Abstract
Nye strategier er nødvendig å forbedre kjemoterapi respons i avansert og tilbakevendende livmorkreft. Her viser vi at terpenoids stede i Steam Destillert Utdrag av Ginger (SDGE) er potente hemmere av spredning av endometrial kreft celler. SDGE, isolert fra seks ulike grupper av ingefær rotstokker, konsekvent hemmet spredning av livmorkreft cellelinjer Ishikawa og ECC-en på IC
50 på 1,25 mg /ml. SDGE forbedret også den anti-proliferative effekt av stråling og cisplatin. Redusert spredning av Ishikawa og ECC-1 celler ble et direkte resultat av SDGE-indusert apoptose som demonstrert av FITC-Annexin V farging og uttrykk for spaltet caspase 3. GC /MS-analyse identifiserte til sammen 22 forskjellige terpenoidsyntesesporet forbindelser SDGE, med isomerer Neral og geranial utgjør 30-40%. Citral, neral en blanding av geranial og inhiberte proliferasjonen av Ishikawa og ECC-1-celler ved en IC
50 10 uM (2,3 ug /ml). Fenoliske forbindelser slik som gingerol og shogaol ble ikke påvist i SDGE og 6-gingerol var et svakere inhibitor av proliferasjon av endometrial kreft celler. SDGE var mer effektive i indusering av cancercelledød enn citral, noe som tyder på at andre terpener er til stede i SDGE ble også bidrar til endometrial cancer celledød. SDGE behandling resulterte i en rask og sterk økning i intracellulært kalsium og en 20-40% reduksjon i mitokondriemembranen potensial. Ser-15 av p53 ble fosforylert etter 15 min behandling av kreftcellene med SDGE. Denne økningen i p53 var assosiert med 90% reduksjon i BCL2 mens ingen virkning ble observert på Bax. Inhibitor av p53, pifithrin-α, svekket anti-kreft-effekter av SDGE og apoptose ble heller ikke observert i p53
neg SKOV-3-celler. Våre studier viser at terpenoids fra SDGE megle apoptose ved å aktivere p53, og bør derfor undersøkes som midler for behandling av livmorkreft
Citation. Liu Y, Whelan RJ, Pattnaik BR, Ludwig K, Subudhi E, Rowland H, et al. (2012) terpenoids fra
Zingiber officinale plakater (Ginger) indusere apoptose i livmorkreft Cells gjennom aktivering av p53. PLoS ONE 7 (12): e53178. doi: 10,1371 /journal.pone.0053178
Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Center, Saudi-Arabia
mottatt: 10. august 2012; Godkjent: 26 november 2012; Publisert: Per 31. desember 2012 |
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midler til denne forskningen ble levert av tilskudd fra Institutt for obstetrikk og gynekologi til AK og MSP, en veldedig donasjon fra Jean McKenzie og forskningsmidler fra Wisconsin Ovarian Cancer Alliance til MSP og Rebecca Meyer Brown professorat i UW-Eye Research Institute (Retina Research Foundation) til BRP. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i året 2011, ca 8010 kvinner døde på grunn av livmorkreft og nesten 47 130 pasienter ble nylig diagnostisert med denne kreftformen [1]. I omtrent 70% av kvinnene med en diagnose for livmorkreft, er sykdommen funnet lokalisert til livmoren og fem års overlevelse er så høy som 85% [2]. Avanserte og tilbakevendende livmorkreftpasienter, som deltok i flere gynekologisk onkologi gruppen (GOG) prøvelser for agenter inkludert platina, taxaner og antracykliner, sjelden har komplett respons på terapi [3] – [9]. Kombinasjon regimer viser høyere responsrater, men progresjonsfri perioden med disse behandlingene er relativt lav (5-7 måneder) med høyere sykelighet og fortsatt mangel på kur [10]. Denne statistikken aktualiserer behovet for utvikling av nye og effektive chemopreventive og kjemoterapeutiske midler for livmorkreft.
Naturlig forekommende kosttilskudd komponentene gir en viktig kilde til bioaktive forbindelser som kan tjene som både chemopreventive samt kjemoterapeutiske midler mot livmor og andre typer kreft [11]. Laboratoriet undersøker de anti-kreft egenskaper av forbindelser til stede i rotstokker av ingefær (
Zingiber officinale
). Disse studiene er støttet av tidligere undersøkelser som viser at tørr ingefær pulver eller løsemiddel ekstrakter av ingefær røtter indusere cellesyklus og apoptose i huden, bryst, prostata, tykktarm, og eggstokkreft celler [12] – [17]. Topisk applikasjon av det etanoliske ekstrakt av ingefær reduserte forekomsten, størrelsen og antallet av DMBA /TPA-induserte svulster i sencar-mus [18].
De fleste av de tidligere studier har konkludert med at de bioaktive komponenter i tørt pulver og væske ekstrakt av ingefær rotstokker ansvarlig for anti-kreft-aktivitet er de fenoliske forbindelsene 4-, 6-, 8- og 10-gingerols, paradol og shogaol, et produkt som dannes etter tørking eller oppvarming av røttene [19] , [20]. Disse fenoliske forbindelser, og spesielt de gingerols utviser anti-proliferativ og anti-angiogene egenskaper som demonstrert ved
in vitro
og
in vivo
studier i forskjellige cancermodeller [13], [14], [16], [21] – [25]. Menneske kolorektal kreftceller når de ble behandlet med 6-gingerol, hemmet celleproliferasjon ved å indusere G1 cellesyklus og apoptose [26]. Gingerols viser disse anti-kreft effekt via flere mekanismer, som inkluderer protein degradering samt β-catenin, PKC delta, og gsk3 beta trasé [26]. Studier i eggstokkreft modellen har vist at 6-shogaol hemmer utskillelsen av VEGF av kreftceller [16]. 6-gingerol induserer apoptose i prostatakreftcellelinje LnCap ved å øke ekspresjon av p53 og Bax og samtidig redusere ekspresjonen av Bcl-2 [16], [17], [21].
I tillegg til pulverisert ingefær og oppløsningsmiddelekstraksjon, kan bioaktive forbindelser også isoleres ved dampdestillasjon om denne rotstokker [27], [28]. Så langt vi kjenner til, har bare begrensede studier er utført for å demonstrere de anti-kreft egenskaper av damp destillert ekstrakter av ingefær. Kjemisk analyse av de dampdestillert ekstrakt av ingefær tyder på at de tidligere identifiserte bioaktive fenoliske forbindelser er til stede i meget lav konsentrasjon i damp destillert ekstrakter av ingefær [27]. I denne studien viser vi at damp destillert ekstrakter av ingefær er potente mediatorer av apoptose i endometrial kreft celler. Våre studier tyder på at en av de viktigste bioaktive komponentene i dampdestillert ekstrakt av ingefær er citral (en blanding av to isomerer terpenoidsyntesesporet, Neral og geranial). Vi viser at behandlingen av endometrial kreft celler med damp destillert ekstrakt av ginger resulterer i betydelig økning i intracellulært kalsium, reduseres i mitokondriemembranen potensial, økning i ekspresjonen av kaspase 3, fosforylering av P53, og en signifikant reduksjon i uttrykket av BCL-2. Observasjonene er skissert i våre studier viser at damp destillert ekstrakt av ingefær og dens bioaktive komponenter har potensial til å bli utviklet som chemopreventive og kjemoterapeutiske midler for livmorkreft.
Materialer og metoder
reagenser og celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Pifithrin-α ble kjøpt fra Sigma Life Science. DMEM (Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium), RPMI-1640, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), og Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) var fra Cellgro (Manassas, VA). DiOC6, Ionomycin og Indo 1-AM ble kjøpt fra Life Technologies (Grand Island, NY). SuperSignal West Dura lengre varighet Underlag RIPA buffer og proteasehemmer Cocktail var fra ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). Primær caspase-3-kanin-antistoff, Bcl-2-kanin-antistoff, Bax kanin antistoff, fosfo-P53 antistoff fra mus og β-aktin mus antistoff ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Peroksidase-konjugert AffiniPure geit-anti-kanin-IgG-antistoff og peroksidase-konjugert AffiniPure geit anti-mus IgG-antistoff var fra Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA). FITC-Annexin V Apoptose Detection kit ble kjøpt fra BD Pharmingen (San Diego, California). ECC-1 [29], [30] og Ishikawa [31] celler var en gave fra legene. Elaine Alarid og David Olive (Madison, WI), henholdsvis. SKOV-3-celler ble anskaffet fra ATCC (Manasas, VA).
Cell Culture
Ishikawa-celler ble dyrket i DMEM og ECC-1 og SKOV-3-celler ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin antibiotika i en 5% CO
2 inkubator.
Steam Destillasjon av Ginger jordstengler
Ginger jordstengler ble hentet fra lokale leverandører , renset med destillert vann og kuttet i 0,5 cm store stykker. Omtrent 250-300 g av de kuttede ingefær stykker ble overført til 1000 ml rundkolbe av Clevenger damp destillasjonsapparatet. Ingefær røtter ble neddykket i 500 ml deionisert vann (18 MOhm-cm) og dampdestillasjon ble utført i 4-6 timer ved oppvarming av kolben. Oljen som skiller i Clevenger anordningen var lettere enn vann og ble separert ved periodisk å drenere væske samler seg i separasjonsrøret av enheten. Oljen ble umiddelbart porsjonert i mikrofugerør og frosset inntil bruk i analyser. Tettheten av oljen ble beregnet til å være 0,87 g /ml og denne måling ble anvendt for å beregne konsentrasjonen av den ekstrakt som brukes til å utføre de biologiske analysene.
celleproliferasjon Assays
Effekt av damp destillert ingefær ekstrakter, citral, og 6-gingerol på proliferasjonen av kreftcellelinjer ble bestemt av 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) opptak metoden [32 ], [33]. Kort sagt ble kreftcellene sådd ut i 96-brønns plate ved en densitet på 5000 celler /brønn i sitt respektive medium. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ingefær ekstrakt (0,025 ug, 0,25 ug, 2,5 ug, 6,25 ug og 12,50 pg /ml) og inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 miljø i 24 timer, 48 h og 72 h. Etter det angitte tidsrom, ble 20 pl 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 3 timer. De formazankrystaller som dannes i brønnene ble oppløst i 100 ul DMSO. Absorbansen ble målt ved 570 nm ved bruk av en Spectra MAX 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
kombinert behandling av kreftceller med SDGE og stråling eller kjemoterapi
MTT-analyser ble utført for å bestemme hvis SDGE forbedret anti-spredning effekten av stråling eller cellegift i endometrial kreft celler. Ishikawa eller ECC-1-celler ble sådd ut i multiple 96-brønners plater (5 x 10
3 celler /brønn) på dag 1 av forsøket. Etter at cellene til å stabilisere, media eller SDGE ble tilsatt til brønnene som inneholdt de endometrial kreft celler på dag 2. Celler i noen av brønnene ble også behandlet med cisplatin (5 pM), mens andre ble bestrålt med en enkeltdose av 4 Gy ved hjelp av en Cesium-137 radiator. Etter disse behandlinger, cellene ble dyrket i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO
2 miljø. Effekten av behandlingen på proliferasjon av endometrial kreft celler ble bestemt ved å utføre MTT-analyser som beskrevet ovenfor.
gasskromatografi-massespektrometri av SDGE
separasjon og identifikasjon av stoffer i SDGE prøver benyttet et Shimadzu GC-17A gasskromatograf utstyrt med en QP-5000 kvadrupol massemåler (Shimadzu vitenskapelige instrumenter, Columbia, MD). Før analyse ble 20 ul friskt tinet SDGE oppløst i 1000 mL av pentan. 1 pl av denne ble oppløst ekstrakt ble injisert manuelt til gasskromatograf ved bruk av en 01:50 innløp deleforhold og helium som bærergass ved en strømningshastighet på 1,4 ml /min. Gasskromatografen inneholdt et ikke-polart RTX-5MS-kolonne (30 m lengde, 0,25 mm ID, 0,25 mikrometer filmtykkelse,. Restek, Bellefonte, PA) Kolonnetemperatur ble opprinnelig 70 ° C etterfulgt av en rampe ved 4 ° C /min til 180 ° C. Elektron ionisering påvisning var i full-scan, positiv ion-modus i løpet av et masse-til-ladning-forhold (m /z) området 41 til 300. Forbindelser ble forsøksvis identifisert ved å søke en NIST bibliotek og ved sammenligning av aritmetiske oppbevaring indekser til verdiene rapportert av Adams [34].
Måling av apoptose ved flowcytometri
Apoptose ble målt ved hjelp av FITC-Annexin V apoptose Detection kit (BD Pharmingen, San Diego, California). I korthet, 2 x 10
6-celler ble behandlet med 0,25 ug /ml ingefær ekstrakt med eller uten 100 uM Pifithrin-α. Etter inkubering ved 37 ° C i 0-16 timer, ble cellene vasket to ganger med kald PBS og resuspendert i 1 x bindingsbuffer (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2) ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml. Deretter 1 x 10
5-celler i 100 ul bindingsbuffer, ble overført til 5 ml rør og farget med 5 ul av FITC-Annexin V og 5 ul propidiumjodid (PI). Cellene ble forsiktig blandet og inkubert ved romtemperatur i 15 min. Etter vasking av cellene med 1 x bindingsbuffer for å fjerne overskudd av FITC-Annexin V og PI, ble cellene analysert på en FACSCalibur strømningscytometer. Dataene ble analysert ved hjelp av FlowJo programvare.
Cell syklus assay.
endometrial kreft celler ble behandlet med SDGE (250 ng /ml eller 2,5 ug /ml) i 24, 48 og 72 h. Etter behandling ble cellene høstet, vasket med PBS og fiksert i 75% etanol, vasket med PBS, og farget med propidiumjodid. Strømningscytometri ble deretter utført for å analysere prøvene i både apoptose og cellesyklusstatus som tidligere beskrevet [35].
Western Blot analyse
etter behandling av cellene med det dampdestillert ekstrakter av ingefær , kreft celler ble vasket med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) og lyseres med RIPA-buffer (Pierce, Rockford, IL) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL). Den totale mengden av protein i lysatet ble bestemt ved å bruke BCA-analyse (Pierce). Cellelysater ble fylt på 25 ug /brønn på en 7,5 eller 12% løsning av polyakrylamidgel og separert ved elektroforese, og deretter ble proteinene overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med 5% melk i Tris-bufret saltvann, og probet med de passende primære antistoffer. Pepperrot konjugert sekundære antistoffer og SuperSignal West Dura lengre varighet substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL) ble brukt for påvisning av proteiner på blotter. Filmene ble skannet med FLUORCHEM 890 og Image J programvare ble brukt til å kvantifisere intensiteter av bandene.
Mitokondriell membranpotensialet analysen
endometrial kreft celler ble dyrket i T25 vevskulturflasker. Eksponentielt voksende celler ble behandlet med 0,025 pg /ml eller 0,25 pg /ml ingefær ekstrakt i 24 timer. Cellene ble deretter vasket og høstet. 1 x 10
6-celler ble tilsatt til hver strømningsrøret fra ubehandlet, 0,025 ug /ml og 0,25 ug /ml ingefær ekstrakt behandlede celler. Cellene ble behandlet med 40 nM DiOC6 ved 37 ° C i 30 minutter. Cellene ble deretter vasket, resuspendert i 400 ul PBS inneholdende 2% FBS og analysert ved FACSCalibur flowcytometer å vurdere mitokondriemembranen Fantastisk potensial.Med data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare.
kalsiumflukssignal Målinger
de Ishikawa celler i loggen vekstfase ble høstet ved hjelp av trypsin. Cellene (1,2 x 10
7) ble vasket tre ganger og suspendert i 1 ml 0,5% bovint serumalbumin (BSA) inneholdende Hanks bufret saltoppløsning som ikke inneholdt noen divalente kationer. Cellene ble lastet med en Indo-AM (2 uM) i nærvær av 4 mM probenecid i 30 minutter ved 37 ° C i 5% CO
2 miljø. Cellene ble deretter vasket og resuspendert i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,5% BSA og 1 mM CaCl
2 til en sluttkonsentrasjon på 2 x 10
6 celler /ml. Cellene ble filtrert gjennom et 35 mikron membranfilter før flowcytometri på LSR-II-cytometer. Celler ble først analysert i 3 minutter for å bestemme grunnlinjen intracellulære kalsiumkonsentrasjon. SDGE (0,025, 0,25 eller 2,5 ug /ml) eller Ionomycin (1 pM anvendt som en positiv kontroll) ble deretter tilsatt til cellene og endringen i Indo-1 fluorescens ble bestemt ved kontinuerlig strømme cellene gjennom flowcytometer for ca 7 min. Data innhentet ble analysert ved hjelp FlowJo programvare.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av GraphPad Prizm programvare. Terskelen for statistisk signifikans er en sannsynlighet på 0,05. Dataene ble analysert ved hjelp av uparet t-test.
Resultater
Isolering av Steam Destillert Utdrag fra Ginger Roots
Eteriske oljer kan enkelt isoleres fra ingefær røtter ved damp destillasjon i en modifisert Clevenger apparat. Vi har vært i stand til å isolere ca 300 mg av essensielle oljer fra 250 g ingefær røtter innhentet fra lokale kommersielle leverandører. Totalt fem grupper av ingefær rotstokker, hver oppnådd fra en kommersiell kilde separat, ble anvendt for å isolere de essensielle oljer ved dampdestillasjon. To av disse fem grupper av ingefær ble hentet fra lokale leverandører i Bhubaneshwar, India og damp destillasjon ble også utført på stedet. De resterende tre grupper av ingefær ble oppnådd fra leverandører i Wisconsin og damp destillasjon av ingefær ble utført i laboratorie- ved University of Wisconsin. Utbyttet av den essensielle oljen var sammenlignbar mellom alle grupper av ingefær røtter brukt i denne studien og tettheten av SDGE var fast bestemt på å være ca 0,87 g /l.
Steam Destillert Ginger Extract er en potent hemmer av livmorkreft Cell Proliferation
de essensielle oljer av ingefær ble først testet for sin effekt på spredning av to livmorkreft (ECC-1 og Ishikawa) cellelinjer. Begge endometrial cancer-cellelinjer var følsomme for SDGE ved en konsentrasjon så lav som 250 ng /ml (figur 1A og B.), Celleformering ble hemmet signifikant (P 0,05) ved 2,5 ug /ml konsentrasjon. Dataene celleproliferasjonsprosesser for begge cellelinjene er vist i fig. 1A og B representerer kumulative data fra eksperimenter utført med SDGE isolert fra tre ulike grupper av ingefær jordstengler. Seksten replikater ble benyttet for hver betingelse testet for hver gruppe med SDGE. Derfor er hvert datapunkt i fig. 1 er et gjennomsnitt av 48 separate målinger og viser bare små variasjoner i målingene, tydelig demonstrere svært reproduserbare effekter av SDGE grupper på spredning av ECC-1 og Ishikawa celler. Analyse av dataene fra proliferasjonsanalyse viste at etter 72 timer endepunktet, IC
50 av SDGE for begge cellelinjer var omtrent 1,25 pg /ml.
Effekt av SDGE på celleformering ble bestemt etter gjennomføre MTT analyser. Den celler Ishikawa (A), og ECC-1 (B) ble inkubert med de viste konsentrasjoner av SDGE for 24, 48 og 72 timer. Optisk tetthet ved 570 nm ble bestemt til å kvantifisere antallet levende celler i kulturene. Control (Con) brønner i alle forsøkene ble behandlet med DMSO, bilen kontroll. Kumulative data for SDGE isolert fra tre ulike grupper av ingefær jordstengler er vist. Hvert datapunkt i alle tall er gjennomsnittet av 48 individuelle avlesninger. Anti-proliferativ effekt produsert av SDGE (2,5 ug /ml) i Ishikawa (C og E) og ECC-1 (D og F) celler som var sammenlignbare med behandling av disse to cellelinjer med stråling (C og D), eller cisplatin (E og F). Cellene ble samtidig behandlet med SDGE og stråling (4 Gy), eller cisplatin (5 uM). MTT-analyser ble utført for å bestemme virkningen av disse behandlingene på proliferasjonen av Ishikawa og ECC-1-cellelinjer. Hver bar i C-F representerer et gjennomsnitt av åtte replikater. * P 0,001,
# p 0,05, og
† p . 0.05 (ikke signifikant)
Kombinert behandling med SDGE og stråling eller Cisplatin Produserer Enhanced Anti-proliferativ effekt
Avansert livmorkreft er behandlet ved hjelp av stråling og kjemoterapi. Vi undersøkte derfor om den kombinerte behandlingen av endometrial kreft celler med SDGE og stråling eller cisplatin produsert en forbedret anti-proliferativ effekt på ECC-1 og Ishikawa celler. Resultatene av MTT-analysen viste at SDGE behandling redusert spredning av de to cellelinjer med 40%, og denne reduksjon i proliferasjon i de ECC-1-celler, var sammenlignbart med det som ble observert i celler som ble behandlet med stråling alene (fig. 1C og D). I tilfelle av Ishikawa-celler, inhibering av proliferasjon produsert av SDGE var omtrent 10% høyere enn den som ble observert med stråling alene (figur 1C.). Endelig, i tilfellet av både ECC-1 og Ishikawa-celler, den kombinerte behandling med SDGE og stråling forsterket inhiberende virkning på proliferasjonen av 23-25% sammenlignet med de celler som ble behandlet bare med stråling (fig. 1C og D) .
Neste vi testet også den kombinerte effekten av SDGE og cisplatin på Ishikawa og ECC-1 celler. MTT-analyser utført etter 72 timer for behandling viste at kombinert behandling med cisplatin og SDGE redusert spredning av Ishikawa-celler ved en ytterligere 26% sammenlignet med cisplatin eneste behandling (fig. 1E). I kontrast, gjorde vi ikke observere ytterligere forbedring i hemming av spredning når ECC-1 celler ble behandlet med en kombinasjon av SDGE og cisplatin (Fig. 1F).
Disse eksperimentene også tillatt oss å gjennomføre en relativ sammenligning av de cytotoksiske effektene av SDGE med de av cisplatin. Når den anvendes som et enkelt middel, cisplatin (5 uM; 1,5 ug /ml) ble redusert spredning av Ishikawa og ECC-1-celler med 59% og 61%, henholdsvis sammenlignet med kontrollen (Fig 1 E og F.). Når SDGE (2,5 ug /ml) ble anvendt som et enkelt middel, inhibering av proliferasjon av Ishikawa og ECC-1-celler var 37% og 42%, respektivt, sammenlignet med kontrollene (fig. 1 E og F). Disse resultatene antydet at i likhet med cisplatin, SDGE var også meget potent ved inhibering endometrial cancer celleproliferasjon, noe som gir sterk begrunnelse for videre studier av mekanismen ved hvilken dette botanisk ekstrakt ble bringer dets anti-kreft effekt.
Inhibering av livmor~~POS=TRUNC spredning via apoptose
MTT analyser indikerte at SDGE var en potent hemmer av spredning av livmorkreft cellelinjer. Den reduserte proliferasjon av endometrial cancer-cellelinjer var et direkte resultat av apoptose indusert i cellene følgende SDGE behandling. SDGE ved konsentrasjoner så lave som 250 ng /ml forårsaket en økning i overflate bindingen av FITC-Annexin V og propidiumjodidfarging som bestemt ved flow-cytometri (fig. 2A). Økning i FITC-Annexin V-positive celler ble observert så tidlig som 30 minutter etter SDGE ble tilsatt til cellekulturene (Fig. 2A). Western blot-analyse bekreftet den økte ekspresjon av caspase 3 i ECC-1 (data ikke vist) og Ishikawa-celler som ble behandlet i 24, 48, og 72 timer med 250 ng /ml konsentrasjon av SDGE (Fig. 2B). Neste vi testet om SDGE ble også indusere cellesyklus arrest i endometrial kreft celler. Ishikawa-celler ble derfor behandlet med 250 ng /ml eller 2,5 ug /ml av SDGE for 24, 48 og 72 timer. Celler ble merket med propidiumjodid og cellesyklusstatus ble målt ved flowcytometri (Fig. 2C). Denne analysen indikerte at SDGE induserte ikke noen større virkning på cellesyklusstatus av cellene. Bare marginal reduksjon ble observert i prosentandelen av celler i S-fasen av cellesyklusen. Men denne reduksjonen ble observert bare når Ishikawa-celler ble behandlet med 2,5 ug /ml. Behandling av cellene med 250 ng /ml fremkalte ikke noen forandring i cellesyklusstatus selv om denne konsentrasjon av SDGE indusert apoptose i kreftcellene.
Ishikawa-celler ble behandlet med 250 ng /ml for SDGE 30 minutter, 2 timer, 4 timer og 16 timer. Etter inkubasjon med SDGE, ble celleoverlevelse bestemt ved merking av celler med FITC-konjugert FITC-Annexin V og propidiumjodid (A). Cellene ble analysert ved strømningscytometri og celledød og apoptose ble identifisert som de hendelser som var positive for enkelt FITC-Annexin V (nedre høyre kvadrant) eller dobbel positiv for både FITC-Annexin V og proidium jodid (øvre høyre kvadrant). SDGE-indusert apoptotisk celledød i endometrial kreft celler ble bekreftet ved å påvise spaltes caspase 3 i Western blot-analyse (B). Det ble observert en økning i spaltede kaspase 3 nivåer når de Ishikawa-celler ble behandlet med SDGE (250 ng /ml) i 0, 24, 48 og 72 timer. Dataene i A og B er representativ for resultatene oppnådd i tre separate forsøk,
Kjemisk sammensetning SDGE
De potente anti-kreft effekt av SDGE bedt oss om å undersøke de potensielle bioaktive komponenter ingefær som sannsynligvis indusere apoptose i livmorkreft cellelinjer. SDGE isolert fra tre separate grupper av ingefær røtter ble analysert ved GC-MS. Ingefær ekstrakt ble fortynnet i pentan og de flyktige komponentene ble separert gjennom en ikke-polar RTX-5MS-kolonne (fig. 3). De individuelle topper som elueres fra kolonnen ble analysert ved elektron ionisering massespektrometri. En analyse av den oppbevaring indekser og massespektra tillot oss å identifisere en total av 22 forbindelsene i den SDGE (tabell 1). Den relative prosentandel av hver av de identifiserte komponenten ble også bestemt i denne analysen. Dataene indikerte at SDGE isolert fra ulike grupper av ingefær rotstokker var sammenlignbare i sine kjemiske bestanddeler.
Tre separate preparater av SDGE, to fra USA (kalt Wisconsin 1 og 2) og en fra India ble separert på en ikke-polar gass-kromatografikolonne. Forbindelsene som skiller på denne kolonnen ble identifisert ved massespektrometri. Forbindelser identifisert gjennom denne analysen sammen med deres relative hopetall er vist i tabell 1.
GC-MS-analyse også ledet oss til å konkludere med at SDGE ikke inneholder betydelige mengder av fenoliske forbindelser, gingerol, shogaol, og paradol som tidligere har blitt identifisert som kreftlegemidler stede i ingefær og løsemiddel ekstrakter av ingefær rotstokker [20], [24], [25], [36]. Denne informasjonen blir støttet av vår observasjon at 6-gingerol ikke hemmer formeringen av Ishikawa og ECC-1-celler, selv når den ble testet ved konsentrasjoner så høye som 150 uM (fig. 4A og B).
MTT-analyser var utført for å bestemme virkningen av 6-gingerol (A og B) og citral (C og D) på proliferasjonen av Ishikawa og ECC-1-celler. Hvert datapunkt er gjennomsnittet av 16 individuelle målinger. Basert på denne informasjonen IC
50 av citral ble beregnet til å være 15-25 mikrometer.
terpenoids var de viktigste komponentene i SDGE identifisert i GC-MS analyse. Neral og geranial er isomerer som er kollektivt referert til som citral. Disse to forbindelser utgjorde omtrent 35-45% av de totale kjemiske komponenter identifisert i vår analyse (tabell 1). I
in vitro
analyser ble det observert at behandling med citral resulterte i en betydelig reduksjon i proliferasjon av Ishikawa og ECC-1-celler. IC
50 for citral for begge cellelinjene var mellom 15-25 mikrometer (Fig. 4C og D). Denne IC
50 konsentrasjon av citral tilsvarer 2,28 til 3,8 ug /ml. Til sammenligning SDGE var effektiv på en IC
50 på 1,25 mg /ml. Siden bare 35-45% av den SDGE er sammensatt av neral pluss geranial, IC
50 konsentrasjon på SDGE tilsvarer bare en 2.8 til 3.7 uM konsentrasjon av citral. Dette nivået av citral er vesentlig lavere enn IC
50 konsentrasjon beregnet for dette middel i våre in vitro assays sprednings (Fig. 4C, D). Derfor konkluderte vi at i tillegg til citral, det er andre bioaktive komponenter som bidrar betydelig til den anti-kreft effekt av SDGE. Derfor gjennomførte vi de mekanistiske studier er oppført nedenfor ved hjelp SDGE istedenfor citral som det bioaktive middel.
SDGE Induserer Kalsium Flux og svekker Mitokondriell membranpotensialet
Behandling av Ishkawa celler med SDGE resulterte i en betydelig tilstrømning i intracellulært kalsium (fig. 5A). Økningen i intracellulært kalsium ble observert ca. 3 minutter etter tilsetning av SDGE. Tidskinetikk og den generelle profil av kalsium-fluks var lik den som ble observert i celler behandlet med ionomycin. Amplituden til kalsium-fluks responsen var avhengig av konsentrasjonen av SDGE. Ved den høyeste konsentrasjon av SDGE testet, den maksimale kalsium-fluks observert var omtrent 60-70% av responsen observert med ionomycin (1 um). Ionomycin induserte en plutselig økning i intracellulære kalsiumnivåer som deretter redusert i løpet av et minutt, men for alle konsentrasjoner av SDGE testet vekst og påfølgende reduksjon i intracellulært kalsium ble relativt langsomt (fig. 5A). Kalsium fluks ble redusert til 5-6 minutter etter tilsetningen av SDGE men nådde ikke nivået før behandling (fig. 5A).
Effekt av SDGE på den intracellulære kalsium-fluks ble bestemt ved å behandle Indo-1 lastet Ishikawa-celler (A) . Umiddelbart etter tilsetning av SDGE til cellesuspensjoner ble Ishikawa-celler strømmet gjennom cytometer og økning i fluorescens ble målt for å påvise kalsium-fluks. Nedgang i mitokondriemembranen potensiale ble oppdaget ved å laste Ishikawa celler med DiOC6 (B). SDGE eller bærerkontroll ble tilsatt til cellene. Etter 24 timers behandling, ble cellene høstet og inkubert med DiOC6 i 15 min. Fluorescens ble målt til å bestemme endringer i mitokondrienes membranpotensiale.
Økning i kalsium og induksjon av apoptose i SDGE behandlet ECC-1 og Ishikawa celler foreslo et underskudd i mitokondrienes funksjon. Måling av mitokondriemembranpotensialet indikerte en 2-gangers reduksjon i Ishikawa-celler som ble behandlet i 24 timer med 25 ng /ml eller 250 ng /ml SDGE (Fig. 5B).
SDGE behandling resulterer i en økning i Bax /BCL-2 Ratio
BCL-2 er en anti-apoptotiske proteiner som forbinder med mitokondrie membran. Avtar i mitokondriemembranen potensial ledet oss til å bestemme effekten av SDGE (250 ng /ml) på BCL-2 uttrykk. I både den ECC-1 (data ikke vist), og de Ishikawa-celler (fig. 6), redusert Bcl-2-ekspresjon ble observert etter 24, 48 og 72 timer behandling med SDGE.
