Abstract
Cleavage og polyadenylation bestemt faktor 4 (CPSF4), et medlem av CPSF komplekse, spiller en nøkkelrolle i mRNA polyadenylering og mRNA 3 «ender modning. Men, det er mulig rolle i lungekreft patogenesen er ukjent. I denne studien undersøkte vi den biologiske rolle og kliniske betydningen av CPSF4 i kreft vekst og overlevelse lunge og belyst dens underliggende molekylære mekanismer. Vi fant at CPSF4 ble sterkt uttrykt i lunge adenokarsinom cellelinjer og svulstvev, men var umulig å oppdage i 8 normale menneskelige vev. Vi fant også at CPSF4 overekspresjon var korrelert med dårlig total overlevelse hos pasienter med lunge adenokarsinomer (
P
0,001). Multivariat overlevelse analyser viste at høyere CPSF4 uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse av pasienter med lunge adenokarsinomer. Undertrykkelse av CPSF4 ved siRNA hemmet lungekreftceller spredning, kolonidannelsen, og induserte apoptose. Mechanism studier avdekket at disse effektene ble oppnådd gjennom samtidig modulering av flere signalveier. Knockdown av CPSF4 ekspresjon av siRNA markert hemmet fosforylering av PI3K, AKT og ERK1 /2 og JNK-proteiner. I motsetning til dette ektopisk ekspresjon av CPSF4 hadde de motsatte virkninger. Videre CPSF4 knockdown også indusert spaltning av caspase-3 og caspse-9-proteiner. Sammen er disse resultatene viser at CPSF4 spiller en avgjørende rolle i å regulere lungekreft celleproliferasjon og overlevelse, og kan være en potensiell prognostisk biomarkør og terapeutisk mål for lunge adenokarsinom
Citation. Chen W, Guo W, Li M, Shi D, Tian Y, Li Z, et al. (2013) oppregulering av Cleavage og polyadenylation Spesifikk Factor 4 i Lung Adenocarcinoma og sin kritiske rolle for Cancer Cell Survival og spredning. PLoS ONE 8 (12): e82728. doi: 10,1371 /journal.pone.0082728
Redaktør: Chunhong Yan, Georgia Regents University, USA
mottatt: 25 september 2013; Godkjent: 05.11.2013; Publisert: 16.12.2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av midler fra Natural Science Foundation of China (81272195, 81071687, 81071687, 81372133) National, Statens «863 Program» of China (SS2012AA020403), Statens «973 Program» of China (2014CB542005), doktorgradsprogrammer Foundation Ministry of Education of China (20110171110077), og staten Key Laboratory of Oncology i Sør-Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt
Innledning
Primær lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en viktig form for lungekreft og dens forekomst har vært økende de siste tiårene. Novel innsikt i biologi NSCLC har bedret resultatet for enkelte pasienter [2], [3], men den 5-års overlevelse for pasienter med NSCLC har ikke blitt kraftig forbedret [4]. Det er derfor et stort behov for ytterligere å forstå de molekylære mekanismene i lungekreft tumorigenesis og for å identifisere nye terapeutiske mål å bedre prognosen for pasienter
Cleavage og polyadenylering Specific Faktor 4 (CPSF4;. Alternativt kjent som CPSF30 eller NEB1) ble opprinnelig oppdaget som en viktig komponent i 3 «enden behandling maskineri av cellulære pre-mRNA. Proteinet er medlem av CPSF komplekset, som ble rapportert å delta mRNA 3 «ender modning og spiller en nøkkelrolle i polyadenylation av mRNA med andre medlemmer av CPSF kompleks [5] – [9]. Det er foreslått at disse mRNA 3 «ender modning faktorer, inkludert CPSF4 kanskje lenker til tumor undertrykkelse [10], [11]. I kontrast til andre studier identifisere at en potensiell onkogen rolle av disse mRNA 3 «ender prosesserings faktorer i flere humane cancere [12] – [15]. I influensa virus-infiserte celler, CPSF4 protein interaksjon med virus NS1 proteiner og hemmes 3»-enden spaltning og polyadenylering av vert pre-mRNA [16]. CPSF4 protein funksjonelt samhandlet med tumor suppressor Cdc73 og regulert transkripsjon av spesifikke genet INTS6 i HeLa celle [10]. Selv om funksjonen til CPSF4 er undersøkt i ulike modellsystemer, dens potensielle rolle i tumorer er ikke ferdig etterforsket på grunn av manglende data vedrørende CPSF4 uttrykk og tumor cellevekst.
I denne studien har vi undersøkt uttrykk og kliniske betydningen av CPSF4 i lunge adenokarsinom og utforsket sine roller og underliggende mekanismer for kreft celle overlevelse og spredning. Vi har vist at CPSF4 er overuttrykt i en undergruppe av lunge-adenokarsinomer, som korrelerer med dårlig total overlevelse. Knockdown av CPSF4 i lunge kreft fører til redusert cellevekst, spredning og økt apoptose i lunge adenokarsinom cellelinjer med høye endogene nivåer av CPSF4. Våre resultater indikerer at CPSF4 kan være en potensiell prognostisk biomarkør og terapeutisk mål for lunge adenokarsinom.
Resultater
CPSF4 er sterkt uttrykt i lunge adenokarsinomer cellelinjer og tumorvev
først undersøkt ekspresjon av CPSF4 protein i lunge adenokarsinomer cellelinjer ved hjelp av Western blotting. De lunge adenokarsinomer cellelinjer uttrykte høye nivåer av CPSF4 proteiner sammenlignet med den HBE (Fig. 1A). Vi har også oppdaget at ekspresjonen av CPSF4 protein i lungevevet adenokarsinomer og 8 normale humane vev (hjerte, lunge, lever, nyre, hjerne, milt, eggstokk, og testis) ved immunhistokjemisk analyse. Som vist i figur 1B, ble en positiv farging av CPSF4 observert i kjernen av lungekreftceller, mens CPSF4 farging ikke kunne påvises i alle 8 normale vev, tyder på at CPSF4 kan være en potensiell biomarkør for lunge adenocarcinomas.
(A) Et uttrykk for CPSF4 i human normal lunge celle HBE og forskjellige lunge adenokarsinom-cellelinjer ble analysert ved hjelp av Western blot. (B) Ekspresjon av CPSF4 i 8 normale, humane vev og lunge adenokarsinom vev ble påvist ved immunhistokjemisk farging. (Forstørrelse x 200). ADC, adenokarsinom.
CPSF4 overekspresjon er assosiert med dårlig prognose av lunge adenokarsinomer pasienter
For å undersøke clinicopathologic betydningen av CPSF4 i lunge adenokarsinomer, vi utført immunhistokjemisk farging på en vev microarray . CPSF4-positiv farging ble observert i kjernen av lungekreftceller, men farging var negativ i tilgrensende ikke-ondartede lunge-vev (fig. 2A og 2B).
(A) Representative eksempler for sterk, moderat svak og negative CPSF4 uttrykk i lunge adenokarsinom vev. Øvre paneler, × 40; nedre paneler, x 400, fra et område av boksen i øvre panel hhv. (B) Sammenligning av ekspresjonsnivåene CPSF4 mellom lunge adenokarsinom vev og tilstøtende ikke-maligne lungevev ved immunhistokjemi i den samme pasient. Representative bilder av sammenkoblede lunge adenokarsinom vev og tilstøtende ikke-maligne lungevev ble vist (forstørrelse x 400). (C) ROC-kurve-analyse ble brukt for å bestemme cut-off stillingen for høy ekspresjon av CPSF4 protein i lunge adenokarsinom vev. Sensitiviteten og spesifisiteten for OS ble plottet;
p
= 0,002. (D) Kaplan-Meier analyse av total overlevelse med høy eller lav CPSF4 uttrykk (
p
0,001, log-rank test). (E) Kaplan-Meier analyse av total overlevelse av mannlige og kvinnelige pasienter med høyt CPSF4 uttrykk (
p
= 0,56).
Å utvikle en rimelig cut-off score på CPSF4 for videre overlevelse analyse, vi utsettes hver IHC poengsum til ROC kurven analyse med hensyn til pasientenes prognose. Som vist i (Fig. 2C), de CPSF4 IHC cut-off score for OS var 5,0. Således, ekspresjon av CPSF4 i hver prøve ble deretter klassifisert som enten høyt nivå (poengsum 5) eller lavt nivå (skår ≤ 5). De clinicopathological egenskapene til de 150 pasienter med lunge adenokarsinomer er vist i tabell 1A. Vi fant at høy CPSF4 uttrykk hastigheten var høyere hos pasienter med senere N-klassifisering (P = 0,033, Chi-Square test) (tabell 1). Det var ingen signifikant sammenheng mellom CPSF4 uttrykk og andre clinicopathologic parametere, slik som pasientens kjønn, alder (≥60 g 60 år), T-klassifisering (P 0,05, tabell 1). Survival analyser viste at høyt uttrykk for CPSF4 signifikant korrelert med kortere total overlevelse tid hos pasienter med lunge adenokarsinomer (P 0,001, log-rank test, Fig. 2D). Survival analyser viste også at det var ingen signifikant forskjell i total overlevelse tid mellom mannlig og kvinnelig pasient med CPSF4 høye nivåer (P = 0,56, log-rank test; Fig 2E.)
Vi har også. brukte en univariat analyse for å vurdere sammenhenger mellom pasientens prognose og flere clinicopathologic faktorer, inkludert CPSF4 uttrykk (høy vs lav), kjønn (menn kontra kvinner), alder (≥60 g 60 år), Pt scenen (tumor størrelse; T3-T4 vs. T1-T2) og pN trinn (lymfeknutemetastase; N2-N3 vs. N0-N1). Alle disse parametre unntatt kjønn og alder var signifikant assosiert med dårlig prognose (tabell 2). Multivariat analyse videre indikert at høy CPSF4 nivå og pN scenen var uavhengige prognostiske faktorer for total overlevelse av pasienter med lunge adenokarsinomer (tabell 2). Alle disse funnene tyder på at CPSF4 kan ha en viktig rolle i å fremme mer aggressiv atferd av lungekreft celler.
CPSF4 knockdown hemmer lunge adenokarsinom celleproliferasjon og overlevelse
For å vurdere om celler som uttrykker høye nivåer av CPSF4 stole på det for å overleve og spredning, transfektert vi siRNA oligonukleotider rettet mot CPSF4 inn H1299 og A549 celler som uttrykker betydelige nivåer av CPSF4. Resultatene viste at de DC-baserte CPSF4 siRNA nanopartikler markert downregulated CPSF4 protein ekspresjon (Fig. 3A), og den knockdown av CPSF4 signifikant inhiberte cellelevedyktighet sammenlignet med transfeksjon med de ikke-spesifikke siRNA grupper ved MTT-analyse (Fig. 3B).
(A) Analyse av CPSF4 uttrykk ved Western blot 3 dager etter siRNA transfeksjon. Mock, kjøretøy kontroll; Kontroll siRNA, uspesifikke siRNA; CPSF4 siRNA-1 og CPSF4 siRNA-2, CPSF4 bestemt siRNA. (B) Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Middelverdien og SD hentet fra tre uavhengige forsøk er plottet (*,
P
0,05, **,
P
0,01). (C) Cellene ble behandlet med CPSF4 siRNA eller kontroll siRNA (50 nmol /L) hver 3. dag, og dyrket i 14 dager; kolonier farget med krystallfiolett ble tellet. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (***,
P
0,001). (D, E) på 3 dager etter siRNA transfeksjon, ble cellesyklus analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av PI farging. Representative data fra tre uavhengige eksperimenter blir vist (D). Prosentandelen av celler i hver fase (E). (F) H1299 og A549 celler ble sådd i kammeret av transwells belagt med Matrigel matrise. Invasivitet av celler ble bestemt ved telles cellene passerer gjennom Matrigel matrise til basalsiden av transwells. * P. 0,05 sammenlignet med ikke-spesifikk kontroll siRNA gruppe
For å bekrefte CPSF4 siRNA-mediert hemming av cellevekst, vi neste utførte kolonidannelse eksperimenter og fant ut at CPSF4 knockdown betydelig redusert kolonidannelse i H1299 og A549-celler (fig. 3C). Etter en veksthemmende virkning ble observert i siCPSF4-transfekterte celler, analyserte vi transfektantene for celle-syklusparametrene ved strømningscytometri. Som vist på fig. 3D og 3E, akkumulering av G1 celler markert økning i CPSF4 siRNA-behandlede gruppen sammenlignet med ikke-spesifikke siRNA kontroller (75% vs. 55% i H1299 og 73% vs. 46% i A549). I tillegg viste vi også at knockdown av CPSF4 av siRNA betydelig hemmet celle invasjon i både H1299 og A549-celler (fig. 3F). Disse resultatene indikerer at knockdown av CPSF4 i lungekreftceller resulterte i en betydelig hemninger i celleproliferasjon og celle invasjon.
CPSF4 knockdown inaktiverer PI3K /AKT og MAPK signale
For å identifisere potensielle molekylære mekanismer der CPSF4 knockdown hemmet lungekreft celle overlevelse og spredning, analyserte vi virksomheten til flere pro-overlevelse proteiner ved Western blot analyse. Resultatene viste at CPSF4 knockdown i begge H1299 og A549-celler dramatisk undertrykket fosforyleringen av PI3K, AKT, ERK1 /2 og JNK-proteiner, men betydelig økt p38-protein-fosforylering (fig. 4A), og dermed føre til en inaktivering av PI3K /AKT og MAPK signalveier.
(A) ved 72 timer etter behandling, siRNA ekspresjon av CPSF4 proteinet og total og fosforylert Akt, PI3K, ERK1 /2, JNK og p38 proteiner i H1299 og A549 ble detektert ved Western blot. GAPDH tjente som lasting kontroll. (B) apoptose i H1299 og A549 ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri 72 timer etter transfeksjon ved bruk av siRNA en Annexin V-FITC /PI-farging kit. De representative data fra tre uavhengige eksperimenter er vist. (C) Apoptose ble beregnet i form av FITC-positive i cellene. Resultater er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (*,
P
0,05). (D) Ved 72 timer etter behandling siRNA, ekspresjon av Bcl-2, spaltet caspase-3 eller 9-proteiner i H1299 og A549 ble påvist ved Western blot. GAPDH ble brukt som kontroll lasting.
CPSF4 knockdown induserer apoptose i lungecancerceller
Vi undersøkte neste effekten av CPSF4 knockdown på apoptose av Annexin V-FITC /PI staining- basert FACS-analyse (fig. 4B). Knockdown av CPSF4 ved siRNA resulterte i en signifikant induksjon av celle apoptose i begge H1299 og A549-celler (fig. 4C). Aktivering av caspases er en viktig begivenhet i apoptose signalveien. Vi har oppdaget at ved virkningen av CPSF4 knockdown på ekspresjon og aktivering av to viktige pro-apoptotiske proteiner: kaspase-3 og kaspase-9, H1299 og A549-celler ved Western blot. Som vist på fig. 4D, CPSF4 knockdown induserte aktiveringen av caspase-3 og -9, noe som resulterer i en markert økning i nivåene av spaltede kaspase-3 og kaspase-spaltede 9 proteiner. Knockdown av CPSF4 også downregulated ekspresjon av Bcl-2, en viktig anti-apoptotiske proteinet, i begge H1299 og A549-celler (fig. 4D) .Dermed Disse resultatene indikerte at CPSF4 kan styre flere aspekter av apoptose signalering.
CPSF4 overekspresjon fremmer lungekreft cellevekst og aktiverer PI3K /AKT og MAPK signale
for å bekrefte rollen CPSF4 i å regulere lungekreft cellevekst via PI3K /AKT og MAPK signalveier videre, ble H1299 celler transfektert med en ekspresjonsvektor som koder for CPSF4 (pcDNA3.1-CPSF4) eller en styrevektor som mangler CPSF4 (pcDNA3.1). Resultatene viste at CPSF4 overekspresjon markant fremmet cellenes levedyktighet (fig. 5A) og kolonidannelse (Fig. 5B) sammenlignet med transfeksjon med kontrollgruppene vektor. For å identifisere de underliggende molekylære mekanismer som CPSF4 ovexexpression økt lungekreft cellevekst, analyserte vi effekten av CPSF4 på aktivering av AKT og MAPK signal av Western blot. Som vist på fig. 5C, CPSF4 ovexexpression markert oppregulert fosforyleringen av PI3K, AKT, ERK1 /2 og JNK-proteiner. Disse resultatene viser derfor at ektopisk ekspresjon av CPSF4 fremmet cellevekst delvis gjennom aktivering av PI3K /AKT og MAPK signalisering i lungekreftceller.
(A) H1299-celler ble transfektert med CPSF uttrykker vektoren, 3 eller 4 dager cellelevedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (*,
P
0,05). (B) H1299-celler ble transfektert med CPSF4 uttrykke vektorer eller kontrollvektor hver 3 dager og dyrket i 8 dager ble kolonier farget med krystallfiolett og tellet. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (*,
P
0,05). (C) H1299-celler ble transfektert med CPSF uttrykker vektoren, ved 72 timer etter transfeksjon, ble ekspresjonen av CPSF4 samt total og fosforylert Akt, PI3K, ERK1 /2 og JNK-proteiner påvist ved Western blot. GAPDH ble brukt som lasting kontroll.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at CPSF4 ble sterkt uttrykt i lunge adenokarsinomer cellelinjer og tumorvev sammenlignet med normal lunge celle og noncancerous lungevev, henholdsvis. Uttrykket av CPSF4 i 8 normale menneskelige vev var mangelfull. Videre clinicopathologic data fra vår vev microarray viste at lunge adenokarsinomer pasienter med høyt uttrykt CPSF4 har kortere overlevelse perioder enn de med CPSF4 lav uttrykk. Multivariat analyse viste at CPSF4 høy uttrykket er en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse av lunge adenokarsinomer pasienter. Resultatene fra våre
in vitro
eksperimenter antydet at CPSF4 utøvde sin onkogene funksjon ved å regulere spredning og apoptose av lunge adenokarcinomceller.
CPSF4 tilhører spalting og polyadenylerings spesifisitet faktor (CPSF) kompleks, hvis andre medlemmer er CPSF160, CPSF100, CPSF73 og Fip1 [17]. Nylig har noen studier fokusert på rollen til noen mRNA 3 «end-prosessering faktorer i kreft, inkludert FIP1L1, CSTF50, CSTF2 og Neo-PAP [11] – [15]. For eksempel, Aragaki og kolleger fant at CSTF2 ble sterkt uttrykt i lungekreft, mens dens uttrykk var knapt synlig i noen av 29 normale menneskelige vev unntatt testikler. Videre knockdown av CSTF2 av siRNA hemmet veksten av lungekreft celler. Enda viktigere, ble CSTF2 overekspresjon assosiert med dårlig prognose for lungekreftpasienter. I denne rapporten gir vi kliniske bevis på at CPSF4 overekspresjon spår dårlig prognose i lunge adenokarsinom pasienter. Undertrykkelse av CPSF4 ekspresjon hemmet veksten av lungekreftceller
in vitro.
Betydelig prognostisk verdi av CPSF4 kan forklares ved dets funksjon av pro-overlevelse hos lungekreftceller. Det er fortsatt ukjent hvorfor CPSF4 ble overuttrykt i lungekreftceller; imidlertid basert på funnene i denne studien, tror vi at CPSF4 kan være en potensiell diagnostiske og /eller terapeutiske mål i lunge adenokarsinomer.
I denne studien, observerte vi at siRNA-mediert CPSF4 knockdown hemmet cellevekst og induserte apoptose i lungekreftceller som uttrykker høye nivåer av CPSF4. For å undersøke understrek molekylære mekanismer, undersøkte vi PI3K /AKT, MAPK og apoptose signalveier endring. Inaktivering av PI3K /AKT, MAPK signalveier ved CPSF4 knockdown, som indikert ved undertrykt fosforyleringen av PI3K, AKT, ERK1 /2 og JNK, ble observert i lungecancercellelinjer. De PI3K /AKT og MAPK banene er involvert i en rekke forskjellige cellulære prosesser som vekst, proliferasjon, differensiering, transkripsjonen regulering, og utvikling [18], [19]. Disse to signalveier er aktivert i lungekreft og er blitt identifisert som nye mål for terapi [20] – [22]. Således CPSF4 kan utøve sin vekstregulerende virkning, i det minste delvis, ved å modulere PI3K /AKT og MAPK signalveier i lungekreftceller. Selv om ytterligere detaljerte analyser er nødvendig for å bestemme de direkte målene for CPSF4, funnene i denne studien innebærer den biologiske betydningen av CPSF4 i å regulere lungekreft celle vekst og overlevelse. Dermed våre resultater gir en begrunnelse for farmakologisk undersøkelse av CPSF4 som en potensiell ny terapeutisk mål i lungekreft.
I sammendraget, ble CPSF4 sterkt uttrykt i lungekreftcellelinjer og tumorvev og positivt korrelert med dårlig prognose av pasienter med lunge adenokarsinomer. Knockdown av CPSF4 ekspresjon av siRNA signifikant hemmet cellevekst og induserte apoptose i lunge adenokarsinom-cellelinjer ved samtidig inaktivering av PI3K /AKT og MAPK signalering og aktivering av kaspase-avhengige apoptotiske reaksjonsveier. I motsetning til dette ektopisk ekspresjon av CPSF4 hadde de motsatte virkninger. Disse resultatene indikerer derfor at CPSF4 spiller en viktig rolle i reguleringen av vekst og overlevelse av lunge adenokarsinom celler og kan være en potensiell terapeutisk mål for lungekreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av etikkomiteen av Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center. Alle prøver som brukes i denne studien var anonymt og samlet inn fra pasienter for rutinemessig patologi bruk. Ingen informert samtykke (skriftlig eller muntlig) ble oppnådd for bruk av retrospektive vevsprøver fra pasienter i denne studien, siden de fleste av pasientene var døde og informert samtykke ble ikke ansett som nødvendig og frafalt av etikkomiteen.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
human NSCLC-cellelinjer (H1299, A549, H1975, H1437) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad , CA), supplert med 10% føtalt bovint serum. Normal human bronkiale epitel (HBE) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum. Celler ble holdt i en fuktig atmosfære og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Western blot-analyse
Cellelysater ble separert ved elektroforese i 8-12% natrumdodecylsulfatpolyakrylamidgel polyakrylamid minigel gradient (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) og elektroforetisk overført til en nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western blot ble analysert med antistoffer mot CPSF4 (Proteintech Group, Inc., Chicago, USA), fosfor-PI3K P85 (Tyr458) /p55 (Tyr199), PI3K, fosfor-Akt (Ser473), Akt, pTyr202 /Y204-ERK1 /2, ERK1 /2, pThr183 /Tyr185-SAPK /JNK, SAPK /JNK, kløyvde caspase-3, kløyvde caspase-9 og GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) .De proteinbånd ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)
Lung adenokarsinomer vevet microarray
tissue microarray (diameter, 1,5 mm;. dybde, 4 mikrometer) som brukes for farging analyse av CPSF4 protein uttrykk ble kjøpt fra Shanghai overgå Biotech (Shanghai, Kina, https://www.superchip.com.cn/). Den microarray besto av 150 formalinfikserte, parafininnstøpte lunge adenokarsinomer og tilsvarende tilstøtende ikke-ondartet lungevevet. Disse vevsprøver hadde blitt oppnådd fra pasienter som ikke har noen anticancer-behandling før tumorreseksjon. Vevsprøvene ble histologisk undersøkt og klassifisert med 2004 World Health Organization klassifiseringssystemet [23]. Detaljert klinisk og patologisk informasjon, herunder klinisk og patologisk tumor node-metastaser (TNM) scenen og total overlevelse (OS) varighet var tilgjengelig for alle tilfeller. Den patologisk TNM status av alle lungekreft adenokarsinomer ble vurdert i henhold til kriteriene i sju utgaven av det amerikanske Joint Committee on Cancer (2010).
Immunohistochemistry (IHC) og histologisk evaluering
Immunohistochemistry var utført ved bruk Envisionþ Sett /HRP (DakoCytomation). I korte trekk, ble objektglass neddykket i Target Retrieval løsning (pH 9; DakoCytomation) og kokt ved 108 ° C i 15 minutter i en autoklav for antigen gjenfinning. CPSF4 antistoff (1:50 fortynning) ble tilsatt til hvert objektglass etter blokkering av endogen peroksidase og proteiner, og snittene ble inkubert med HRP-merket anti-kanin-IgG [Histofine Simple Stain MAX PO (G); Nichirei] som det sekundære antistoff. Substrat-chromogenwas tilsatt, og prøvene ble motfarget med hematoksylin. En negativ kontroll ble oppnådd ved å erstatte det primære antistoff med en normal kanin IgG.
De immunoreaksjoner ble bedømt uavhengig av to patologer blindet til den clinicopathologic informasjonen. Nuclear fargeintensitet ble kategorisert: fraværende flekker som 0, svak som en moderat som 2, og sterk som 3. Prosentandelen av fargede celler ble åpnet ved hjelp av en fem-skala scoring system: 0 (ingen positive celler), 1 ( 25% positive celler), 2 (25% -50% positive celler), 3 (50% -75% positive celler), og 4 (mer enn 75% positive celler). At resultatet for hvert vev ble beregnet ved å multiplisere den intensitet og den prosentvise verdien (rekkevidden av denne beregningen var derfor 0-12). Mottakeren arbeidskarakteristikken (ROC) kurve analyse ble anvendt for å bestemme stillingen cutoff for tumor «høy ekspresjon» av en 0, 1-kriteriet. I korthet, sensitiviteten og spesifisiteten for pasienten utfallet blir studert ved hver resultatet ble plottet for å generere en ROC-kurve. Stillingen ble valgt som grenseverdi, som var nærmest poenget med både maksimal sensitivitet og spesifisitet. Svulster utpekt som «lav uttrykket» for CPSF4 var de med score under eller lik verdi cutoff, mens «high uttrykket» svulster var de med score over verdien. For å lette ROC kurven analyse ble clinicopathologic funksjoner dikotomisert. Overlevelse status (død på grunn av lunge adenokarsinomer versus sensurert)
Utarbeidelse av DC nanopartikler og innkapsling siRNA
DOTAP-kolesterol (DC) var kjøpt fra Avanti Polar-lipider Inc. (Birmingham, AL, USA). HPLC-grade kloroform ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA) .De nanopartikler ble utarbeidet av en EmulsiFlex-B3 høytrykks homogenisator (HPH) (Avestin Inc., Ottawa, Canada) [24], [25]. De nanosomes ble holdt ved romtemperatur i 1 time før lagring over natten ved 4 ° C.
CPSF4 siRNA og uspesifikke siRNA ble kjøpt fra Shanghai GenePharma Co. (Shanghai Kina). Sekvensene av humane CPSF4 spesifikke siRNA var 5′-CAU GCA CCC UCG AUU UGA ATT-3 «(siRNA-1) og 5′-GGU CAC CUG UUA CAA GUG UTT -3′ (siRNA-2); uspesifikke siRNA, 5»-UUC UCC GAA CGU HiG ACG UTT-3 «. Den CPSF4 overekspresjon vektorer pcDNA3.1-CPSF4 og kontrollvektor pcDNA3.1 ble utformet og syntetisert av Cyagen (Cyagen Biosciences Inc., USA). For levering av CPSF4 siRNA eller CPSF4 uttrykke vektoren inn lungekreft celler ble siRNA eller plasmid vektor innkapslet i DC nanosomes som hadde validert tidligere [26] -. [28]
Cell spredning og kolonidannelse analysen
Celleproliferasjon ble vurdert ved anvendelse av MTT-analysen (Promega) ifølge produsentens protokoll. Celleviabilitet ble bestemt etter transfeksjon med CPSF4 siRNA eller CPSF4 uttrykker vektorer. Ved 48 timer etter behandling, ble celler (H1299 og A549) høstet, tellet, og enkeltceller podet (400 celler /brønn) i triplikat i 6-brønns plater. Cellene ble behandlet med CPSF4 uttrykker vektorer eller CPSF4 siRNA hver 3 dager og dyrket i 8-14 dager [29]; Koloniene ble farget med krystallfiolett i 10 minutter ved romtemperatur. Kolonier som inneholdt mer enn 50 celler ble talt opp.
In vitro invasjonen assay
in vitro
invasjonen kammer analysen ble gjennomført med Millicell Cell Culture Sett (24-brønns PCF 8,0 mL, Millipore). Kort sagt ble innsatsene som står i 24-brønners cellekulturplate belagt med 100 ul 1 mg /ml Matrigel-matrise (BD Falcon, USA) i serumfritt RPMI-1640 medium og lufttørket. 48 timer etter CPSF4 siRNA behandling,-celler (H1299 og A549) ble høstet, telt, og 100 ul serumfritt medium inneholdende 5 x 10
4-celler ble tilsatt til innsatsen. Det nedre kammer inneholdt 0,5 ml RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS. Dette følger inkubasjon i 5% CO
2 ved 37% i 24 timer. Deretter fiksert vi cellene som trenger gjennom membranen inn i den nedre siden med formalin og disse cellene ble farget med krystallfiolett. Invasivitet av cellene ble bestemt ved å telle de penetrerer cellene på den nedre siden av filteret gjennom porene under et mikroskop ved forstørrelse X100. Vi har analysert 3 ganger og tilfeldig valgt 3. felter ble tellet for hver analyse.
apoptose og cellesyklusanalyse
For deteksjon av apoptose og cellesyklus,-celler (H1299 og A549) transfektert med siRNA var analysert ved hjelp av strømningscytometri. Ved 72 timer etter transfeksjon,-celler (1 x 10
5-celler /ml) ble merket med 5 ul AnnexinV-FITC og 5 ul PI (propidiumjodid) ved hjelp av en Annexin V-FITC /PI-farging sett (Becton Dickinson, CA, USA) som er lagt på romtemperatur i 15 minutter i mørke, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri (EPICS XL; Beckman Coulter). Apoptose ble beregnet i form av FITC-positive i cellene. Cellesyklus analyse ble utført ved hjelp av PI farging. De transfekterte celler ble høstet med trypsinering, fiksert i 70% kald etanol i 30 minutter. Etter behandling med 100 mg /ml RNase (Sigma-Aldrich), ble cellene farget med 50 mg /ml PI (Sigma Aldrich) i PBS. Flowcytometri (EPICS XL, Beckman Coulter) ble utført umiddelbart. Rådata ble analysert ved hjelp av Multicycle for Windows (Beckman Coulter).
Statistisk analyse
t-test ble brukt til å sammenligne to uavhengige grupper av data. Median immunhistokjemisk farging resultatet ble anvendt som verdi cutoff å dele pasientene i lave og høye CPSF4 uttrykk grupper. Khikvadrattester ble anvendt for å analysere forholdet mellom CPSF4 ekspresjon og clinicopathologic status. Kaplan-Meier levninger ble plottet og log-rank testene ble utført. Univariate og multivariate analyser ble gjort med Cox proporsjonale hazard regresjonsmodell å bestemme sammenhengen mellom clinicopathologic variabler og kreft relatert dødelighet. En
P
verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant i alle tilfeller
