensgjenvinning ble kvantifisert ved hjelp av Image Processing Leica Confocal Software. Bakgrunnsfluorescens ble målt i et tilfeldig felt utenfor cellen og subtrahert fra alle målingene. Fluorescens signalet målt i regionen av interesse (ROI), ble korrigert for oppkjøp fotobleking og svingninger i hele fluorescens etter en dobbel normalisering metode, fastsatt som følger: Irel = Det /I0 * T0 /Tt, der det er den gjennomsnittlige intensiteten i ROI ved tiden t; I0 er den gjennomsnittlige intensiteten av ROI under pre-blekeperioden; T0 er intensiteten i løpet av pre-bleking av ikke-bleket område (normalt, en nabocelle eller atom region); og Tt er intensiteten ved tiden t av dette området. Innføringen av korreksjonsfaktoren (T0 /Tt) står for mulige små variasjoner i total fluorescens-intensitet forårsaket av blekemiddel i seg selv, og gir et mer nøyaktig estimat av den målte fluorescens i ROI [43], [44].
netto~~POS=TRUNC fluorescensgjenvinning (mobil fraksjon; Mf) målt i regionen av interesse ble bestemt som: Mf = avverge-Fpost /Fpre-Fpost, hvor avverge er ROI bety intensitet ved steady-state; Fpost representerer ROI intensitet etter fotobleking; og Fpre er den midlere pre-bleking ROI intensitet. Gjenvinningen tidskonstant (τ) ble oppnådd ved kurvetilpasning ved bruk av Prism programvare (GraphPad), forutsatt at en en-eksponentiell modell (bunn, deretter økende til toppen).
Intracellulære mengder av rekombinant profilin
Beregning av intracellulære mengder PTD4-PfnI ble gjort av Western blot densitometry. I korthet ble cellene som vokser i 25 cm
2 kolber ble vasket fem ganger, trypsinert, og grundig vasket ved sentrifugering for å redusere den ekstracellulære proteinkonsentrasjon. Cellelysater ble kjørt i en SDS-polyakrylamidgel. Utvannet mengder renset rekombinant PTD4-PfnI, ble lagt i de samme brønnene. Begge proteiner, endogene profilin og PTD4-PfnI ble lett preges av deres molekylvekter og ble probet med et monoklonalt antistoff mot profilin I.
statistikker og
Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM og ble analysert ved hjelp av Prism programvare (versjon 4.0 og 6.0, Graphpad). Dataene ble analysert ved hjelp av t-test når det passer. Betydning nivåer ble notert som følger:. * P 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,001
Resultater
Actin dynamikken i kreftceller er preget av en høy mobil fraksjon og kort restitusjonstid
for å kunne studere dynamikken i aktin cytoskjelettet ved den økende forkanten av tumorceller, har vi valgt MDA-MB-231 brystkreftcellelinje. Denne cellelinje bærer
KRAS
G13D og
BRAF
G464V mutasjoner [45], og det er spesielt egnet for pre-kliniske studier, som det er svært aggressive, både
in vitro Hotell og
in vivo product: [46]. MDA-MB-231 celler i kultur utstillings en kontinuerlig og høy motilitet lamell forlengelse, presentere mange volanger langs membranen, noe som gjør denne celletypen en utmerket kandidat til å studere omsetningen av lamellipodial aktin ved hjelp av FRAP. For å lette de bildedannende eksperimenter hadde vi tidligere genererte et stabilt transfektert MDA-MB-231 cellelinje som uttrykker GFP-aktin konstruksjon. Det relative nivå av GFP-aktin-ekspresjon ble undersøkt ved hjelp av Western-blot og sammenlignet med GFP uttrykt cellelinje som en kontroll, i gjennomsnitt, ekspresjonen av det fluorescens-protein resulterte i 5,2% av den totale profilin (data ikke vist).
Den karakteristiske forkant av MDA-MB-231 celler er en 2 mikrometer bred struktur beriket i GFP-aktin og lett identifiseres ved Phalloidin-Alexa 594 farging (figur 1A). Et rektangulært område som er stort nok til å dekke hele den ledende kant (4 um bred og 6 um lang) ble photobleached [39] (figur 1B). Som vist på figur 1C, MDA-MB-231-celler viste en gjenvinning av fluorescensen i nærheten av en 70% etter 15 sek. Gjenopprettingskinetikken ble beskrevet av en to-komponent eksponensiell kurve som viser at en initiell rask komponent etterfulgt av en andre langsommere komponent. Den første komponenten hadde en restitusjonstid på nærmere 500 ms, ligner den oppnådde verdi når oppgangen ble undersøkt i monomere GFP-transfekterte celler (tau 100-200 ms; Figur S1). Dette er mest sannsynlig på grunn av den raske spredningen av GFP-aktin monomerer. Den initiale hurtige komponenten ble bare detektert når en rask anskaffelse protokoll ble anvendt, og er derfor oversett i de fleste av forsøkene. Den andre langsommere komponenten ble drevet av aktin polymerisasjon [47], [48], som ble bekreftet ved tilsetning av 90 nM cytokalasin D (en reversibel barbed-endeblokker) til kulturmediet fem minutter før den FRAP eksperimentet. I nærvær av cytokalasin D, GFP-actin fluorescens mislyktes i å gjenvinne (figur 1C), som bekrefter at aktin polymerisasjon driver utvinning av fluorescens. I gjennomsnitt, mobil brøkdel målt 30 sekunder etter tidspunktet for maksimal bleking ble anslått til å være 71,5 ± 4%; denne andre komponenten var utstyrt med en en-eksponentiell kurve med en midlere tau-verdi på 4 ± 0,3 sekunder (rød stiplet linje i figur 1C).
A) MDA-MB-231-celler transfektert med GFP-aktin, dobbel farget med Phalloidin-Alexa 594 (a). Actin fluorescens akkumulerer hovedsakelig i forkant området. Scale bar fem mikrometer. Legg merke til at MDA-MB-231-celler ha en iøynefallende mangel av actin spennings fibre. Rigth: Detaljert seksjon av den fremre kanten, som viser akkumulering av GFP-aktin (b) og aktin filamenter (c). Scale bar 2 mikrometer. B) Representant bilderammer fra sekvensielle FRAP eksperimenter. Før FRAP (pre-bleking), etter å ha høy intensitet lasereksponering (bleking), under den innledende fase av gjenvinnings (5 e) og ved enden av den stabile del av kurven (30 s). Den blekede ledende kantområdet er angitt med hvite boksen (4 x 6 mm). C) Eksempel på en FRAP eksperiment; fluorescens bedres til en midlere verdi på 71,5 ± 4% etter en monoeksponensiell tidsforløp (passform avbildet med en rød stiplet linje). Inkubasjon med cytokalasin D (90 nM) hemmer fluorescens recovery (CytD). D) Sammendrag grafisk fremstilling av de midlere mobile fraksjoner fra MDA-MB-231-celler. Stabile transfekterte celler (s, n = 44), høy-GFP-aktin expressers (høy, n = 10), lav GFP-aktin expressers (lav, n = 10) og transient transfektert celler (231t, n = 6). Gjennomsnittsverdier av mobile brøkdel ikke viser statistiske forskjeller under noen eksperimentelle forhold sammenlignet med stabilt transfekterte cellelinje (t-test).
Vi spurte om de observerte mobile brøkverdier var avhengig av GFP-aktin uttrykk nivåer. For å oppnå dette, analyserte vi for gjenoppretting nivåer for tre forskjellige betingelser: celler med høy eller lav GFP-aktin-ekspresjonsnivåer (populasjoner sortert ved strømningscytometri fra den genererte stabil GFP-aktin-cellelinje) og etter en forbigående transfeksjon i 48 timer. Resultatene, oppsummert i figur 1D, indikerte at den gjennomsnittlige mobil fraksjonen var lik for alle tre forholdene, støtter hypotesen om at aktin utvinningsgraden var ikke avhengig av intracellulær GFP-aktin konsentrasjon.
For å undersøke om dette området av aktin utvinning er spesifikk for MDA-MB-231-celler, eller er et felles karakteristisk for de fleste kreftformer av epitelisk opprinnelse, ble to ytterligere kreftcellelinjer undersøkt. Således aktin dynamikk ved den fremre kant av HeLa og A549-celler, et cervix og en human lunge adenokarsinom henholdsvis [49], [50], ble undersøkt etter transient transfeksjon med GFP-aktin (figur 2A). Begge cellelinjer viste en stor mobil brøkdel etter 30 sekunder, med middelverdier ligner på de av MDA-MB-231 celler (verdier fra 62 til 64%, figur 2B) og utvinning ganger varierende innenfor et lignende område, fra 2 til 5 sekunder (Figur 2C). Forresten, A549 celler viste den raskeste utvinning, med et tau verdi nær 2 sekunder (Figur 2C).
A) To eksempler på individuell fluorescens utvinning av GFP-aktin hentet fra A549 og HeLa celler. B) Bar graf over den gjennomsnittlige mobil brøkdel sammenligne MDA-MB-231, HeLa og A549 celler. De beregnede middelverdier var 62,4 ± 4,2% for HeLa (n = 12) og 64,7 ± 4,3% for A549 (n = 10). Ingen statistisk signifikante forskjeller ble funnet sammenlignet med MDA-MB-231 celler. C) Gjennomsnittsverdier av tau eksponensiell verdier hentet fra gjenopprettings kurvene montering. MDA-MB-231 celler gjenopprettes med et tau verdi på 4,1 ± 0,6 s, mens HeLa-celler vises et tau på 5,5 ± 1,7 s. A549 celler viste den raskeste utvinning av alle, med et tau på 1,9 ± 0,35 s, som var statistisk forskjellig fra MDA-MB-231 restitusjonstid (p 0,005, t-test).
Da MDA-MB-231 brystkreftceller har en epitelial opprinnelse, vi også sammenlignet med deres aktin dynamikk med den for en ikke-kreftcellelinje av MCF10A, en human epitelial brystcellelinje transfektert med GFP-aktin. Resultatene (oppsummert i figur 3) indikerte at cytoskjelettet av MCF10A hadde en lavere aktin mobil fraksjon enn den for motparten kreftcellelinje (50% versus 70%: Figur 3A-B). Gjenopprettingstiden var også forskjellig, med en gjennomsnittlig verdi nær 7 sekunder. Lignende resultater ble oppnådd når fibroblastceller av et ikke-beslektet opprinnelse ble undersøkt. Murine embryonale Fibroblaster (MEFs) hadde en mobil brøkdel verdi nær 40%, med en restitusjonstid på rundt 8 sekunder (figur 3A-C). I sammendrag, de eksperimentelle data indikerer at kreftceller testet viser en mye mer dynamisk cytoskjelettet enn ikke-cancerceller.
A) To eksempler på individuelle aktin gjenvinning av kurvene på den fremre kant etter fotobleking av GFP-aktin fra MCF10A (human) og MEF (murine) celler. Gjenvinningen av MDA-MB-231-celler er plottet som en rød stiplet linje for sammenligning. B) Sammenfattet data for mobile fraksjoner av MEFs (39 ± 4,2%, n = 18) og MCF10A (51,7 ± 1%, n = 6) sammenlignet med MDA-MB-231-tumorceller. Hver celle type viser statistiske forskjeller sammenlignet med MDA-MB-231 mobile brøkdel recovery (p 0,005, t-test). De mobile fraksjoner av MCF10A og MEF celler var ikke statistisk forskjellig (t-test). C) utvinning ganger i begge MEFs (tau = 7,5 ± 1,6 s) og MCF10A celler (tau = 6,5 ± 0,4 s) var statistisk annerledes enn MDA-MB-231 celler (p 0,005 og p 0,05, Student t -test).
MDA-MB-231 aktin dynamikk er uavhengige av tilstedeværelsen av ekstracellulære vekstfaktorer
Ervervet uavhengighet fra ekstracellulære vekstfaktor-signalering er en typisk egenskap ved brystkreftceller [51]. I ikke-kreftcellelinjer, er cellemotilitet og polarisering ledet av en lokal opphopning av PIP
3; hovedsakelig drevet av PI3K aktivering eller lokal inte aktivering. Faktisk er avvikende PI3K signale et tilbakevendende tema i både initiering og progresjon av en rekke kreftformer, herunder brystkreft [45]. Vi neste ønsket å teste avhengighet av actin dynamikk ved den fremre kant på den ekstracellulære nærvær av vekstfaktorer. For dette formål studerte vi aktin dynamikken i kreft og ikke-cancercellelinjer etter en 16-timers serumsulteperiode. Resultatene viser at MDA-MB-231 mobil fraksjon var upåvirket av serumet utsultingstilstand (figur 4A), med en midlere mobile fraksjon verdi på 58 ± 3%, og en midlere tau med utvinning av 6,6 sekunder, som ikke var statistisk forskjellig fra verdiene oppnådd i nærvær av serum (figur 4B og D). En umiddelbar følge av fraværet av vekstfaktorer er reduksjon av PIP
3 signalering ved membrannivå. For å bekrefte innvirkningen av PIP
3 på aktin modulasjon, ble aktin dynamikk ved den fremre kant analysert 30 minutter etter å ha behandlet cellene med PI3K-inhibitor LY294002 (20 uM). Den mobile fraksjon viste en middelverdi på 57 ± 2%, og fluorescensen utvinnes med en tidskonstant på 4,2 sekunder, som ikke var statistisk forskjellig fra den i henhold til kontroll eller serumsulte betingelser (figur 4B og D).
A) Eksempel på fluorescens restitusjon etter FRAP etter kontroll forhold (10% FBS, FBS tomt) og serum sult i 16 timer (Sultende tomt). B) Oppsummering av data for midlere mobile fraksjonen i MDA-MB-231-celler. Den midlere mobile fraksjon i henhold FBS betingelser var 62 ± 5,2% (n = 6), sammenlignet med 58 ± 3% etter 16 timer med sult og 57 ± 2% (n = 6) etter PI3K inhibering med LY294002 (n = 6) . Det bør legges merke til at vi har tatt nye kontrollcellene, som vokser i parallell og analysert på den samme dag og under samme betingelser; Derfor har den gjennomsnittlige mobile fraksjonen en litt annen verdi at den totale midlere gjennomsnitt (70% mot 65%). C) Den mobile fraksjon av ikke-cancerøse celler under serumfattige betingelser ble redusert til 27 ± 5,2% (n = 10) i mus fibroblast og til 28 ± 2,4% i MCF10A (n = 6), (p 0,05; Students t-test). D) Recovery tid oppsummering grafen. MDA-MB-231 vokser i FBS tendens til å vise raskere dynamikk (4.14 ± 0,6 s) ikke statistisk signifikante fra den sultet celler (6,6 ± 1,7 s). Bruken av LY294002, en kjemisk inhibitor av PI3K, påvirket ikke restitusjonstid (4,2 ± 1,0 s). E) I motsetning til dette påvirket serum sult gjenvinningstiden av ikke-kreftceller, øke tidskonstanten fra 8,2 ± 0,2 s til 9,5 ± 0,1 s for MEFs (p 0,05) og 6,5 ± 0,4 s til 8,0 ± 1,2 s for MCF10A cellene (p 0,05, t-test)
i motsetning til dette, mobil fraksjon av MCF10A-celler ble redusert under serumsulte betingelser (middelverdi på 28 ± 2,4% i forhold til 51% i henhold til kontrollforhold. Figur 4C). Ligner avhengighet av ekstracellulært serum ble observert i MEFs, med mobi brøkdel falt fra en verdi nær 40% til en verdi rundt 27% (Figur 4C). Recovery tid ble også berørt, i MCF10A celler økte fra 6,5 ± 0,4 sekunder til 8,0 ± 1,2 sekunder, mens i MEF celler økte fra 8,2 ± 0,2 til 9,5 ± 0,1 sekunder (Figur 4E).
Fra resultatene oppnådd i denne delen, konkluderer vi med at i MDA-MB-231-celler, både aktin mobile fraksjon og tidsforløpet for utvinning er upåvirket ved nærværet av ekstracellulære vekstfaktorer og membran regulering av PIP
3 nivåer.
PfnI oppregulering øker cellestørrelsen og antallet av fettsyrer
flere aktinbinding proteiner er deregulert i kreftcellelinjer [28], [52], blant dem profilin (PfnI), som ble foreslått som en tumor suppressor protein [27], [30]. PfnI ekspresjonsnivåer er betydelig nedregulert i forskjellige typer av adenokarsinomceller.
