Abstract
Bakgrunn
tetra-primer forsterkning ildfast mutasjon system PCR (T-ARMS-PCR) er en rask og økonomisk måte å analysere SNP-er, krever bare PCR forsterkning og påfølgende elektroforese for bestemmelse av genotyper. For å bedre gjennomstrømning og effektivitet av T-ARMS-PCR, kombinert vi T-ARMS-PCR med en kimære primer-baserte temperaturbryter PCR (TSP) strategi, og brukes kapillær elektroforese (CE) for amplicon separasjon og identifikasjon. Vi vurderte denne prosessen i den samtidige genotyping av fire brystkreft-og to risikorelaterte SNPs livmorhalskreft.
Metoder
Hele 24 T-ARMS-PCR primere, hver 5′ merket med en universal-sekvens og et par universelle primere, ble slått sammen for å forsterke de 12 mål-allelene av 6 SNP’er i 186 kontroll kvinnelige blodprøver. Direkte sekvensering av alle prøvene ble også utført for å vurdere nøyaktigheten av denne metoden.
Resultater
Av de 186 prøvene, så mange som 11 amplikonene kan produseres i en enkelt PCR og adskilt med CE . Genotyping resultatene av multipleks T-ARMS-PCR var samstemte med direkte sekvensering av alle prøvene.
Konklusjoner
Denne romanen multiplex T-ARMS-PCR-metoden er det første rapporterte metoden tillater en til genotype seks SNP’er i en enkelt reaksjon med ingen etter-PCR behandling annet enn elektroforese. Denne metoden er pålitelig, rask og enkel å utføre
Citation. Zhang C, Liu Y, Ring BZ, Nie K, Yang M, Wang M, et al. (2013) A Novel Multiplex Tetra-Primer ARMS-PCR for samtidig Genotyping av Six enkeltnukleotidpolymorfi Associated med kvinnelige Kreft. PLoS ONE 8 (4): e62126. doi: 10,1371 /journal.pone.0062126
Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 5 juli 2012; Godkjent: 19 mars 2013; Publisert: 17 april 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Kina Mega-Project for smittsomme sykdommer (2011ZX10004-001, 2012ZX10004-215 og 2013ZX10004-202). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
rollen til enkelt-nukleotid polymorfismer (SNP-er) for å bidra til den variabilitet mellom individer i følsomhet mot kreft [1], tumorvekst og metastase hastigheten [2] – [4], samt i behandlingseffekt og Bivirknings reaksjoner, har blitt godt anerkjent [5], [6]. Blant de mange metoder som er utviklet for å genotype SNPs har tetra-primer forsterkning ildfast mutasjon system PCR (T-ARMS-PCR) viste seg å være rask, enkel og økonomisk [7] – [11]. Gjennom kombinasjon av to ytre primere og to allel-spesifikk indre primere, krever genotyping bare en enkelt PCR etterfulgt av elektroforese separering [8]. Multiplex PCR ble innlemmet i T-ARMS-PCR, ved hjelp av åtte primere i en PCR, og er i stand til samtidig å påvise to mutasjoner [9]. Separat ble kimære-primer-baserte multipleks PCR, noe som gir en universell 5 «tag til sekvensen spesifikke primere for flere mål, har blitt rapportert å forbedre gjennomstrømningen og effektiviteten av polymerasekjedereaksjonen [12]. Med sin høye effektivitet ved påvisning av et titalls forskjellige PCR-produktene på en reaksjon, har bruken av kimære primer PCR ofte blitt rapportert for anvendelse i mRNA kvantifisering [13] -. [15] og deteksjon av patogen [16], [17]
brystkreft og livmorhalskreft har blitt den mest diagnostisert kreft og de viktigste årsakene til kreft dødsfall blant kvinner [18]. Nyere studier viser at somatiske varianter i følsomhet regioner er forbundet med sannsynligheten for forekomst av bryst og gynekologisk cancer [19] – [23]. SNP’er ble valgt for dette studium på grunnlag av rapporterte forbindelser med disse kreftformer og som har en rimelig høy prevalens i den asiatiske populasjonen. Fire lav penetrans varianter for prediksjon av risiko for brystkreft ble valgt. SNPs rs4784227 [24] og rs3803662 [25] befinner seg i transkripsjonsfaktor TOX3; rs1219648 ligger innenfor FGFR2, noe som bidrar til cellevekst, invasivitet, motilitet, og angiogenese [26]; rs889312 [27] er innenfor MAP3K1, som er knyttet til cellulær respons overfor mitogener. To varianter assosiert med risiko for livmorhals eller eggstokkreft ble valgt. SNP rs750749 [21] er et polymorfismer i CD83, som er involvert i immungjenkjennelse og antigenpresentasjon; rs749292 i CYP19A1, som spiller en nøkkelrolle i østrogenbiosyntese [22], [23].
I denne artikkelen beskriver vi en roman multiplex T-ARMS-PCR som åpner for samtidig genotyping av 6 SNPs (rs4784227 , rs3803662, rs1219648, rs889312, rs750749 og rs749292) forbundet med bryst og gynekologisk cancer i et enkelt rør ved hjelp av 24 kimære primere og et par universelle primere bruken av kimære primere og en temperaturbryter PCR (TSP) strategi ble kombinert med T- ARMS-PCR for å optimalisere forsterkningsparametere og forbedre gjennomstrømningen av SNP genotyping. Kombinasjonen av disse forskjellige teknikkene genotyping demonstrerer for første gang muligheten av tetra-primer ARMS-PCR for å sikkert og effektivt detektere seks SNP’er i en enkelt reaksjon. Siden mer enn 10 PCR produkter med ulike lengder må identifiseres, er kapillær elektroforese (CE) brukes i stedet for agarose gelelektroforese.
Materialer og metoder
Totalt 186 blodprøver fra friske kinesiske kvinnelige frivillige som ble overvåket for potensiell hypertensjon var samlet på samfunnet helsestasjoner i Wuhan, Kina i løpet av 2011 for denne studien. Alle aspekter av studien ble utført i samsvar med de nasjonale etiske regler og godkjent av Institutional Review styrene i Senter for Disease Control and Prevention 70 av Kina, samt etikkomiteen av Huazhong University of Science and Technology. Deltakerne fikk «skriftlig informert samtykke» av studiens formål og deres rett til å holde informasjon konfidensielt. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne og deres foresatte.
Genomisk DNA ble ekstrahert fra 0,2 ml frisk perifere blodprøver ved bruk av veiviseren
® Genomisk DNA Purification Kit (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Ekstraherte DNA-prøver hadde en endelig konsentrasjon spenner 55-365 ng /mL.
For å overvinne begrensninger av standard multiplex T ARMS-PCR-metoder, den foreslåtte metoden ble optimalisert med tanke på grunning design, PCR sykkelforholdene og i utnyttelsen av kimære primere og TSP strategi, som beskrevet i våre tidligere rapporter i påvisning av influensavirus og menneskelig hånd fot og munn forbundet patogener [16], [28]. Hele 24 kimære primere som hver består av en gen-spesifikk sekvens med en universell kode-sekvens ved 5′-enden ble anvendt. De genspesifikke partier av primere ble utformet i henhold til kravene i T-ARMS-PCR. Spesifisiteten til allel-spesifikke primere er gitt ved identiteten av terminalen 3 «nukleotid med enten villtype eller mutant allel, blir spesifisiteten økes ved innføring av en overlagt mistilpasning i stilling -1 fra den 3»-enden. Et par av universelle primere og seks sett med T-ARMS-PCR kimære primere ble brukt til forsterkning. Detaljerte primer sekvenser og arbeids konsentrasjoner for hver SNP er oppført i Tabell 1.
Genotyping av de analyserte polymorfismer ble utført av multipleks PCR forsterkning og fragmentanalyse. Seks sett med T-ARMS-PCR-primere for amplifikasjon av tolv fragmenter av forskjellig størrelse ble samlet i en enkelt 20 pl reaksjonsvolum som også inneholdt 10 pl konsentrat-blanding av Qiagen Multiplex PCR kit, 50-100 ng genomisk DNA, og optimalisert konsentrasjoner av hver primer (se tabell 1). Multiplex PCR ble utført ved hjelp Bioer lifepro termosykler. En optimalisert temperaturbryter PCR (TSP) protokoll, som benytter fire forskjellige varmebehandlingstemperaturen ble utført som følger: innledende denatureringstrinn på 95 ° C i 10 minutter, 3 sykluser med 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 45 s, 10 sykluser med 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s, og 72 ° C i 45 s, 20 sykluser av 95 ° C i 30 s, 68 ° C i 30 s, og 72 ° C i 45 s, 15 sykluser av 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s, og 72 ° C i 45 s etterfulgt av en endelig forlengelse syklus ved 72 ° C i 10 minutter, og deretter avkjølt til 4 ° C.
multipleks PCR produktene ble separert ved QIAxcel
® DNA høy oppløsning gel patron (Qiagen) på QIAxcel system (Qiagen). DNA størrelse markør av 25-450 bp (Qiagen) og oppretting Marker 15 bp /500 bp (Qiagen) ble brukt i hver QIAxcel kjører og størrelsen av produktene ble bestemt ved bruk av ScreenGel programvare (Qiagen). Fordi hver av de amplikonene var av en forskjellig lengde, ble lene detektert på grunnlag av de mønstre av topp størrelser.
I alt 186 prøver ble også sekvensert parallelt med en ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems , USA) i henhold til BigDye oppsigelse versjon 3.1-protokollen i Invitrogen Corporation (Shanghai, Kina) for å bekrefte multiplekse T-ARMS-PCR resultater ved hjelp av de ytre primere som er oppført i tabell 1 for hver SNP.
resultater
i alt 186 prøver ble skrevet med en multiplex T-ARMS-PCR-analyse og også skrevet parallelt med direkte sekvensering for å vurdere nøyaktigheten og effektiviteten av analysen. Alle PCR produktene ble godt løst og størrelse av CE og ScreenGel at enkel identifisering av ulike genotyper. To av de 186 prøver hadde elleve unike amplikonene, noe som betyr at slike pasienter har bare en homogen SNP blant de seks testede loci. Elektroferogrammet og gel bilde av disse to prøver (fig. 1) viser at CE på QIAXEL kan tydelig skilles så mange som 11 fragmenter i en prøve. Nøyaktigheten av multiple PCR-analyse av en prøve ble bekreftet ved direkte sekvensering (fig. 2). Fragmentstørrelser bestemmes av QIAXEL basert CE er oppført i tabell 2. Les lengder var 2-10 bp større enn forventet seg, men dette forstyrrer ikke allel besluttsomhet. Heterozygoter og homozygote ble utvetydig tildelt fra CE-profiler. Ingen kryssreaksjon ble observert. Genotypene scoret fra multiplex analysen var i 100% samsvar med direkte sekvense
A:. Gel bilde av de 4 prøvene. B. Gel bilde og elektroferogrammet av prøven i lane1. 11 band som spenner 202-356 bp ble observert, noe som indikerer 5 heterogene og 1 homogene SNPs ble identifisert C: Gel bilde og elektroferogrammet av prøven i lane2. Det ble observert en annen kombinasjon av 5 heterogen og 1 homogene SNPs.
genotypen distribusjon og allelfrekvenser for hver SNP er oppført i tabell 3. allelet rapportert å være assosiert med risiko av kreftforekomst er uthevet. Den observerte hyppigheten av genotyper i denne studien var generelt lik som målt ved HapMap for en Han kinesisk befolkning (HCB). Hvis HapMap frekvensene ble brukt til å forutsi forventet genotype teller i denne studien, så en sammenligning av denne populasjonen til HapMap HCB befolkningen viste betydelig divergens for rs4784227 i Tox3 og rs749292 i CYP19A1 henholdsvis hvor risiko og ikke-risiko alleler,, er til stede i en betydelig høyere andel enn tidligere rapportert for en kinesisk befolkning. Det er sannsynlig at det er mangfold i Han befolkning som ennå ikke er tatt til fange av de HapMap studier. En supplerende tabell (tabell S1) er gitt for å vise den eksakte sett av alleler for alle 6 SNPs som finnes i hver enkelt prøve for videre henvisning.
Diskusjoner
metoder som lar lavkost , rask og pålitelig SNP besluttsomhet tiltrekker økende interesse i en alder av personlig medisin. Det er allment anerkjent at bruk av informasjon fra flere SNP genotyper gir en mer nøyaktig risikovurdering enn det spådd av en enkelt risiko allel [29], derfor metoder som kan identifisere flere genotyper som MALDI-TOF massespektrometri [30], [31 ] og hybridisering baserte [32] – [34] eller enzymbasert [35] metoder har blitt benyttet. Men disse metodene enten krever kostbart spesialutstyr, som for eksempel massespektrometer, eller tidkrevende post-PCR drift.
Tetra-primer ARMS-PCR-metoden har blitt en av de mest brukte metodene for SNP genotyping. Det krever bare vanlig molekylærbiologi utstyr og eliminerer behovet for hybridisering eller flere enzymatiske reaksjoner. Selv triplex og quadruplex PCR metoder har blitt rapportert, det er begrenset bruk av multiplex T-ARMS-PCR i genotyping på grunn av to viktige begrensninger. For det første, sannsynligheten for å finne primere med matchede smeltetemperaturer drastisk fall ved forsøk på å kombinere påvisning av flere SNP i en enkelt reaksjon. For det andre, den resulterende pool av amplikonene krever tilstrekkelig lengde mellomrom mellom nabobånd i elektroforese for å lette separasjonen. Ved å kombinere T-ARMS-PCR med en kimære primer-baserte temperaturbryter PCR strategi vi i stor grad omgå disse begrensningene. Vår metode demonstrerer for første gang muligheten av tetra-primer ARMS-PCR for å detektere seks SNP’er i en enkelt reaksjon.
påliteligheten av fremgangsmåten er illustrert ved å skrive 186 kliniske blodprøver parallelt med direkte sekvense , og en 100% overensstemmelse mellom de to metodene ble oppnådd. Dette proof-of-concept studie etablerer således en rask, reproduserbar, og kostnadseffektiv metode for påvisning av multipleks SNPs, siden CE ved QIAXCEL er i stand til å løse amplikonene med så lite som 5 bp størrelse forskjell, den minste størrelsen forskjell i denne testen var 10 bp. Som lese lengdene i denne analysen har et standardavvik 0,8 til 1,3 (tabell 2), bestemmelse av allelet er således ikke forstyrret.
Bruken av kimære primere og bifasisk temperaturbryter i utglødningsprosessen avtar forskjellen i forsterkning effektivitet blant amplikonene. I løpet av de første PCR-sykluser, blir amplifikasjon utført av allel-spesifikke primere kimære. I senere stadier av PCR-amplifikasjon blir hovedsakelig utført ved universelle primere, slik at alle mål i denne multipleks PCR system er forsterket på en objektiv måte med et enkelt par av universelle primere. Dette reduserer forekomsten av forspent og delvis forsterkning, minimaliserer ikke-spesifikke reaksjoner, og reduserer behovet for optimaliseringen av hver enkelt PCR-analyse.
For å vurdere de feil som oppstår ved bruk av multi-band electrophoregrams å skille amplikonene , lese lengden av hvert bånd ble sammenlignet med de teoretiske lengder beregnet fra primer-oppstilling (tabell 2). Ingen overlapping i lese lengde området mellom hvilke som helst to av de amplikonene ble observert, i tillegg, er det ingen overlapping av 99% konfidensintervaller av den observerte gjennomsnittlige leselengde. Det er bemerkelsesverdig at båndintensitetene kan være gjenstand for en rekke faktorer, inkludert genomisk DNA kvalitet og PCR reagenser kvalitet; Vi har funnet ut at 50-100 ng /mL DNA er optimalt å gi tilstrekkelig klare og lyse band med minimal bakgrunns (data ikke vist). I tillegg, i motsetning til de fleste andre rapporterte T-ARMS-PCR-metoder, en behandlet mistilpasning i stilling -1 fra 3′-terminus ble innlemmet i både indre primere og var tilstrekkelig spesifikke for differensiell deteksjon av to alleler for hver SNP. På grunn av begrensningen av størrelsen å skjelne mellom PCR-produkter, kan PCR-primer konstruksjon begrenses til en viss grad, noe som gjør flere T-ARMS-PCR vanskelig å skrive disse SNP’er som ligger nærmere enn 20 bp til hverandre.
to distinkte fordeler med den fler ARMS-PCR-metoden er den korte forsøkstid og de lave kostnader, selv for analysering av et stort antall prøver. Den foreslåtte metoden, bare involverer konvensjonell PCR med CE, kan utføres innen 3,5 timer med minimal praktisk innsats. Etter ekstraksjon av genomisk DNA, kan de etterfølgende trinnene blir gjennomført i et enkelt reaksjonsrør, slik at for klar analyse av flere prøver i et enkelt løp for high-throughput screening. Denne analysen bruker bare standard PCR reagenser og elektroforese kassetter; kostnadene i denne studien var bare to US $ for samtidig påvisning av seks SNPs per prøve.
Så vidt vi vet, er den første til å oppdage seks SNPs i en enkelt reaksjon ved hjelp av tetra-primer den foreslåtte metoden armer- PCR. Romanen multiplex tetra-primer ARMS-PCR metode utviklet i denne studien har betydelig potensial til å bli mye brukt i både kommersielle og klinisk innstillinger for screening av flere SNPs.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Alleler av 6 SNPs av hver enkelt prøve i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062126.s001 plakater (docx)
