Abstract
Bakgrunn
Vi bestemte uttrykket av gaffelhodeboks Q1 (FoxQ1), E-cadherin (E-cad), mucin 1 (MUC1), vimentin (VIM) og S100 kalsiumbindende protein A4 (S100A4), alle epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) indikator proteiner i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) vevsprøver. Vi har også undersøkt sammenhengen mellom disse fem proteiner uttrykk og andre clinicopathologic faktorer i NSCLC. Til slutt, vi vurdert den potensielle verdien av disse markørene som prognostiske indikatorer for overlevelse i NSCLC-pasienter.
Metoder
kvantitativ real-time PCR og immunhistokjemi ble brukt for å karakterisere uttrykk for FoxQ1 mRNA og protein i NSCLC. Uttrykk av vitnemål og oversatte produkter for de andre fire EMT indikatorproteiner ble vurdert av immunhistokjemi i de samme kliniske NSCLC prøvene.
Resultater
FoxQ1 mRNA og protein ble oppregulert i NSCLC sammenlignet med normal vev (
P
= 0,015 og
P
0,001, henholdsvis). Uttrykk av FoxQ1 i adenokarsinom var høyere enn i plateepitelkarsinom (
P
= 0,005), og høy uttrykk for FoxQ1 korrelert med tap av E-cad uttrykket (
P
= 0,012), og uregelrett positivitet av VIM (
P
= 0,024) og S100A4 (
P
= 0,004). Tilleggsoverlevelsesanalyse viste at høyt uttrykk for FoxQ1 (
P
= 0,047) og E-cad (
P
= 0,021) var uavhengige prognostiske faktorer.
Konklusjon
FoxQ1 spiller kanskje en bestemt rolle i EMT av NSCLC, og kan brukes som en prognostisk faktor for NSCLC
Citation. Feng J, Zhang X, Zhu H, Wang X, Ni S, Huang J (2012) FoxQ1 Overuttrykte Påvirker dårlig prognose i ikke-småcellet lungekreft, Associates med fenomenet EMT. PLoS ONE 7 (6): e39937. doi: 10,1371 /journal.pone.0039937
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 27 mars 2012; Godkjent: 29 mai 2012; Publisert: 28 juni 2012
Copyright: © 2012 Feng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Social Development and Applied Research Projects (S2010041) fra Nantong regjeringen, Kina; Internasjonalt samarbeid og utveksling (2011) fra Department of Health Jiangsu; og doktorgrads Fund (2010) av Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong, Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den hyppigst forekommende krefttypen, og den ledende årsak til kreft dødsfall globalt, med større dødelighet enn bryst, prostata, og tykktarmskreft kombinert [1], [2]. I løpet av de siste tre tiår i Kina, har lungekreft dødeligheten økt med 465%, med disse maligniteter bli den nest største dødsårsaken etter leverkreft [3]. Til tross for stort fremskritt i behandlingen av kreft de siste årene, prognosen for pasienter med lungekreft er fortsatt dårlig, med 5-års overlevelse mindre enn 15% [4], [5]. De fleste pasienter med lungekreft er på et avansert periode av sykdommen på diagnosetidspunktet, og ca. 85% av disse kreftformene er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [1], [6].
mange nyere studier har bemerket at epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) er en kritisk hendelse i tumor invasjon og metastasering i epitel-avledet kreft [7] – [10], inkludert NSCLC [11] – [14]. Bevisstheten om EMT fenomener dateres så tidlig som 1908. I løpet av 1990-tallet, EMT fått mer anerkjennelse som en mulig viktig mekanisme i kroniske sykdommer, som organ fibrose og kreft [15]. EMT er karakterisert ved nedregulering av epiteliale differensieringsmarkører E-cadherin (E-CAD) [16] – [20] og mucin 1 (MUC1) [21], og den opp-regulering av mesenchymale markører som vimentin (VIM) [17] – [20], [22], [23], fibronektin [17], [20], [24] og S100 kalsiumbindende protein A4 (S100A4) [25] – [28]. Tidligere studier har beskrevet en nøkkelrolle for gaffelhodeboks Q1 (FoxQ1) i regulering EMT og aggressivitet i human kreft [29] -. [32]
FOXQ1, tidligere kjent som HNF-3 /gaffelhode homolog 1 (HFH1 ), hører til et medlem av gaffelhodetranskripsjonsfaktor familie [32] – [34], som uttrykkes i forskjellige vev, og spiller viktige roller i utvikling, metabolisme, kreft og aldring [30], [34]. Som et av de første gaffelhode genene som er undersøkt, har FOXQ1 vært implisert å undertrykke glattmuskel-spesifikke gener, slik som Sm22α og telokin i A10-celler [35]. FOXQ1 har vist seg å være en mediator nedstrøms av Hoxa1 i embryonale stamceller [36]. Menneskelig FOXQ1, som ligger på kromosom 6p23-25, har blitt isolert og karakterisert [33], og spiller en viktig rolle i forbindelse med utvikling av kreft hos mennesker [31], [32].
Ett-trinns q RT-PCR ble utført for å bekrefte ekspresjonen av FoxQ1 mRNA i humant vev. Resultatene ble normalisert til GAPDH-mRNA-nivå. Den FoxQ1 mRNA nivå i NSCLC vev var høyere enn i peritumoural vev med statistisk signifikans ved hjelp av en sammenkoblede prøver T test. **
P
0,05. Linjene indikerer standard feil (S.E.)
(A) 1 og 2. Lunge plateepitelkarsinom vev mønster med H E farging; 3 og 4: høy ekspresjon av FoxQ1; 5 og 6: tap av E-cad uttrykk; 7 og 8: sterk VIM-positiv farging. (B) 1 og 2: adenokarsinom vev mønster lunge med H E farging; 3 og 4: positiv farging for FoxQ1; 5 og 6: negativ farging for MUC1; 7 og 8: oppregulert uttrykk for S100A4. (C) 1 og 2: lunge adenokarsinom vevet med H E farging; 3 og 4: negativ IHC for FoxQ1; 5 og 6: sterk immunologisk reaksjon av E-cad; 7 og 8: negativ for S100A4. (D) 1 og 2: lunge plateepitelkarsinom vev med H E farging; 3 og 4: lav ekspresjon av FoxQ1; 5 og 6: høy uttrykk for MUC1; 7 og 8: svak ekspresjon av VIM. Opprinnelig forstørrelse var x 40 i 1, 3, 5 og 7; og × 400 for 2, 4, 6 og 8.
bilder
(A) Curves beregnet for FoxQ1 uttrykk. Høy uttrykk i FoxQ1 gruppen (rød linje) indikerte betydelig mindre overlevelse enn lav og ingen uttrykk i FoxQ1 gruppe (blå linje). (B) Kurver beregnet for E-cad uttrykk. Levetid for pasienter med positiv E-CAD farging er mye kortere (rød linje), enn i pasienter med negativ E-CAD farging (blå linje).
Nyere studier har beskrevet at FOXQ1 har blitt funnet å være overexpressed i tykk- og endetarmskreft [29], [31] og brystkreft [31], [32], der pasienter har dårlige kliniske utfall [31], [32]. Selv om overekspresjon av FOXQ1 i cancercellelinjer bekreftet at genet kan spille en rolle i utvikling av lungekreft [29], [33], korrelasjonen mellom FOXQ1 ekspresjonssystemer og EMT faktorer for å bestemme den kliniske relevansen i NSCLC tidligere ikke har vært rapportert.
Vi analyserte uttrykk for FoxQ1 genet ved hjelp av kvantitative revers transkripsjon polymerase kjedereaksjoner (RT-PCR) i små, fersk frosset NSCLC vevsprøver. Uttrykk av FoxQ1 protein og fire felles EMT indikator proteiner (E-cad, MUC1, VIM og S100A4) ble vurdert ved immunhistokjemi hjelp av samme vev microarray (TMA) deler. I tillegg har vi undersøkt forholdet mellom uttrykkene i de fem gener koder for disse proteiner og andre clinicopathological faktorer i NSCLC. Til slutt, vurdert vi den potensielle verdien av disse markørene som prognostiske indikatorer for overlevelse hos pasienter med NSCLC.
Metoder
Pasient og TMA av NSCLC prøvene
Etter en hel patologisk vurdering i henhold til den syvende utgaven av TNM i Lung Cancer [37], ble et panel av formalinfiksert parafin-embedded NSCLC vev med tilsvarende tumor tilstøtende vev som gjennomgår kirurgisk behandling innhentet fra Affiliated Hospital of Nantong Universitetet mellom januar 2005 og desember 2006. kliniske data (inkludert kjønn, alder, histologisk type karakter, scene, tumor størrelse, differensiering, lymfeknutemetastase status) ble innhentet fra hver enkelt pasients journal.
blant arkivmateriale, 103 vevsblokker fra NSCLC pasienter med 5 års oppfølgings overlevelse poster var tilgjengelige og brukes for å konstruere TMA. Et representativt område av hver tumor ble valgt og 2,0 mm vev Kjernene ble anvendt for å konstruere en TMA ved Shanghai overgå Biotech (Kina). Kvaliteten av TMA-seksjoner ble bekreftet ved hjelp av hematoxylin-eosin-farging (H E). Gjennomsnittsalderen for gruppen var 62,5 år (spredning: 35-81 år). Overlevelse ble beregnet fra datoen for operasjonen frem til dato for død eller siste oppfølging. Videre ble et panel av 20 ferskt frosset vev NSCLC og samsvarende peritumour vev fra samme sykehus nevnt ovenfor anvendt i denne studien. Før kirurgisk behandling, ingen av pasientene hadde fått neoadjuvant kjemoterapi, strålebehandling eller immunterapi. Etikk godkjenning for å utføre denne studien ble innhentet fra lokale menneskelige forskningsetiske komité.
Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert og renset fra 40 ferske frosne NSCLC vevsprøver , inkludert 20 NSCLC vev og 20 tilsvarende ikke-cancervev. Total RNA ekstraksjon, kvalitetskontroll og ett-trinns QRT-PCR ble utført som tidligere rapportert [38]. FOXQ1-spesifikke oligonukleotidprimere (forover, 5′-ACG CTG GCG GAG ATC AAC GAG-3 «, omvendt, 5′-AGG TTG TGG CGC ACG GAG TT-3′) ble utformet for å gi en 92-bp PCR-produkt. Dataene ble normalisert ved hjelp av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som en referanse gen (forover-primer, 5»-TCG GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 «, revers primer, 5»-TGC CAT GGG TGG AAT CAT ATT GGA-3 «).
Immunohistochemistry (IHC)
IHC ble utført som beskrevet tidligere [39]. Deparaffinized seksjoner (4-um tykke) fra matriseblokkene ble separat farget på en Autostainer Universal Farging System (LabVision, USA) ved anvendelse av følgende primære antistoffer: mus-anti-FOXQ1 (1:300 fortynning; Abcam, UK), muse anti-E -cad (1:120; Invitrogen, USA), monoklonalt mus anti-MUC1 (1:200; Novocastra, UK), monoklonalt mus anti-VIM (1: 100; Invitrogen, USA), og polyklonalt kanin-anti-S100A4 (1 :100; Newmarker, USA). Sekundære antistoffer som ble anvendt var: Envision geite-anti-muse-HRP (DAKO, USA), Envision geite-anti-kanin HRP (DAKO, USA). Evalueringen av farging av disse delene ble gjort blind for to trente patologer som var uvitende om den kliniske bakgrunn av prøvene
De prosenter av FoxQ1-positive celler ble scoret og plassert inn i fire kategorier etter farging. 0 til 0%; 1 for 1-33%; 2 for 34-66%; og 3 for 67-100%. De FoxQ1 fargeintensitet ble også scoret som: 0, 1, 2 eller 3. Summen av prosenter og intensitetspoeng ble brukt som den endelige FoxQ1 flekker poengsum, som vi har skissert tidligere [39] og har blitt definert som følger: 0-2, lav uttrykk; og 3-6, høy uttrykk. Men for positivitet av de valgte EMT stakere (E-cad, MUC1, VIM og S100A4), ingen påvisbare eller 10% positiv farging av tumorceller ble ansett som negativt, mens ≥10% positiv farging av tumorceller ble ansett positiv [40]. Alle prøvene ble evaluert ved 4 × og 10 × forstørrelse.
Statistiske metoder
FoxQ1 mRNA nivå i ferskt frosset NSCLC vev og tilsvarende ikke-kreft vev ble normalisert til GAPDH og analysert ved hjelp av Wilcoxon signert rank test for parametriske tester. Assosiasjoner mellom clinicopathologic variabler og FoxQ1 protein uttrykk ble undersøkt av χ
2 tester. Den chi-kvadrat ble brukt til å bekrefte sammenhengen mellom uttrykk for FoxQ1 og EMT indikator proteiner. Overlevelseskurver ble beregnet ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge Kaplan-Meier og sammenlignet ved hjelp av log-rank test. Faktorer vist seg å være av prognostisk betydning i de univariate modeller ble evaluert ved hjelp av en multivariat Cox regresjonsmodell. En
P
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Data ble analysert ved hjelp av Stata 9.0 programvare (Stata Corporation).
Resultater
FoxQ1 mRNA uttrykk i NSCLC og peritumoural vev
Total RNA ble ekstrahert fra nystekte frosset NSCLC vev og utsatt for ett-trinns QRT-PCR for å undersøke FoxQ1 mRNA uttrykk. Vi har også undersøkt prøver fra tilstøtende matchet tumorvev. Når normalisert til GAPDH, det betyr uttrykket nivåer av FoxQ1 mRNA i NSCLC og tilsvarende ikke-kreftvev var 0,15 ± 0,02 og 0,04 ± 0,02 (
P
= 0,015), henholdsvis. FoxQ1 uttrykk var 3,75 ganger høyere i gjennomsnitt i kreftprøver enn hos ikke-maligne vev (Fig. 1).
IHC funn for FoxQ1 og EMT indikator proteiner i NSCLC vev
Typisk immunhistokjemiske fargemønstre observert for de fem gener som koder for den FoxQ1 og de andre fire indikator EMT proteinene i NSCLC er vist i figur 2. Positiv farging for FoxQ1 ble hovedsakelig lokalisert til tumorceller og pneumocytes i cytoplasma og plasmalemma på ulike nivåer. Mens positive nukleær farging kunne sees, ble FoxQ1 immunomerking ikke observert i stroma av disse vev. Høy FoxQ1 ekspresjon ble påvist i 82/103 (50,49%) av NSCLC-vev, og var i 38 (20,39%) av de tilgrensende matcher tumorvev. Dataene viste statistisk signifikans ved hjelp av χ
2 test analyse (χ
2 = 38,6450,
P
0,001). Og var i samsvar med FoxQ1 mRNA nivåer i NSCLCs
Positiv ekspresjon av E-cad og MUC1 ble lokalisert til cellemembranen, og en kombinasjon av den plasmalemma og cytoplasma i NSCLC-tumorceller, respektivt. Positive immunhistokjemisk farging for VIM og S100A4 i kreftceller ble observert i cytoplasma, og en kombinasjon av kjernen og cytoplasmaet. Et unntak fra dette var de positive stromale fibroblaster.
Forholdet mellom uttrykk for FoxQ1 proteiner og clinicopathological parametere i NSCLC
De assosiasjoner mellom FoxQ1 uttrykk og clinicopathological funksjoner i NSCLC er vist i tabell 1. FoxQ1 protein uttrykk i adenokarsinom var høyere enn i plateepitelkarsinom med statistisk signifikans (χ
2 = 10,7089,
P
= 0.005) av χ
2 test analyse. Derimot ble ingen signifikante assosiasjoner sett med pasientens alder, kjønn, tumordiameter, histologisk grad av svulsten, lymfeknutemetastase status, og scene gruppering med TNM.
Sammenheng mellom uttrykk for FoxQ1 og EMT indikator proteiner
forholdet mellom ekspresjon av FoxQ1 og de fire EMT indikatorproteiner ble beregnet og er angitt i tabell 2. Det ble bemerket at epitel-protein tapsfrekvensene i 103 NSCLC vev var 66,02% for E-cad og 18,45 % for MUC1. Unormale mesenchymale protein expression frekvenser i de samme prøvene var 23,30% for VIM og 68,93% for S100A4. Resultatet viste også at høyt uttrykk for FoxQ1 korrelert med et tap på E-cad uttrykk (χ
2 = 6,308,
P
= 0,012), og unormal positivitet av VIM (χ
2 = 1,396,
P
= 0,024) og S100A4 (χ
2 = 8,374,
P
= 0.004) i kliniske NSCLC prøvene.
Survival analyse
Flere kjente prediktive forhold med dårlig resultat i NSCLC ble vurdert for å validere kohort av pasienter som er representert ved denne TMA (tabell 3). Høy uttrykk for FoxQ1 protein (
P
= 0,023) og lav uttrykk for E-cad protein (
P
= 0,002) viste en statistisk signifikant sammenheng med fem års overlevelse av Cox regresjon univariat analyse. I tillegg til disse to genetiske markører, ble andre NSCLC kliniske prognostiske faktorer, slik som differensiering av tumor og TNM trinn som inngår i en multivariat Cox regresjonsmodell. Våre data viser at høy FoxQ1 uttrykk (
P
= 0,047) og et tap på E-cad uttrykk (
P
= 0,021) ble bekreftet å være uavhengige prognosticators for lav overlevelse av NSCLC.
overlevelse ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Resultatene identifisert at pasienter med en høy FoxQ1 ekspresjon eller tap av E-cad ekspresjon hadde en betydelig kortere overlevelsestiden i forhold til de med lav eller konservert uttrykk, henholdsvis (fig. 3).
diskusjon
i denne studien, ved hjelp av en TMA, understreket vi den prognostiske verdien av FoxQ1 uttrykk i NSCLC. Høy uttrykk for FoxQ1 påvises i TMA av tumorprøver og var signifikant korrelert med redusert total overlevelse. Videre viser resultatene viste at FoxQ1 ekspresjon var signifikant assosiert med EMT i en undergruppe av pasienter. Gjennom multivariat analyse ble høyt uttrykk for FoxQ1 og redusert E-cad uttrykk vist seg å være uavhengige prognostiske biomarkører for dårlig total overlevelse. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten fra clinicopathological betydningen av FoxQ1 uttrykk knyttet til EMT i kliniske NSCLC vevsprøver.
Nylig, samler bevis tyder på at menneskelig FoxQ1 spiller en sentral rolle i regulering av EMT av brystkreft [31], [32], og aggressivitet i tykktarmskreft [29], [32]. Det er betydelig bevis på at nærværet av EMT fenomenet indikerer kort overlevelse i lungekreft [11] – [14]. For å identifisere sammenhengen mellom FoxQ1 og EMT i lungekarsinom ble fire hyppige indikator biomarkører undersøkt i lungekreft TMA bruker IHC. Interessant, viste resultatene at høye nivåer av uttrykk for FoxQ1 protein korrelert med redusert E-cad protein uttrykk, og øker i VIM og S100A4 protein uttrykk.
Noen forfattere har vist at E-cad er knyttet til metastaser av lungekreft [12]. VIM antas ikke å bli assosiert med overlevelse i lungekreft [14], selv om S100A4 er korrelert med prognose for lunge plateepitelkarsinom [41] i kliniske studier. Vi har også bestemt den prognostiske effekten av EMT markør uttrykk ved univariat og multivariat analyse. Våre resultater viser at den eneste markøren forbundet med utfallet var E-cad.
Nyere studier har bekreftet at FoxQ1 å være en verdifull prognostisk indikator for dårlig overlevelse ved brystkreft [31], [32]. Men høy uttrykk for FoxQ1 genet ble også observert i lungekreft, magekreft, og tykktarmskreft cellelinjer [29]. Dermed våre nåværende resultater bekrefte tidligere funn om FoxQ1 uttrykk i NSCLC, særlig i lunge adenokarsinom.
Selv om de nøyaktige mekanismene for FoxQ1 er tumorigene virkninger i NSCLC ikke har blitt fullstendig beskrevet i vår nåværende etterforskningen, det molekylære grunnlaget for assosiasjon mellom FoxQ1 og EMT er godt forstått i tumor. De oppnådde data fra våre resultater er i overensstemmelse med de som er presentert i den nye litteraturen, som hadde erklært at undertrykkelsen av FoxQ1 førte til en økning i E-CAD-ekspresjon i humane carcinom [31], [32]. Samlet funnene i vår nåværende studie bekreftet at FoxQ1 kan potensielt brukes som en EMT markør i NSCLC.
I konklusjonen, har vi vist at FoxQ1 ble sterkt uttrykt i NSCLC og kan brukes som en direkte prognosticator av et negativt utfall. Også resultatene understøttet av det faktum at FoxQ1 har en funksjonell rolle med hensyn til EMT-relaterte gener i NSCLC.
