Abstract
HRAS
er et proto-onkogen involvert i tumordannelse av kreft i urinblæren. I
HRAS
arrangøren identifiserte vi to G-rike elementer,
HRAS
-1 og
HRAS
-2, som fold, henholdsvis i en anti og en parallell quadruplex (
qhras
-1,
qhras
-2). Når vi introduserte i rekkefølge
HRAS
-1 eller
HRAS
-2 to punktmutasjoner som blokkerer quadruplex formasjon, transkripsjon økt fem ganger, men når vi stabilisert G-quadruplexes av Guanidinium ftalocyaniner, transkripsjon ble redusert til 20% av kontrollen. Av Chip vi fant ut at sekvensen
HRAS
-1 er bundet bare av MAZ, mens
HRAS
-2 er bundet av MAZ og Sp1: to transkripsjonsfaktorer erkjenner guanin bokser. Vi har også oppdaget av EMSA at rekombinant MAZ-GST binder seg til både
HRAS
quadruplexes, mens Sp1-GST bare binder til
qhras
-1. Den over-uttrykk for MAZ og SP1 aktiverer synergi
HRAS
transkripsjon, mens stanse hvert gen av RNAi resulterer i en sterk nedregulering av transkripsjon. Alle disse dataene indikerer at
HRAS
G-quadruplexes oppfører seg som transkripsjons repressors. Til slutt, vi designet lokkefugl oligonukleotider ligne
HRAS
quadruplexes, peiling (R) -1-O- [4- (1-Pyrenylethynyl) fenylmetyl] glyserol og LNA modifikasjoner for å øke stabiliteten og nukleaseresistens (G4- lokkeduer). G4-lokkeduer trykt
HRAS
transkripsjon og forårsaket en sterk antiproliferativ effekt, formidlet av apoptose, i T24 blæren kreftceller der
HRAS
er mutert
Citation. Membrino A , Cogoi S, Pedersen EB, Xodo LE (2011) Dannelse G4-DNA i
HRAS
arrangøren og rasjonell utforming av Decoy Oligonukleotider for Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (9): e24421. doi: 10,1371 /journal.pone.0024421
Redaktør: Mark Isalan, Senter for Genomisk forordning, Spania
mottatt: 03.06.2011; Godkjent: 09.08.2011; Publisert: 08.09.2011
Copyright: © 2011 Membrino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AIRC 2010 «Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuscruipt
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ras-genet familien består av tre funksjonelle proto-onkogener (
HRAS
,
NRAS Hotell og
KRAS
) som koder for guanin-bindende proteiner deler en høy homologi (p21
RAS) [1]. Disse proteinene, som ligger på den indre cellemembranen gjennom en farnesyl gruppe [2], er aktive når de er bundet til GTP og inaktive når GTP hydrolyseres til GDP [3]. Ras-proteiner regulere cellulære responser til mange ekstracellulære stimuli, inkludert mitogener og differensieringsfaktorer [4]. De ras genene er uttrykt i en vev-spesifikk måte:
HRAS
er sterkt uttrykt i hud og skjelettmuskulatur,
KRAS
i tykktarm og thymus og
NRAS
i mannlig Germinal vev [1]. Ras-genene har lignende strukturer og sekvenser med fem eksoner, den første av disse er ikke-kodende, og konserverte spleise områder. Intronene, i stedet, har forskjellige lengder og sekvenser [1]. Ras proto-onkogener omdannes til onkogener ved punktmutasjoner som reduserer kapasiteten til det kodede proteinet til å hydrolysere GTP til GDP, med det resultat at p21
RAS forblir konstitutivt aktiv. Hyperactivated ras-proteiner stimulere fosforylering kaskader inkludert Raf /MEK /ERK-reaksjonsveien som fører til ukontrollert celleformering [5], [6]. Mutasjoner i ras-genene er ofte finnes i mange humane tumorer [7], [8].
HRAS
mutasjoner er mindre vanlig, men de har en høy forekomst i huden papillomer og urinblæresvulster [9]. Som 80% av blæren svulster havn
HRAS
mutasjoner [10], og mer enn halvparten av blære tumorer som over
HRAS product: [11], både mutasjon og overuttrykk er viktige faktorer i tumordannelse av blærekreft [12]. Egentlig har det nylig blitt vist at lavt nivå uttrykk for konstitutivt aktiv
HRAS
indusert enkel urothelial hyperplasi, mens dobling av den aktiverte
HRAS
onkogen utløses raskt voksende og gjennomtrengende svulster i hele urin kanalen. Gitt den avgjørende rollen
HRAS
overekspresjon og mutasjoner i tumorgenese av blærekreft, kan en attraktiv terapeutisk strategi er å inhibere
HRAS
transkripsjon med molekyler som er i stand til å påvirke aktiviteten av genet promoter. For dette målet vi spurte hvordan
HRAS
transkripsjon er regulert. Vi observerte at arrangøren av
HRAS
inneholder mange kopier av GGGCGGG element eller dens komplement. Denne G-eske er blitt vist å interagere med den Sp1 transkripsjonsfaktor [13], [14]. Oppstrøms for transkripsjon start hotellet (TSS) er det kjøringer av guanines spenner over tre SP1 områder, som er potensielle områder for G-quadruplex formasjon. Vi antok derfor at G-rike elementer kan spille en rolle ved transkripsjon regulering. G4-DNA er uvanlige strukturer stabilisert ved plane rekker av fire guanines (G-kvartett) knyttet til hverandre ved Hoogsteen hydrogenbindinger [15]. Kantene av de terminale G-kvartetter er forbundet med løkker som kan variere både i lengde og topologi, som gir opphav til en rekke forskjellige konformasjoner [16]. Genom-wide analyser har avslørt at kjøringer av guanines er rikelig i genet promoter regioner rundt TSS [17] – [20]. Det har vært teoretisert derfor at G4-DNA kan være involvert i reguleringen transkripsjon [21] – [25]. Vår studie gir overbevisende bevis for at
HRAS
transkripsjon er regulert av samspillet mellom SP1, MAZ og G4-DNA, som fungerer som en transkripsjon repressor. På bakgrunn av dette funnet har vi designet G-rik oligonukleotider spesifikke for
HRAS
som har en sterk antiproliferativ effekt i urinkreftceller som bærer en mutant
HRAS
. Selv om cytotoksisitet av visse G-rike oligonukleotider er tidligere blitt rapportert, er deres virkningsmekanisme er ennå ikke fullt ut forstått [26], [27]. Vår studie viser at de utformede quadruplex dannende oligonukleotider kan virke ved avsette MAZ og dermed svekke
HRAS
transkripsjon. For deres potent antiproliferativ effekt i T24 urinblæren kreftceller, G4-lokkeduer synes å være svært lovende effektor legemidler for kreft i urinblæren terapi.
Resultater
HRAS
promoter er strukturelt polymorfe
arrangøren av den menneskelige
HRAS
genet mangler typiske TATA og CAAT bokser, inneholder en høy G + C-innhold (80%) og flere kopier av GGGCGGG (G-box) , anerkjent av transkripsjonsfaktor SP1 [13], [14]. De tre G-bokser nærmest RNA startsider lapper quadruplex-forming sekvenser, nemlig
HRAS
-1 (435-462, tiltredelse antall J00277) og
HRAS
-2 (506-530 , J00277) (figur 1). Ifølge en fersk undersøkelse, quadruplex-forming sekvenser som dekker SP1 bindende elementer er til stede i flere gener [28]. Vi har fått et første hint om at
HRAS
promoter er strukturelt polymorfe mens sekvense ekspresjonsvektorene spesialkonstruerte for denne studien. Når sekvense primer-forlengelsesreaksjoner ble utført med primere komplementære til G-rik strand, Taq polymerase uventet arrestert på
HRAS
-2 eller
HRAS
-1 G-rike elementer. I kontrast, med primere komplementære til den C-rike tråden vi ikke observere noen hindring. Dette antydet at både
HRAS
-1 og
HRAS
-2 sekvenser dannet uvanlige strukturer. Vår hypotese ble bekreftet av polymerase-stop analyser. Vi laget to lineær villtype maler som inneholder
HRAS
-1 eller
HRAS
-2 og en mutant malen der fire G → T mutasjoner ble introdusert i
HRAS Anmeldelser – 2 for å hindre quadruplex formasjon. Primer-skjøte reaksjoner viste at Taq polymerase i nærvær av kalium arrestert på 3 «enden av
HRAS
-2 eller
HRAS
-1, like før den første kjøring av guanines, i tråd med dannelse av en G-quadruplex struktur etter hvert G-rike element (figur S1)
To G-rike elementer (
HRAS
-1 og
HRAS
. – 2) ligger oppstrøms for transkripsjon start nettstedet kan potensielt kaste inn G-quadruplex strukturer. De quadruplex dannende G rike elementer inneholde bindingssteder for transkripsjonsfaktorene MAZ og SP1.
Promotersekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 danne stabile G4-DNA strukturer in vitro
Et innblikk i G-quadruplexes dannet av
HRAS
G-rike elementer ble oppnådd ved DMS-footprinting, sirkulærdikroismeanalyse (CD) og fluorescens resonans energioverføring (FRET) eksperimenter. Figur 2 viser resultatene oppnådd med sekvensen
HRAS
-1. DMS-fotavtrykk av 27-mer
HRAS
-1 i vann eller buffer som inneholder 100 mM Li
+ eller Cs
+ (baner 1, 4, 5) viser at alle guanines reagere med DMS . I stedet, i nærvær av 50, 100 eller 140 mM KCI (baner 2, 3, 9), den guanines av G-løper A-D er progressivt beskyttes, mens guanines G8 og G14 i den mellomliggende «TTGC» og «CGCA «sekvenser er ikke. Dette cleavage mønsteret tyder på at
HRAS
-1 kaster seg inn i en G-quadruplex (
qhras
-1). I nærvær av 50 nM TMPyP4,
HRAS
-1 gir en sterk fotavtrykk enten ved lav (1 mM) eller høy (100 mM) KCl konsentrasjon (søyle 7, 8) [29]. Som forventet, mutant sekvens
h1-mut
, peiling
HRAS
-1 med fire G → T mutasjoner som avskaffe folding, ikke gir noen fotavtrykk. For å bestemme strand orientering av
qhras
-1 vi brukte CD (figur 2c, d). CD-spekteret av
qhras
-1 i 100 mM KCl er karakterisert ved positive og negative elliptisitet ved 287 og 260 nm, henholdsvis, som er typisk for en antiparallell konformasjon [30]. Oppvarming av prøven vi oppnådd en smeltekurve (287 nm elliptisitet
versus
temperatur) som ikke var helt superimposable med avkjølingskurven, som først var litt tofaset mens den andre var monofase. En mer følsom metode for analyse ble oppnådd ved FRET-smelteforsøk med sekvens
HRAS
-1 endemerket med FAM og TAMRA ved 5 og 3 «ende, henholdsvis. Vi fikk et godt løst bifasisk smeltekurve med
T
M på 53 og 67 ° C indikerer at
HRAS
-1 folder i minst to quadruplexes (Figur 2e). Når konsentrasjonen av
HRAS
-1 ble økt en størrelsesorden fra 200 nM til 2 mikrometer,
T
Ms ikke endre: en atferd som er typisk for en intrastruktur ( ikke vist). Sammen tyder disse data på at
HRAS
-1 fatter en antiparallell quadruplex som kan anta forskjellige topologier: den ene med sidesløyfer er vist i figur 2f [16]. Selv om vi vet footprinting og CD-data de guanines som er involvert i dannelsen av anti
qhras
-1, et innblikk i oppbyggingen av denne quadruplex vil kun oppnås ved NMR. Figur 3 viser resultatene oppnådd med sekvensen
HRAS
-2. DMS-fotavtrykk av 24-mer
HRAS
-2 viser at i 10, 50, 100 og 140 mM KCl (baner 2-5), G-kjører A-D er beskyttet mot DMS, mens G10 , G12, G13, G21 og G22 reagere med DMS. Dette indikerer at guanin triader danner quadruplex bør være G3-G4-G5, G7-G8-G9, G14-G15-G16, G18-G19-G20. Det faktum at G16 viser noen reaktivitet til DMS antyder at pentaguanine G12-G16 strekningen kan delta til quadruplex enten med G14-G15-G16 eller med G13-G14-G15. Mutant
h2-mut
sekvens og villtype
HRAS
-2 i 100 mM Li
+ eller Cs
+ gav ingen fotavtrykk (baner 6-8). Den spor i nærvær av 50 nM TMPyP4 er meget sterk (spor 9, 10). CD spekteret av
HRAS
-2 viser en sterk ellipticity på 260 nm som indikerer en G-quadruplex med en parallell konformasjon (Figur 3c) [30]. Denne strukturen er så stabil at CD ved 85 ° C fremdeles viser en intens 260 nm elliptisitet. Stabiliteten på forskjellige KCl-konsentrasjoner ble bestemt med sekvensen
HRAS
-2 merket med FAM og TAMRA. Vi utførte FRET-smelteforsøk ved 20, 40, 60, 100 og 140 mM KCI og erholdt
T
M-verdier på 78-82, 85, 90 og 92 ° C, respektivt (Figur 3d). I dette tilfellet også,
T
Ms ikke endres når konsentrasjonen ble økt en størrelsesorden (fra 200 nM til 2 mm) (ikke vist). Totalt sett, våre data viser at
HRAS
-2 danner en parallell G-quadruplex (
qhras
-2) som antatte struktur utledes av DMS-footprinting og CD bør ha enten 1/1/4 eller 1/2/3 sløyfer (figur 3e). En definitiv struktur oppdrag vil kun være mulig på grunnlag av NMR data.
(a) Wild-type (
HRAS
-1) og mutert (
h1-mut
) sekvenser analysert ved DMS-footprinting. Full firkantene indikerer DMS-reaktive guanines, åpne torg indikere DMS-reaktive guanines; (B) DMS-footprinting av
HRAS
-1 i vann (spor 1);
HRAS
-1 i 50 og 100 mM KCl (spor 2 og 3);
HRAS
-1 i 100 mm CsCI eller LiCl (baner 4 og 5);
h1-mut
i 100 mM KCl (spor 6);
HRAS
-1 i 50 mM TMPyP4, 1 mM KCl (kolonne 7);
HRAS
-1 i 50 mM TMPyP4, 100 mM KCl (spor 8);
HRAS
-1 i 140 mM KCl (spor 9);
h1-mut
i 100 mM KCl (spor 10); (C) CD spektra ved 25 og 90 ° C viser at
HRAS
-1 kaster seg inn i en anti G-quadruplex; (D) Smelte kurver for quadruplex
HRAS
-1 innhentet plotte 287-nm ellipticity mot T. En
T
M på ca 63 ° C ble oppnådd ved oppvarming og kjøling kurver ; (E) FRET-smelting kurver av quadruplex
HRAS
-1 merket med FAM og TAMRA viser at det kan legges i to G-quadruplexes med
T
M på 53 og 67 ° C (.. Ex 475 nm, Em 520 nm); (F) Mulige conformations for
HRAS
-1, basert på footprinting og CD-data, er antiparallellforbundne quadruplexes med side og laterale /diagonal sløyfer. Den quadruplex med laterale sløyfer er vist i figuren.
(a) villtype og mutert
HRAS
-2 sekvenser analysert ved DMS-footprinting. Full firkantene indikerer DMS-reaktive guanines, åpne torg indikere DMS-reaktive guanines; (B) DMS-footprinting av
HRAS
-2 i vann (spor 1);
HRAS
-2 i 1, 10, 50, 100 mM KCl (baner 2-5);
HRAS
-2 i 100 mM LiCl eller CsCI (baner 6,7);
h2-mut
i 100 mM KCl (spor 8);
HRAS
-2 i 50 nM TMPyP4, 1 mM KCl (spor 9);
HRAS
-2 i 50 nM TMPyP4, 100 mM KCl (spor 10). Guanines G10, G12, G13 og G21, G22 spaltes, mens de øvrige guanines er ikke (unntatt G16 som viser en lav reaktivitet). Mutant
h2-mut
ikke viser noen footprinting i 100 mM KCl; (C) CD-spektra av quadruplex
HRAS
-2 ved forskjellige temperaturer mellom 25 og 90 ° C tyder på dannelsen av en antiparallell G-quadruplex; (D) FRET-smelting av quadruplex
HRAS
2 ved 20, 40, 60, 100 og 140 mM KCl viser bare en overgang med T
M på 78, 82, 85, 90, 92 ° C; (E) Mulig G-quadruplex struktur for
HRAS
-2, en parallell konformasjon med 1/1/4 eller 1/2/3 looper, basert på footprinting og CD-data.
G4-DNA destabiliserende punktmutasjoner i
HRAS
-1 og
HRAS
-2 sterkt oppregulere
HRAS
transkripsjon
Som sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 er plassert umiddelbart oppstrøms for transkripsjon start stedet og form
in vitro
stabile G-quadruplexes, spurte vi hva som skjer med
HRAS
transkripsjon når kapasiteten til quadruplex dannelsen av sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 er avskaffet. For å møte dette punktet vi bygget et plasmid, pHRAS-luc, bærende ildflue luciferase drevet av
HRAS
promoter. Fra pHRAS-Luc vi oppnådd ved seterettet mutagenese to mutante plasmider: pHRAS-Mut1 og pHRAS-Mut2, hvor to guanines i andre og tredje G-Tetrads av de antatte quadruplexes ble erstattet med tymin /cytosin eller thymines (figur 4a) . Disse mutasjonene avskaffet kapasitet på sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 til å kaste seg inn i en quadruplex (figur S2). Vill-type og mutante plasmider ble co-transfektert i HeLa-celler med PRL-CMV, en vektor som koder for
Renilla
luciferase. Førti-åtte timer etter transfeksjon vi målt ildflue og
Renilla
luciferases aktivitet i lysatene av ubehandlede og behandlede celler. Resultatene er rapportert i figur 4b viser at blokkering av quadruplex formasjon fører til en dramatisk økning av ildflueluciferase uttrykk, opp til 5-ganger sammenlignet med kontrollen. Dette indikerer sterkt at G-quadruplexes dannet av sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 er strukturelle elementer av
HRAS
promoter som oppfører seg som repressors, som observert for
CMYC
genet [21]
(a) To G4-DNA destabiliserende punktmutasjoner i
HRAS
-1 eller
HRAS
. – 2 element har blitt innført. Plasmid pHRAS-Mut1 inneholder en mutert
HRAS
-1 element, mens plasmid pHRAS-Mut2 inneholder en mutert
HRAS
-2 element; (B) Dual luciferase assay viser at punktmutasjoner føre opp til en fem-dobling i
HRAS
promoter aktivitet (se Figur 5 legende).
G4-DNA stabiliserende guanidinium ftalocyaniner undertrykke
HRAS
transkripsjon
Gitt at quadruplex DNA oppfører seg som en repressor element for
HRAS
, undersøkte vi effekten på transkripsjon av G4-DNA stabiliserende ligander. På grunn av sin spesifisitet for G4-DNA, i våre eksperimenter vi anvendt som ligander modifiserte ftalocyaniner: tetrakis- (diisopropyl-guanidin) ftalocyanin (DIGP) og dens Zn-inneholdende derivat Zn-DIGP (figur 5a) [31] – [33] . HeLa-celler ble først behandlet med 1 eller 5 uM DIGP eller Zn-DIGP i 24 timer og deretter ko-transfektert med en blanding av pHRAS-luc og PRL-CMV. Etter transfeksjon ble cellene la til å vokse i 48 timer før ildflue og
Renilla
luciferases aktivitet ble målt med et luminometer. Som en kontroll (i) ble behandlet vi cellene med TMPyP2, et porfyrin som ikke binder til G4-DNA [34]; (Ii) vi brukte som en reporter vektor pHRAS-Mut1 eller pHRAS-Mut2 bærer et mutert G-element i stand til å danne en quadruplex struktur. Figur 5b, c, viser d at DIGP og Zn-DIGP sterkt hemme luciferase fra villtype pHRAS-luc, mens TMPyP2 ikke. Dessuten gjør de ftalocyaniner ikke hemmer luciferase i cellene behandlet med den mutante plasmider pHRAS-Mut1 eller pHRAS-Mut2, i tråd med det faktum at G-quadruplexes ikke kan dannes ved disse vektorer. Disse dataene gir ytterligere bevis på at quadruplexes
qhras
-1 og
qhras
-2 fungere som transkripsjons repressors.
(a) Oppbygging av tetrakis- (diisopropyl-guanidin) phthalocyanine (DIGP) anvendes, med sin Zn-inneholdende analog Zn-DIGP, for luciferase eksperimenter; (B) Tvilling luciferasepreparater analyser som viser at guanidinium ftalocyaniner DIGP og Zn-DIGP, stabiliserende
HRAS
-1 og
HRAS
-2 quadruplexes, undertrykke
HRAS
promoter aktivitet. Denne effekten er ikke observert med mutante plasmider pHRAS-Mut1 og pHRAS-Mut2 (kontroll) (paneler C og D). Relativ luciferase er gitt ved R
T /R
NT × 100, hvor R
T og R
NT er (ildflue luciferase) /(
Renilla
luciferase) i T24 celler behandlet med ftalocyaniner og ubehandlede celler. Forskjeller fra kontrollen støttes av Student
t
test, P 0,05 (en stjerne), P . 0,01 (to stjerner)
transkripsjonsfaktorer SP1 og MAZ bind til quadruplex danner sekvenser (QFS)
HRAS
-1 og
HRAS
-2
som våre transkripsjons data tyder på at begge sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 er avgjørende for transkripsjon, vi spurte om de er anerkjent av kjerneproteiner. Et svar på dette spørsmålet ble oppnådd ved mobilitet-shift analyser med en HeLa atom ekstrakt. Figur 6a viser at både
HRAS
tomannsboliger skjema med HeLa atom ekstrakt forskjellige DNA-proteinkomplekser, og dermed peke på relevansen av disse sekvensene for
HRAS
transkripsjon. Ishii
et al.
Viste at sekvensen
HRAS
-2, som inneholder to kopier av GGGCGGG, er bundet av SP1 [13], [14]. Men sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 bør også samhandle med myc forbundet sink-finger transkripsjonsfaktor (MAZ), dets bindingssete å være (G /C) GG (C /A) GGG [35], [36]. Faktisk er det blitt rapportert at MAZ og Sp1 ofte regulere transkripsjon i en samarbeidende måte [37], [38].
(a) EMSA som viser dannelsen av DNA-proteinkomplekser mellom duplekser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 og HeLa kjerneekstrakt; mengder av ekstrakt som benyttes (ug) er angitt, radioaktivt merket DNA var ca 4 nM. Bokstavene a, b og c angir DNA-proteinkomplekser; (B) Chromatin immunpresipitasjonsanalyse viser samspillet mellom MAZ og SP1 med sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2. Samspillet mellom MAZ og SP1 med
HRAS
sekvenser ble analysert ved en PCR forsterkning av 190 bp (
HRAS
-1) og 161 bp (
HRAS
-2) fragmenter. De to båndene for komplekse MAZ:hras-en er blitt oppnådd i nærvær og fravær av Mg
2+ i blandingen (c) EMSA som viser bindingen av MAZ-GST og GST-Sp1 til quadruplexes
qhras
-1 og
qhras
-2.
for å bevise at SP1 og MAZ binder seg til sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 under
in vivo
forhold, utførte vi kromatin immunoprecipitation (chip) eksperimenter. Levende HeLa-celler ble behandlet med formaldehyd for å tverrbinde DNA-proteinkomplekser, kromatin ble skåret i fragmenter og deretter immunopresipitert med anti-MAZ og anti-SP1-antistoffer (Abs). Overfloden av
HRAS
promotersekvenser i immunpresipitatene ble målt ved hjelp av PCR hjelp primere spesifikke for sekvensene
HRAS
-1 og
HRAS
-2. Resultatene rapporteres i figur 6b viser at: IgG Ab ikke immunpresipitere DNA-proteinkomplekser som inneholder sekvensen
HRAS
-1 eller
HRAS
-2 (negativ kontroll); anti-MAZ Ab gjorde immunpresipitatet en DNA-proteinkompleks som inneholder
HRAS
-1 og
HRAS
-2; anti-SP1 Ab trukket ned et kompleks med
HRAS
-2. Ved å måle intensiteten av bandene, fant vi at
HRAS
sekvenser var mer rikelig i immunpresipitatene med anti-MAZ og anti-SP1 Abs enn i IgG Ab immunpresipitatet. Vi konkluderte derfor at under
in vivo
forhold MAZ er knyttet til sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2, mens SP1 er knyttet til sekvensen
HRAS
-2. Dette ble bekreftet av EMSA med rekombinant MAZ og SP1 (figur S3). Som tidligere studier har vist at MAZ binder seg til G4-DNA fra murine
KRAS product: [24] og
c-myb product: [39] arrangører, utforsket vi om det også binder seg til
HRAS
quadruplexes. Vi utførte EMSA med rekombinant MAZ og SP1, som ble uttrykt i
E. coli
som GST fusjonsproteiner (figur S4). Figur 6c viser at ved pH 7,4, 50 mM KCl,
qhras
-1 og
qhras
-2 med økende mengder av MAZ-GST formen – i nærvær av 100 gangers overskudd nonradiolabelled poly d (IC) – to tilbakestående bånd på grunn av dannelsen av to DNA-proteinkomplekser, mest sannsynlig med 01:01 og 01:02 støkiometri. Det er viktig å merke seg at i 50 mM CsCl, hvor
HRAS
sekvenser er ustrukturert (se DMS footprinting), begge kompleksene blir destabilisert noe som indikerer at DNA-protein interaksjon medieres av den quadruplex struktur. I en buffer ved pH 9, hvor MAZ modifiserer sannsynligvis sin egen folding blir DNA-proteininteraksjon også hemmet. Vi testet også bindingen av SP1-GST til
HRAS
quadruplexes og funnet ut at SP1-GST samhandler med anti
qhras
-1 quadruplex, men i en svakere måte i forhold til MAZ.
MAZ og SP1 synergi aktivere
HRAS
transkripsjon
For å bevise at MAZ og SP1 er involvert i
HRAS
transkripsjon, vi co-transfektert plasmid pHRAS-Luc i HeLa-celler enten med pMAZ (som koder for MAZ) eller pSp1 (som koder for SP1) eller med en blanding av de to plasmider (figur 7a). Når pMAZ eller pSp1 ble kotransfektert med reporteren vektoren, nivået av luciferase-ekspresjon økes med 50% sammenlignet med kontrollen. Når både pMAZ og pSp1 ble transfektert med reporteren vektor, økt transkripsjon nesten tre ganger over kontrollen, noe som indikerer at begge proteinene synergi aktivert
HRAS
promoter. Synergien var sterkere (7 ganger i forhold til kontroll) når pMAZ og pSp1 ble transfektert med mutant vektor pHRAS-Mut1 eller pHRAS-Mut2, peiling mutert
HRAS
-1 eller
HRAS Anmeldelser – 2 sekvenser som er i stand til å danne quadruplex strukturer. Dette tyder på at transkripsjon aktiveres når sekvenser
HRAS
-1 og
HRAS
-2 er i utbrettet duplex konformasjon. Videre, som et bevis på at transkripsjon krever både MAZ og SP1, vi slått ned med validerte shRNA hver av de to transkripsjonsfaktorer separat (figur S5). HeLa-celler ble behandlet med shRNA spesifikk for MAZ eller Sp1 og nivåene av
HRAS
transkripter ble målt ved hjelp av sanntids-PCR, ved 48 og 72 timer etter behandling. Det kan sees at
HRAS
transkripsjon ble redusert til 30 og 20% av kontrollen, 48 timer etter behandling med anti MAZ og anti Sp1 shRNA, henholdsvis (figur 7b). Til sammen våre data viser at
HRAS
transkripsjon aktiveres synergi av MAZ og SP1.
(a) HeLa celler transfektert med pHRAS-Luc /PRL-CMV, pHRAS-Luc /PRL-CMV /pMAZ; pHRAS-Luc /PRL-CMV /pSp1; pHRAS-Luc /PRL-CMV /pMAZ /pSp1. Den doble luciferase ble utført 24 timer etter transfeksjon. Relativ luminiscence er gitt ved R
T /R
NT × 100, hvor R
NT er (ildflue luciferase) /(
Renilla
luciferase) i T24 celler behandlet med kun pHRAS-Luc og PRL-CMV, mens R
T er (ildflue luciferase) /(
Renilla
luciferase) i T24 celler behandlet med pHRAS-Luc + pMAZ og /eller pSp1 + PRL-CMV. Forskjeller fra kontrollen støttes av Student
t
test, P 0,05 (en stjerne), P 0,01 (to stjerner); (B) Nivå
HRAS
avskrift i HeLa celler hvor MAZ eller SP1 ble slått ned av validert shRNAs.
MAZ destabiliserer
HRAS
G-quadruplexes
med tanke på at MAZ er viktig for
HRAS
transkripsjon og gjenkjenner
qhras
-1 og
qhras
-2, spurte vi om disse quadruplexes er pågikk etter MAZ. For å besvare dette spørsmålet, utførte vi FRET-smelteforsøk med rekombinant MAZ-GST. Quadruplex
qhras
-1 endemerket med FAM og TAMRA ble inkubert i 50 mM KCl, i 30 minutter i nærvær av økende mengder av MAZ-GST eller kontroll-protein (BSA eller trypsinogen). Smeltekurver (Df /dT) viste at
qhras
-1 alene smelter sammen med sin typiske tofaset profil med
T
M på 53 og 67 ° C (figur 8a kurve 1 ). Men da
qhras
-1 ble inkubert med MAZ-GST ved (mol protein) /(mol DNA) forholdet r = 2,5, 5, 10 (kurve 4, 5 og 6), smelteprofilen endret betydelig som
T
M falt til ~46 ° C. Dette tyder på at både
qhras
-1 quadruplexes blir destabilisert av MAZ-GST. Som forventet, uspesifikke proteiner slik som BSA eller trypsinogen ved r = 10 ikke påvirke smelting av
qhras
-1 (kurvene 2,3). På grunn av sin høye stabilitet i kalium (
T
M = 78 ° C i 10 mM KCl),
qhras
-2 ble analysert i 100 mM NaCl der
T
M var 65 ° C. Inkubert med MAZ-GST ved r = 2,5, 5, 10, den quadruplex smeltet ved 42 ° C, noe som indikerer at også
qhras
-2 ble destabilisert av MAZ-GST, men ikke av BSA eller trypsinogen. Vi konstaterte også at GST hadde ingen innflytelse på smeltingen av
HRAS
quadruplexes (Figur S6b). En ekstra kontroll som vi utført for å utelukke at bakterieproteiner ikke bidro til quadruplex destabilisering var å blande Glutathione Sepharose 4B harpiks med et utdrag hentet fra ikke-transform BL21 DE3 pLysS bakterier. En SDS-PAGE-analyse av eluatet med 10 mM redusert glutation viste at ingen bakterielle proteiner bindes ikke-spesifikt til harpiksen (figur S6a).
FRET-smelting eksperiment som viser at i 50 mM KCl, MAZ-GST ved r = 2,5, 5 og 10 (r = [MAZ] /[G4-DNA]) (kurve 4, 5 og 6) destabiliserer quadruplex
qhras
-1 i 50 mM KCl, 50 mM Zn-acetat [kurve 1 (panel a)] og quadruplex
qhras
-2 i 100 mM NaCl, 50 mM Zn-acetat [kurve 1, (panel b)]. BSA og TR (trypsinogen) ved r = 10 ikke har noen effekt på
qhras
-1 og
qhras
-2 quadruplexes) (kurvene 2 og 3, paneler a og b); (C) Skjematisk fremstilling av
HRAS
transkripsjon regulering foreslått av denne studien. Når de kritiske promotorelementer
HRAS
-1 og
HRAS
-2 brettes, oppfører de som transkripsjons repressors. Dette er foreslått av det faktum at quadruplex-destabiliserende punktmutasjoner i
HRAS
-1 og
HRAS
-2 resultat i en betydelig økning av transkripsjon, mens quadruplex stabiliserende ftalocyaniner er funnet å undertrykke transkripsjon . MAZ, gjennom sin evne til å gjenkjenne quadruplex strukturer, bør rekrutteres til arrangøren kritiske regionen. Den MAZ-DNA interaksjon destabiliserer G-quadruplexes, den kritiske
HRAS
-1 og
HRAS
-2 elementer anta en tosidig konformasjon som favoriserer binding av SP1 og andre proteiner av transkripsjon maskiner . Disse hendelsene fører til aktivering av transkripsjon.
Vi ble overrasket om utfoldelsen aktiviteten til MAZ, som vi nylig rapportert at MAZ stabilisert muse
KRAS
quadruplex [24]. Det bør imidlertid tas i betraktning at MAZ har seks sink fingrene kan samvirke med DNA på en kompleks måte, som observert med qTBP42 og CBF-A [40], [41]. Disse proteinene forstyrre dimeric quadruplex dannet av FMR1 d (CGG)
n gjenta, men de også stabilisere telomeric quadruplex d (TTAGGG)
n. CBF-4 og qTBP42 har fire RNP domener, men bare to er involvert i G4-DNA-binding. Det er vist at ulike RNP kombinasjoner er ansvarlig for enten den stabiliserende eller destabiliserende aktivitet.
G4-DNA lokkefugl ODNs ligne
HRAS
quadruplexes hemme transkripsjon og cellevekst
Tatt i betraktning at
HRAS
transkripsjon aktiveres av en kombinert virkning av MAZ og SP1 og at
qhras
-1 og
qhras
-2 binder seg til MAZ (
qhras
-1 også binder seg til SP1), har vi designet en lokkedue strategi mot
HRAS
onkogen. Vi tenkte at disse oligonukleotider ligne quadruplexes
qhras
-1 eller
qhras
-2 (G4-lokkeduer) skal beslaglegge MAZ og hemme
HRAS
transkripsjon samt cellevekst ( Figur 8c).
