Abstract
11β-hydroksysteroid dehydrogenase (11beta-HSD) modulerer mineralocorticoid reseptor trans av glukokortikoider og regulere tilgang til glukokortikoid reseptoren. Isozyme 11beta-HSD2 selektivt uttrykt i mineralkortikoid målet vev og sin aktivitet reduseres i ulike sykdomstilstander med unormal natrium oppbevaring og hypertensjon, inkludert den tilsynelatende mineralocorticoid overflødig. Som 50% av pasienter med essensiell hypertensjon er insulinresistent og hyperinsulinemiske, hypotese vi at insulin nedregulerer den 11beta-HSD2 aktivitet. I den foreliggende undersøkelse viser vi at insulin redusert 11beta-HSD2-aktivitet i kreft tykktarm cellelinjer (HCT116, SW620 og HT-29) på transkripsjonsnivået, i en tid og doseavhengig måte. Den downregulation var reversibel og krevde ny proteinsyntesen. Pathway analyse ved anvendelse av mRNA profilering viste at insulinbehandling modifisert ekspresjonen av transkripsjonsfaktor familie C /EBP (CCAAT /enhancer-bindende proteiner), men også for glykolyse relaterte enzymer. Western blot og sanntids PCR bekreftet en oppregulering av C /EBP beta isoformene (LAP og LIP) med en mer markert økning i den hemmende isoform LIP. EMSA og reporter gen-analyser viste rollen C /EBP beta isoformer i HSD11B2 genuttrykk regulering. I tillegg sekresjon av laktat, et biprodukt av glykolyse, ble vist å mediere insulinavhengig HSD11B2 nedregulering. Oppsummert viser vi at insulin nedregulerer HSD11B2 gjennom økt LIP uttrykk og utvidet laktat sekresjon. Slike mekanismer er av interesse og mulig betydning for natrium reabsorpsjon i tykktarmen
Citation. Andrieu T, Fustier P, Alikhani-Koupaei R, Ignatova ID, Guettinger A, Frey FJ, et al. (2014) insulin, CCAAT /Enhancer bindende proteiner og laktat Reguler Human 11β-hydroksysteroiddehydrogenase Type 2 Gene Expression i tykktarmskreft cellelinjer. PLoS ONE 9 (8): e105354. doi: 10,1371 /journal.pone.0105354
Redaktør: Jaap A. Joles, University Medical Center Utrecht, Nederland
mottatt: May 24, 2013; Godkjent: 23 juli 2014; Publisert: 18 august 2014
Copyright: © 2014 Andrieu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Sveitsiske nasjonal Stiftelsen for industriell forskning Nr. 3100-122135, 3100 til 61505,00, 3100A0-102153 /1 og 3100A0-138670 (BMF FJF). Nasjonale Senter for kompetanse i forskning (NCCR), TransCure (FJF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mineralocorticoid reseptor (MR) er avgjørende for nedsatt natrium håndtering i epitelvev som tykktarm og nyre og for blodtrykkskontroll hos mennesker. Den fysiologiske liganden av MR er aldosteron [1]. En annen adrenal steroid, kortisol, oppviser en lignende affinitet og transaktivering potensialet for MR som aldosteron. Serumkonsentrasjoner av kortisol er 100 til 1000 ganger høyere enn aldosteron. Den mekanisme som tillater aldosteron å være den foretrukne ligand for MR
in vivo
, til tross for høyere konsentrasjoner av kortisol er et enzym som inaktiverer kortisol, spesielt i MR-uttrykkende celler [2]. Dette enzym, 11β-hydroksysteroid-dehydrogenase type 2 (11beta-HSD2) kodes av den HSD11B2 genet og omdanner biologisk aktive kortisol til kortison, et steroid med ubetydelig affinitet og aktivering potensialet for MR [3]. Således, en redusert aktivitet av 11beta-HSD2 bevirker cortisol-mediert MR aktiveringen, som fører til renal natriumretensjon, undertrykkelse av renin og en salt-sensitive blodtrykksøkning [4], [5].
Mange pasienter med type 2 diabetes har lav renin-aktivitet i plasma, og er saltsensitive [6] – [8]. Videre har vi nylig observerte en sammenslutning av salt-følsomhet og redusert aktivitet av 11beta-HSD2 i avkom av type 2 diabetikere [9]. Det er således rimelig å spekulere at insulin nedregulerer HSD11B2, og ved denne mekanisme, bevirker kortisol-mediert nyre- eller colonic natriumretensjon med påfølgende renin undertrykkelse.
Det har vist seg at det insulin og hyperinsulinemi regulere familien transkripsjonsfaktorer CCAAT /enhancer-bindende proteiner (C /EBP) [10], [11], og at medlemmer av denne familien styre transkripsjonen av HSD11B1 [12] – [14]. Analysen av arrangøren av HSD11B2 genet ved transkripsjonsfaktor database (TRANSFAC) program avdekket flere mulige bindingssteder for C /EBP-programmer i posisjonene -4362 bp, -1985 bp, -177 bp og på -198 bp fra transkripsjonsstart nettstedet av menneskelig HSD11B2 genet. Derfor hypotese vi at insulin nedregulerer HSD11B2 gjennom C /EBP-programmer.
Materiale og metode
Reagenser og utstyr
Cell kultur materialet var fra Becton Dickinson Labware (Basel, Sveits) og Corning (Bodenheim, Tyskland). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og Mc Coy tallet ble kjøpt fra Sigma Chemicals (Buchs, Sveits). Føtalt bovint serum (FBS) var fra Biochrom AG (Berlin, Tyskland). Insulin, cycloheximide (CHX), PD098059, Sodium dichloroacetate (DCA), Sodium L-laktat og 5,6-dichlorobenzimidazole 1β-D-ribofuranosid (DRB) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Fluka AG, Buchs, Sveits). De følgende cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA): human colon carcinoma cellelinje HT-29 (deponeringsnummer: HTB-38), SW-620 (CCL-227), HCT116 (CCL-247) og JEG-3- (HTB-36). Akt Inhibitor VIII var fra Calbiochem (Merck, Zug, Sveits). Adenosin 5′-trifosfat [gamma-
32P] ([gamma
32P] ATP) var fra Perkin Elmer (Maanstraat, Nederland).
cellekulturer
HCT116, SW-620 og HT-29 ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS, 2 mmol /l glutamat, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble holdt ved 37 ° C i fuktig 5% CO2-95% luft. Alle cellelinjer ble platet ut i cellekulturskåler og dyrket i DMEM 10% FBS til konfluens. Celler ble inkubert i DMEM supplert med 0,3% FBS i løpet av insulin og DCA behandling. Cellene ble behandlet 48 timer med DCA og 24 timer med insulin. Celler ble inkubert med 10% FBS i løpet av laktat behandling etter 24 timer synkronisering i DMEM 0,3% FBS.
RNA-fremstilling og ekspresjonsnivået
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen AG, Basel , Sveits) i henhold til produsentens protokoll. Total RNA (1 pg) ble anvendt for syntese av første kjede cDNA ved å bruke Improm-II revers transkriptase (RT) i RT-buffer (Promega Catalys AG, Wallisellen, Sveits) i henhold til produsentens protokoll. Ekspresjon av spesifikke mRNA ble bestemt ved kvantitativ sanntids RT-PCR (QRT-PCR) på en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Multipleks PCR ble utført i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems, Foster City, CA). Analyser-on-Demand (Gene Expression analyse Mix) var eukaryote 18S rRNA endogen kontroll (4310893E), HSD11B2 (Hs00388669_m1), CCAAT /enhancer bindende protein (C /EBP) alfa (Hs00269972_s1), C /EBP beta (Hs00270923_s1) og C /EBP delta (Hs00270931_s1). Relativ genekspresjon ble bestemt ved hjelp av sammenlignende CT (terskelsyklus) metode, som består av normalisering av antall mål-genkopier i en endogen referanse-genet (18S rRNA), betegnet som kalibrator. Nivået av HSD11B2, C /EBP a, C /EBP beta og C /EBP delta-mRNA-ekspresjon av hver av de behandlede celler ble normalisert til resultatet oppnådd fra ubehandlede celler. Mengden av target normalisert til 18S rRNA endogene henvisning er gitt ved følgende formel: 2
-ΔΔCT. For å bekrefte reproduserbarheten av mRNA bestemmelse, ble et minimum på 3 uavhengige totalt RNA ekstraksjoner utført. Hver revers-transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse ble analysert i triplikat og uttrykt som middel +/- SD.
Måling av 11beta-HSD2-aktivitet
Cellene ble dyrket i 6- brønns plater ved en tetthet på 0,5 x 10
6 celler /brønn. Etter behandling ble kulturmediet fjernet, og cellene ble inkubert i 45 min i 1 ml medium inneholdende 2 uCi [1,2,6,7-
3H] Cortisol (60-80Ci /mmol, Amersham, Buckinghamshire, UK) i 6-brønns plater. Etter inkubering ble reaksjonen stanset, og steroidene ble ekstrahert ved tilsetning av tre volumer etylacetat. Etter sentrifugering ble den organiske fasen fjernet og avdampet ved romtemperatur. Residuet ble rekonstituert i 30 ul stoppløsning (2 mM kortisol og 2 mM kortison i metanol). Ti mikroliter ble brukt på silika-belagte TLC-plater (G-25, UV254, MACHEREY-NAGEL, Oensingen, Sveits) og løst ved hjelp av kloroform: etanol (09:01). Steroider ble visualisert under ultrafiolett lys og ble skrapet inn i scintillasjonsvæske. Radioaktiviteten ble målt ved anvendelse av en Packard 2000CA Tri-Carb flytende Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL). Forsøkene ble utført under ikke-substrat-begrensende betingelser, hvor forbrenningen var alltid mindre enn 40%. Spesifikk aktivitet ble uttrykt som picomol (pmol) per mikrogram protein per time. De eksperimentelle resultatene ble beregnet ved å uttrykke omregningskursene for kortisol til Kortison i nærvær av insulin, som en prosentandel av det i den tilsvarende kontroll i fravær av insulin [15].
Western blot analyse
Protein utvinning og Western blot analyser ble utført som rapportert tidligere [16]. Kort fortalt ble atom ekstrakter isolert med CelLytic Nuclear Extraction protokollen (Sigma Chemicals, Buchs, Sveits). For Western blot-analyse, ble totalt protein (100 ug) og nukleære ekstrakter (60 ug) lastet på en denaturerende 10% polyakrylamidgel. Membranen ble blokkert over natten og inkubert med kanin polyklonale antistoff for 11beta-HSD2 (H-145,1:500), C /EBP alfa (sc-61X, 1:5000), C /EBP beta (sc-150X, 1: 5000), β-aktin (sc-1616R, 1:500) eller HDAC1 (sc-7872, 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Vasket nitrocellulose membraner ble inkubert med en geit anti-kanin IgG pepperrot peroksidase konjugat (sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) og utviklet ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) reagens (Amersham, Buckinghamshire, UK). Densitometri av eksponerte filmene ble utført, og nivået av protein uttrykt i vilkårlige enheter.
For deteksjon av IGF1 og insulin reseptorer celler var enten ubehandlet eller behandlet med 100 nM insulin i 24 timer og lysert i RIPA-buffer inneholdende 1 mM natriumortovanadat, 2 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, 1 mM fenylmetansulfonylfluorid. Lysatene ble inkubert med enten IGFR eller insulinreseptoren antistoff (3027, 3025, cellesignalisering) ved 4 ° C over natten. Om morgenen ble prøvene inkubert med Protein A /G Plus Agarose (Santa Cruz Biotechnology) i 1 time ved 40 ° C. Kulene ble vasket, kokt i SDS ladningsbuffer og proteinene ble separert ved SDS-PAGE.
De novo proteinsyntese
HT-29 celler ble dyrket som beskrevet ovenfor og forbehandlet med proteinsyntesen (eller translasjonsbevegelse forlengelse) inhibitor, CHX (10 pM) i 1 time før tilsetning av insulin (10
-7 M). Ved slutten av den 24 timers behandling, ble cellene høstet for RNA isolering og QRT-PCR-analyse.
HSD11B2 mRNA-stabilitet
HT-29-celler ble dyrket som beskrevet ovenfor og behandlet med insulin ( 10
-7 M) i 12 timer. Transkripsjon ble stoppet med DRB (25 mm) og cellene ble høstet ved diskrete ganger (0-12 t) for RNA isolering og QRT-PCR-analyse.
Små interfering RNA (siRNA) eksperimenter
HT-29 celler ble transient transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) etter produsentens anbefalinger. Transfeksjon Blandingen ble fjernet etter 24 timers inkubering. Cellene ble videre inkubert under normale vekstbetingelser i ytterligere 24 timer før mRNA-ekstraksjon. SiRNA duplekser for C /EBP alfa- eller C /EBP beta (Qiagen AG, Basel, Sveits) og en negativ kontroll siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble anvendt for transfeksjon ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM.
Elektro mobilitet shift analyse (EMSA) og kjerneekstrakt forberedelse
Rundt fem millioner av heftende celler ble frittliggende med 3 ml PBS på is og ble pelletert i 5 min ved 900 g. Pelletene ble lagret ved -80 ° C inntil proteinekstraksjon. Nuclear ekstrakt forberedelse og EMSA ble utført som tidligere beskrevet [17], [18]. Proteinutbyttet ble bestemt ved Bradford-metoden. EMSA prober ble generert av annealing komplementære enkelt-strandet oligonukleotider og merket med [gamma
32P] ATP og T4 polynukleotidkinase. Spesifikk binding ble konkurrert med umerkede oligonukleotider hvilken sekvens er anerkjent av C /EBP faktorer ved et 100X-molart overskudd (5′-tgcagattgcgcaatctgca-3 «, de nucleotide motiver av interesse er dristig-faced). Bindingsreaksjoner ble utført i 10 pl buffer [20 mM HEPES, pH 7,5; 35 mM NaCl; 60 mM KCl; 0,01% NP 40; 2 mM DTT; 0,1 mg /ml BSA; 4% Ficoll] inneholdende 1,75 pmol av merket probe, 4 ug kjerneproteiner og 1 ug poly (di-dC). Blandingene ble inkubert ved 4 ° C i 20 minutter i nærvær eller fravær av umerket konkurrent. DNA-proteinkomplekser ble separert på en 5% polyakrylamidgel i 0,5 x Tris-borat-EDTA-buffer i 90 minutter ved 140 V. Gelene ble tørket i 2 timer ved 80 ° C og analysert på en PhosphoImager Cyclone (Packard).
Chromatin immunoprecipitation
chip analyser ble utført i henhold til instruksjon av Upstate bioteknologi Inc som tidligere rapportert [18]. Rensede DNA-fragmenter ble amplifisert med PCR-primere for å detektere et 210 bp fragment inneholdende -177C /EBP, -198C /EBP områder innenfor den HSD11B2 promoter (forover: 5′-GCAACTTTGGGACTTTGTTCCGGC-3 «, omvendt: 5′-AGAGGGACACTCGCTTTCTCTGCT-3» ).
QRT-PCR analyse ved hjelp av menneskelig diabetes RT
2 Profiler PCR Arrays
RT
2 Profiler PCR Arrays PAHS-30C (SA biovitenskap, MD, USA) var designet for å analysere 84 gener knyttet til menneskelig insulin signalveien. RT-PCR ble utført ved anvendelse av et ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). HT-29 celler ble behandlet i 24 timer med insulin (10
-7 M). Total RNA (1 pg) ble anvendt som templat for å syntetisere cDNA med RT
2 First Strand kit (SABiosciences). PCR-syklus tilstand var som følger: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 sek. Ved slutten av PCR sykkel trinn, ble data for hver prøve som viste en smeltekurve. ABI SDS-programvare (Applied Biosystems) ble benyttet for å bestemme en kritisk terskel (Ct), som var syklusen tall hvor den lineære fase for hver prøve krysset terskelnivå. Beta-2-mikroglobulin ble brukt som husholdningsgenet. Ekspresjonen av HSD11B2 for de 3 forsøkene involverte ble overvåket i parallell av sanntids-PCR som bekrefter betydelig nedregulering av insulin. Records ble avsatt i GEO data base med tiltredelse antall GSE51677.
Transient transfeksjon og reporter gen analysen
transfections ble utført med Fugene HD transfeksjon reagens (Roche, Rotkreuz, Sveits) med 3 ml løsning for 1 mg plasmid. Vektoren pCMV-HRL (
Renilla reniformis luciferase
) (Promega Catalys AG, Wallisellen, Sveits) ble anvendt for å normalisere transfeksjonseffektivitet. Konstruksjonen p4.5 kb-HSD11B2 var en generøs gave fra de. K. Yang [19]. Den p0.2 kb-HSD11B2 plasmidkonstruksjonen ble tidligere beskrevet [18]. For ekspresjon av transkripsjonsfaktorer, forskjellige mengder av vektorene pCMV-LIP og pCMV-LAP, en generøs gave fra U. Schibler [20], ble tilsatt til DNA-blandingen. Etter 6 timer ble transfeksjonen ble mediet erstattet med normal vekstmedium i 18 timer. Deretter ble cellene lysert og luciferase aktiviteter ble oppdaget med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega Catalys AG, Ellen, Sveits) og MediatorsPhL luminometer (meklere Diagnostic Systems, Wien, Østerrike). Ildflue luciferase-aktiviteten ble uttrykt i forhold til Renilla luciferase for å ta hensyn til forskjeller i transfeksjonseffektivitet. Når en CMV-LacZ kontroll vektor ble transfektert, Dual-Lys-system (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble anvendt for å bestemme luciferase-aktivitet. Transfections ble bekreftet av flere uavhengige forsøk.
Seterettet mutagenese
HSD11B2 promoter mutanter ble generert i p4.5 kb-HSD11B2 og p0.2 kb-HSD11B2 konstruerer ved hjelp QuikChange II XL nettstedet -rettet mutagenese kit (Stratagene, Basel, Sveits). De følgende primere ble anvendt: 5′-GTGGAACTTGAGAGCTCGAGCAGTTCCCTTCACCTCTGG-3 «og 5′-CCAGAGGTGAAGGGAACTGCTCGAGCTCTCAAGTTCCAC-3′ for -4362 C /EBP og 5»-CTCGAGCGCAGCCGCTCCAGGACTTTGTTCCGGCTTTTTC-3 «og 5′-GAAAAAGCCGGAACAAAGTCCTGGAGCGGCTGCGCTCGAG- 3» til -198 C /EBP. Understreket og fet skrift bokstaver representerer mutert baser.
Bioinformatikk og statistikk
Data er uttrykt som gjennomsnitt +/- SD av triplikate prøver av et representativt eksperiment gjentas minst tre ganger. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student
t
test eller ANOVA analyser og ble etterfulgt av en kontrast test med Tukey feilbeskyttelse. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
p
0,05, *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,001. Transkripsjonsfaktor bindingsseter ble analysert med kampprogrammet.
Resultater
Vedvarende insulinbehandling reduserer 11beta-HSD2 aktivitet og HSD11B2 genuttrykk i kolon kreftcellelinjer
Regulering av enzymet aktivitet av insulin ble undersøkt i HSD11B2 uttrykke [16] – [18], [21] human colonic cellelinjer (HCT116, SW620 og HT-29) (figur 1A.). Celler ble inkubert i 24 timer med insulin (10
-11 M-10
-7 M) i cellekulturmedium inneholdende 0,3% FBS. Insulin forårsaket en reaksjon nedgang dose i 11beta-HSD2 aktivitet i alle testede colonic cellelinjer med en betydelig reduksjon på 10
-9 M i HCT116 cellelinje (
p
0,05). Denne effekten ble ikke begrenset til colonic cellelinjer ettersom lignende resultater ble oppnådd med HSD11B2 uttrykker [19] JEG-3-celler (fig. S1). På grunn av den robuste respons (≈30% reduksjon), vi tegnes videre de molekylære mekanismene i HT-29 celler.
(
A
) 11beta-HSD2 aktivitet ble målt ved
3H kortisol /kortison konvertering analyse i colonic cellelinjer 24 timer etter inkubasjon med insulin (10
-11 til 10
-7 M). Aktiviteten målt for HCT116 i fravær av insulin ble satt som 100%. (
B
) Dose-respons-effekt av insulin (10
-9 til 10
-5 M) på HSD11B2 mRNA (grå søyler) og aktivitet (kurve) i HT-29 celler behandlet for 24 timer. (
C
) Tidsavhengig effekt av insulin (10
-7 M) på HSD11B2 mRNA (grå søyler) og aktivitet (kurve) i HT-29 celler. (
D
) Tidsavhengig effekt av insulin (10
-7 M) på 11beta-HSD2 protein nivå.
Vedvarende insulinbehandling minsker HSD11B2 genekspresjon, aktivitet og protein i HT-29-celler i en dose- og tidsavhengig måte
neste bekreftet om insulin-redusert 11beta-HSD2-aktivitet sammenfaller med dets gen og protein ekspresjon (fig. 1A). Økende konsentrasjoner av insulin i området fra 10
-9-10
-5 M forårsaket en konsentrasjonsavhengig reduksjon i HSD11B2 mRNA-nivåer 24 timer etter behandlingen (fig. 1B). En maksimal effekt ble observert ved konsentrasjoner på 10
-7 M, hvor HSD11B2 mRNA ble redusert med 50% (
p
0,05) (figur 1B.); og aktiviteten med 35% (
p
0,05) (figur 1B.). Deretter undersøkte vi den tidsavhengige regulerende virkning av insulin på HSD11B2 genekspresjon, aktivitet og proteinnivå. Som vist på figur 1C, er en tidsavhengig reduksjon i 11beta-HSD2-aktivitet observert med en betydelig reduksjon av 12 timer etter behandlingen (
p
0,05). Interessant HSD11B2 mRNA økte i løpet av første 10 timer og redusert etterpå. Etter 16 timer ble mRNA nådd minimalt nivå og holdt seg lav inntil 48 timer (
p
0,05) (Fig. 1C). I avtalen ble HSD11B2 protein redusert med 18 timer og 24 timer av insulinbehandling (Fig. 1 D).
nedregulering av HSD11B2 var reversibel ved å fjerne insulin fra mediet 24 timer etter inkubasjon. Faktisk, 48 timer etter fjerning, HSD11B2 mRNA-nivåer i kontroll og behandlet insulin forholdene var lignende (fig. 2A). Deretter HT-29 celler ble behandlet 24 timer med insulin i fravær og nærvær av proteinsynteseinhibitor, cykloheksimid (CHX). Effekten av insulin for å redusere HSD11B2 mRNA ble opphevet i nærvær av CHX, noe som indikerer at
de novo proteinsyntese
var nødvendig (Fig. 2B). For å bestemme hvorvidt insulin reduserer HSD11B2 mRNA-stabilitet, vurderte vi halveringstiden av mRNA HSD11B2 ved en standard mRNA-forfall analyse ved bruk av 25 uM DRB, en inhibitor for mRNA-syntese. Som vist i figur 2C, ble insulin ikke endre halveringstiden til mRNA HSD11B2.
(
A
) 11beta-HSD2-aktivitet ble målt i HT-29-celler i nærvær (svarte søyler) og fravær (hvite søyler) av 10
-7 M insulin i 24 timer. Insulin effekten var reversibel ved utvasking med PBS 24 timer eller 48 timer med oppfølging (skraverte søyler). (
B
) HSD11B2 ekspresjon ble bestemt ved QRT-PCR i HT-29 forbehandlet med proteinsynteseinhibitor CHX (10 pM) i 1 time og behandlet med insulin (10
-7 M) i 24 h. Hvert datapunkt er uttrykt som en prosent av kontrollverdien. (
C
) HT-29-celler ble forbehandlet med (fylte sirkler) eller uten (fylt rombe) insulin (10
-7 M) i 12 timer. Cellene ble deretter behandlet med 25 pM av mRNA-syntese inhibitor DRB, uten eller med insulin (10
-7 M) (definert som tid null). Ved de angitte tidspunkter deretter ble totalt RNA isolert, og det steady state nivået av mRNA HSD11B2 vurdert. Hvert datapunkt er uttrykt som en prosentandel av den maksimale bestemmes ved tid null.
Insulin pathway analyse
For å kunne forstå den molekylære mekanismen som insulin nedregulerer HSD11B2 vi forsøkte for å karakterisere insulin banen i HT-29. Western blot eksperimenter demonstrerte ekspresjon og aktivering av IGF-1 (IGFI-R) og insulin reseptorer (IR) i en tid og doseavhengig måte (fig. 3 A, B). Begge reseptorer er fosforylert i løpet av de første 10 min ved insulinbehandling, mens IR var mer følsomme enn IGFI-R for lave doser av insulin (fig. 3 A, B). Rollen nedstrøms kinaser på insulinavhengig HSD11B2 undertrykkelse ble vurdert ved hjelp PD098059 og AKT VIII inhibitorer. Figur 3C viser at begge veier, det MAPK /ERK og PI3K veien, mediert insulin effekt.
(
A
) uttrykk og fosforylering av insulin receptor av insulin i gangen (0 til 60 min) og dose (0-1000 nM) avhengig måte. (
B
) uttrykk og fosforylering av IGF-1 reseptoren av insulin i en tid og doseavhengig måte. (
C
) HSD11B2 mRNA uttrykk overvåket av QRT-PCR i nærvær av insulin, AKT inhibitor (AKTVIII, 0,1 mikrometer og 10 mm) eller MEK inhibitor (PD098059, 1 mm).
Total mRNA insulinbehandlede HT-29-celler ble ekstrahert og underkastet RT
2 profilering for å kvantifisere ekspresjonen av insulin spredningsveier komponenter. The Human Insulin signalveien RT
2 Profiler PCR Array profiler uttrykket av 84 gener relatert til insulin responsive gener. Tjueto gener differensielt regulert i HT-29-celler etter behandling med insulin er rapportert i tabell S1 og trasé som er involvert er vist i skjemaet på figur 4. RT
to profiler viste et karakteristisk mønster av insulin insensitivitet, med redusert ekspresjon av insulin pathway komponenter: IR, IGFI-R, insulin reseptor substrat (IRS2) og insulin reguleres glukose transportører (GLUT-4). Vedvarende insulinbehandling også fremmet glykolyse i HT-29 celler. Mens insulin reguleres glukosetransportør GLUT-4 uttrykket ble nedregulert, ble GLUT-1-koding messenger økt, legge til rette for import av glukose inn i cellene, uavhengig av vekstfaktor stimulering. Heksokinase 2, det enzym som fosforylerer glukose til glukose-6-P, et hastighetsbegrensende trinn i glykolysen, var oppregulert, sammen med pyruvat kinase 2 (PKM2), som konverterer PEP til pyruvat. I motsetning til dette, enzymet som defosforylert fruktose 1, 6 bisfosfat til fruktose-6-fosfat og bidratt til å antagonisere glykolyse ble nedregulert.
mRNA ble kvantifisert 24 timer etter insulin (10
-7 M) behandling ved hjelp RT
2 Profiler PCR Arrays PAHS-30C. Oppregulert transkripsjoner er vist i rødt og nedregulert transkripsjoner vises i grønt.
Effekt av insulin på C /EBP alpha, C /EBP beta, og C /EBP delta mRNA nivåer
Vi presenterer bevis på figur 5B, at behandling av HT-29 celler med forskjellige konsentrasjoner av insulin (10
-9-10
-5 M) i 24 timer forårsaket en konsentrasjonsavhengig økning i C /EBP beta mRNA uttrykk. I motsetning til insulin undertrykket ekspresjon av C /EBP alfa-mRNA-ekspresjon i en doseavhengig måte. Ved en konsentrasjon på 10
-7 M, redusert insulin C /EBP a-mRNA ved hjelp av 51% (
p
0,01), mens C /EBP delta-mRNA-ekspresjon var uforandret. Disse resultater viser at insulin-avhengig reduksjon av HSD11B2 mRNA, korrelerer med uttrykket mønster av to av tre undersøkte medlemmer av C /EBP familie av transkripsjonsfaktorer i HT-29 celler.
(
A
) konsentrasjonsavhengig effekt av insulin på 11beta-HSD2, C /EBP alpha, og C /EBP beta protein nivåer. HT-29 celler ble dyrket i 24 timer uten og med økende konsentrasjoner av insulin (10
-9-10
-5 M), deretter høstet for Western blotting for å vurdere ekspresjon av 11beta-HSD2, C /EBP alfa , C /EBP beta. (
B
) konsentrasjonsavhengig effekt av insulin på C /EBP alpha, C /EBP beta, og C /EBP delta mRNA uttrykk. HT-29 celler ble behandlet som i (A). Nivået av C /EBP alfa (åpne sirkler), C /EBP beta (åpne firkanter), og C /EBP delta (fylte trekanter) mRNA ble målt ved bruk QRT-PCR med S18 som intern kontroll. Ekspresjonsnivåene i behandlede celler ble normalisert til ubehandlede kontroller (100%). Representative data for minst tre uavhengige eksperimenter. Den relative intensitet ble bestemt ved densitometrisk scanning. Forholdet mellom relative tettheter av 11beta-HSD2 til beta-aktin i celler dyrket i abscence av hormonet ble ansett som 100% (kontroll). Forholdet mellom relative tettheter av kjerneekstraktproteiner til HDAC i celler dyrket uten hormon ble ansett som 100% (kontroll). * LIP var umulig å oppdage i kontrollprøvene, så LAP /LIP-forholdet ble ikke beregnet. (
C, D
) stanse av C /EBP alfa (
C
) og C /EBP beta (
D)
ble utført ved hjelp av siRNA. Uttrykket av C /EBP alpha, C /EBP beta (venstre panel) og HSD11B2 (høyre panel) mRNA ble målt ved hjelp av QRT-PCR.
Insulin-regulering av C /EBP alfa og C /EBP beta proteiner
for å undersøke hvorvidt C /EBP alfa eller C /EBP beta spille en rolle i insulinavhengig undertrykkelse av HSD11B2 genekspresjon, uttrykk for C /EBP alfa og C /EBP beta i HT- 29 celler ble analysert ved hjelp av Western blot (fig. 5A). C /EBP alfa-mRNA kan føre til to polypeptider med en størrelse på 42 kDa og 30 kDa [22], [23], mens C /EBP beta kan utvikle seg til en aktiverende eller inhiberende isoform (LAP, 38 kD eller leppe, 21 kDa , henholdsvis) [20], [24]. Behandling av HT-29 celler med insulin for 24 timer økte kjernefysiske nivåene av C /EBP alfa (isoform 42 kDa), av både C /EBP beta isoformene LAP og LIP, og redusert kjernefysiske nivåene av C /EBP alfa (isoform 30 kDa) på en doseavhengig måte. Parallelt uttrykk for HSD11B2 redusert samtidig med en maksimal effekt oppnås ved 10
-6 M av insulin (Fig. 5A). Imidlertid, i respons til den samme dosen av insulin, økningen i LIP (≈130 ganger ved 10
-6 M insulin) var større enn i LAP (≈3 ganger ved 10
-6 M insulin), noe som resulterer i en avtagende LAP /LIP-forhold (fig. 5A). Uttrykk for C /EBP alfa (isoform 42 kDa) ble økt noe, mens uttrykket av C /EBP alfa (isoform 30 kDa) ble redusert med 50% (Fig. 5A).
HSD11B2 genuttrykk er opp- regulert av C /EBP alpha /beta stanse
effekten av C /EBP alpha /beta knockdown på HSD11B2 ble vurdert i HT-29 celler. Det er bevis fra denne siRNA transfeksjon eksperiment som C /EBP alfa og C /EBP beta mRNA ble nedregulert betydelig (Fig. 5C, D, venstre panel). Viktigere, mRNA nivåer av HSD11B2 økt etter transfeksjon med siRNA mot begge isoformer (Fig. 5C, D, panel til høyre).
Insulin regulering av C /EBP-DNA komplekser
in silico
analyse av det humane HSD11B2 genpromoteren sekvens åpenbarte 4 antatte bindingsseter for C /EBP er beliggende i posisjoner -4361, -1985, -198 og -177 bp fra transkripsjonsstartsetet (Tabell 1). Området -4361 har høyere kamp med konsensus-sekvensen (tabell 1). Ulike prober ble merket og inkubert i nærvær av kjernefysiske ekstrakter isolert fra insulin behandlet HT-29 celler. EMSA gjennomføres med proben som inneholder konsensus-C /EBP-bindingssetet avslørte tre spesifikke komplekser (fig. 6A, kolonne 1, er angitt C1-3). Signalene ble reversert av konkurranse med umerket probe husing konsensus C /EBP området (Fig. 6A, spor 6), mens upåvirket når sonden næret de muterte C /EBP områder (Fig. 6A, lane 7). Derfor kan C1.3 signaler tilsvarer C /EBP /DNA-komplekser. C /EBP binding til konsensus-sonden ble forhøyet med øket varighet av insulinbehandling (fig. 6A, kolonnene 1-5), som viser den økte nivå av C /EBP beta funnet ved Western Blot (Fig. 5A). Interessant, intensiteten av C2 økt mer enn C1, C2 er mer tallrike i forhold til C1 24 timer etter behandling med insulin enn i kontrollene (søyle 1, 5).
(A) Nuclear proteiner isolert fra HT -29 celler som binder til identifiserte C /EBP-alfa /beta-områder.
4 ug av nukleære ekstrakter isolert fra insulin som ble behandlet (i det angitte tidsrom, 10
-7 M) eller ubehandlet HT-29-celler ble inkubert med radiomerket probe omfatter konsensus C /EBP alpha /beta området i nærvær eller fravær av ikke-radiomerket (100 ×) konkurrent probe (cons C /EBP alpha /beta eller mut C /EBP alpha /beta) (lanes1-7) . Pilene viser C /EBP alpha /beta /DNA-skift (C1, C2, C3) skilt fra gratis sonde ved gel elektroforese.
