Abstract
Fedme overfører en økt risiko for å utvikle spesifikke kreftformer. Selv om mekanismene er uklare, økt fett celle sekresjon av bestemte proteiner (adipokines) kan fremme /tilrettelegge for utvikling av ondartede svulster i fedme via krysstale mellom fettvev (e) og vev utsatt for å utvikle kreft blant overvektige. Vi har søkt etter nye adipokines som ble overuttrykt i fettvev av overvektige pasienter så vel som i tumor-celler avledet fra krefttyper som vanligvis forbundet med fedme. For dette formål ekspresjon av data fra humant fettvev av overvektige og ikke-fete, så vel som fra et stort panel av humane kreftcellelinjer og tilsvarende primære celler og vev ble undersøkt. Vi fant uttrykk for ceruloplasmin å bli den mest beriket i fedme-relaterte kreftceller. Dette genet var også signifikant oppregulert i fettvev av overvektige pasienter. Ceruloplasmin er kroppens viktigste kobber bærer og er involvert i angiogenese. Vi viser at ceruloplasmin er en ny adipokin, som er produsert og utskilt ved økte priser på fedme. I den overvektige tilstand, fettvev bidratt betydelig (opptil 22%) til den totale sirkulerende proteinnivå. Oppsummert har vi gjennom bioinformatiske screening identifisert ceruloplasmin som en roman adipokin med økt uttrykk i fettvev av overvektige pasienter, så vel som i celler fra fedme-assosiert kreft. Hvorvidt det er en årsakssammenheng mellom adipose overekspresjon av ceruloplasmin og kreftutvikling i fedme kan ikke besvares av disse tverrsnitts sammenligninger
Citation. Arner E, Forrest ARR, Ehrlund A, Mejhert N, Itoh M, Kawaji H, et al. (2014) ceruloplasmin er en roman adipokin Hvilken er overuttrykt i fettvev av overvektige pasienter og i fedme-Associated kreftceller. PLoS ONE 9 (3): e80274. doi: 10,1371 /journal.pone.0080274
Redaktør: Qiong Wu, Harbin Institute of Technology, Kina
mottatt: 9 juli 2013; Godkjent: 11 oktober 2013; Publisert: 27 mars 2014
Copyright: © 2014 Arner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. FANTOM5 var gjort mulig av en stipend for Riken omics Science Center fra MEXT til Yoshihide Hayashizaki og Grant av Research Program of Innovative Cell Biology av Innovative Technology (Cell Innovation Program) fra MEXT, Japan til Yoshihide Hayashizaki. Denne studien ble også støttet med tilskudd fra Vetenskapsrådet og den svenske Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er en verdensomspennende økningen i fedme prevalens og fedme og dets komorbiditet har blitt et stort helseproblem i de fleste land [1]. Fedme-assosiert kreft har nylig fått mye oppmerksomhet. The World Cancer Research Fund konkluderte i 2007 at fedme er overbevisende forbundet med økt risiko for bukspyttkjertel, (postmenopausal) bryst, livmor og nyrekreft [2]. Disse konklusjonene ble senere bekreftet og utvidet i en fersk meta-analyse av prospektive studier som vurderer kreftrisikoen forbundet med ≥ 5 kg /m
2 øker i body mass index (BMI) [3]. Den sterkeste risiko (odds ratio ≥1.30) ble observert for nyrekreft og oesophagal adenokarsinom i begge kjønn, for skjoldbruskkjertelkreft hos menn og for livmor og galleblæren kreft hos kvinner.
De mekanismer som kobler fedme til kreft er dårlig forstått selv om flere teorier har blitt lagt frem [4], [5], [6], [7], [8]. Gitt at fettvev utgjør kroppens største endokrine organ, sekresjon hundrevis av peptid signaler kollektivt betegnet adipokines, og at adipokin sekresjon er betydelig forstyrret i fedme, er en attraktiv hypotesen om at adipose-avledet signaler til andre vev kan være involvert i kreftutvikling. De to mest grundig undersøkte adipokines, adiponectin og leptin, har i virkeligheten vært knyttet til utviklingen av ondartede svulster gjennom deres virkning på beslektede reseptorer påvirker insulinsensitivitet og /eller aktivering av kreftassosiert signale [4]. Videre er det flere adipokines er vekstfaktorer som kan tjene som direkte signaler til tumorer [9]. Disse så vel som andre, ikke ennå oppdaget adipokines, kan derfor ha kreft-fremme egenskaper.
I denne studien har vi som mål å finne nye humane adipokines som kan være forbundet med fedme-assosiert kreft. For å oppnå dette, hentet vi data fra de nye FANTOM5 uttrykk atlas, som gir en enestående dekning av menneskelig vev, primære celler og kreftcellelinjer [10]. Vi fokuserte på kreftcellelinjer avledet fra ondartede svulster som har den sterkeste assosiasjon med fedme (odds ratio ≥1.3 i begge kjønn) i henhold til Renehan et al [3]. Antatte nye adipokines av potensiell relevans for fedme-assosiert kreft ble identifisert ved å sammenligne transkriptom beriket både kreftceller og obese fettvev. Dette ble gjort ved å kombinere de FANTOM5 uttrykk atlas data med en nylig publisert studie av genuttrykk i fettvev fra en stor kohort av overvektige og ikke-overvektige kvinner [11].
Dette arbeidet er en del av FANTOM5 prosjektet . Datanedlasting, genomiske verktøy og co-publisert manuskripter er oppsummert her https://fantom.gsc.riken.jp/5/.
Metoder
Fag og fettvev
Alle fag ble informert i detalj om studiet og skriftlig informert samtykke ble innhentet. Studiene ble godkjent av komiteen for etikk ved Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige. Tre forskjellige årskull av forsøkspersonene ble brukt i studien. I det første kullet, som er beskrevet tidligere [11], subkutant fettvev ble innhentet fra 26 ikke-overvektige og 30 overvektige kvinner. Fedme er definert som BMI 30 kg /m
2 eller nyere. RNA ble ekstrahert og underkastet en global ekspresjon microarray som beskrevet [11]. De genuttrykk data har blitt deponert i National Center for Biotechnology Gene Expression Omnibus (tiltredelse antall GSE25402). Protokollen tall fra Committee of Ethics er 592/03 (godkjent en
st desember 2003).
I det andre kullet, ble subkutant fettvev oppnås ved kosmetisk fettsuging og brukes til å eksperimentelt identifisere nye adipokines . Ni kvinner ble undersøkt. Alt var ikke-overvektige og sunt i henhold til selvrapportering. Verdier (gjennomsnitt ± SD) for alder og BMI var 45 ± 13 år og 27,4 ± 1,2 kg /m
2. Vevet ble utsatt for kollagenase fordøyelse og stroma-vaskulære porsjon ble differensiert til fettceller i kultur som beskrevet [11]. For proteinbestemmelse i kondisjonert medium, ble alikvoter fjernet 4, 8 og 12 dager etter starten av differensieringen. Protokollen tall fra Committee of Ethics er 2009 /1881-1831 /1 (godkjent 14
th av januar 2010).
I det tredje kullet, fettvev sekresjon av proteiner og deres plasmanivået ble bestemt . Twenty vektige (alder 46 ± 6 år, gjennomsnitt ± SD) og 19 ikke-overvektige friske kvinner (alder 47 ± 9 år) ble undersøkt i morgen etter en natts faste. Den overvektige var planlagt for fedmekirurgi. Seven var sunt, 10 hadde hypertensjon og tre hadde type 2-diabetes som behandles med orale midler. Totalt kroppsfett ble bestemt av dual x-ray absorpsjonsmetri (62 ± 10 kg i vektige og 24 ± 8 kg i ikke-overvektige). Deretter ble en venøs plasmaprøve ble oppnådd for bestemmelse av sirkulerende proteinnivåer. Til slutt ble fettvev erholdt ved en subkutan abdominal biopsi som beskrevet [11], [12]. En del av fettvev prøven ble underkastet
in vitro
inkubering i 2 timer og kondisjonert medium ble brukt for proteinbestemmelse som beskrevet [12]. Den annen del ble utsatt for kollagenase behandling og isolerte fettceller ble oppnådd for bestemmelse av fettcellestørrelse og volum som beskrevet [13]. Proteinsekresjon var relatert til antall fettceller i vev inkubert prøven og til den totale mengden av kroppsfett. I det sistnevnte tilfellet ble proteinsekresjon relatert til mengden av lipider i den inkuberte vev, og denne verdien ble multiplisert med den totale kroppsfett vekt som beskrevet [12]. Protokollen tall fra Committee of Ethics er 2005 /1441-1432 (godkjent en
st februar 2006).
Protein tiltak
ceruloplasmin og osteopontin ble målt av kommersielle ELISA kits ( . Abcam, Cambridge, UK)
fett~~POS=TRUNC bidrag til total ceruloplasmin produksjon
for å beregne bidraget fra fettvev-avledet ceruloplasmin til sirkulasjonen er følgende forutsetninger lagt til grunn: (a) ceruloplasmin sekresjon fra adipose tissue ruger
in vitro
er lik i forskjellige adipose regioner og gjenspeiler
in vivo
sekresjon. (B) ceruloplasmin er jevnt fordelt i vannet plass som er 0,530 l /kg kroppsvekt i ikke-overvektige og 0,465 l /kg kroppsvekt hos overvektige individer [14]. (C) plasmanivået av ceruloplasmin om morgenen reflekterer samlede 24 timers nivåer, og halveringstiden for proteinet er 5,5 dager, [15]. Basert på disse forutsetningene, ble totalt ceruloplasmin produksjon per time beregnet som: (målt plasmanivå x 5,5 x total kroppsvæske) delt på 24. Totalt adipose sekresjon per time måles sekresjon per lipid vekt av fettvev per time ganger totalt kroppsfett . Fra disse verdiene prosentandelen av fettvev bidrag til ceruloplasmin produksjon kan beregnes.
kreft og kontrollprøver
Basert på Renehan et al [3], identifiserte vi følgende kreftcellelinjer i Fantom 5 datasett som er avledet fra tumortyper knyttet til fedme og som har en odds ratio ≥1.30 i menn, kvinner eller begge deler. Uterus: endometrial stromal sarkom cellelinje (OMC-9), endometrial carcinoma cellelinje (OMC-2), endometrioid adenokarsinom-cellelinje (JHUEM-1), klare celle carcinoma cellelinje (TEN); Nyre: renal cell carcinoma cellelinje (OS-RC-2), renal cell carcinoma cellelinje (TUHR10TKB); Galleblæren: galleblære carcinoma cellelinje (TGBC2TKB), galleblære carcinoma cellelinje (TGBC14TKB); Skjoldbrusk: thyroid karsinom cellelinje (TCO-1), thyroid karsinom cellelinje (KHM-5 M), papillær adenokarsinom-cellelinje (8505C). Som kontrollprøver vi brukte følgende vev og primære celleprøver. Livmor: voksen og fosterets vev; Nyre: voksen og fosterets vev, Nedsatt kortikal Epitelceller (to donorer), Nedsatt Epitelceller (tre donorer), Nedsatt Glomerular endotelceller (tre donorer), nyre mesangialceller (tre donorer), proksimale nyretubuli epitelceller (tre givere) ; Galleblæren: voksent vev; Thyroid. Voksen og fosterets vev
Identifisering av nye kreftrelaterte adipokin kandidater
Gene uttrykk i FANTOM5 databasen ble beregnet som normalisert tag count (tags per million, TPM) i et 1 kb vindu rundt RefSeq [16] transkripsjonsstartsider. Gener ble identifisert som kandidater om de ble uttrykt på et funksjonelt signifikant nivå (her definert som 10 TPM eller høyere) og beriket minst to ganger i de ovennevnte kreftcellelinjer i forhold til alle cellelinjer som er tilgjengelige i FANTOM5, mens du ikke er beriket blant de tilsvarende vev eller primære celler. Berikelse ble beregnet som beskrevet i [17] med p-verdier korrigert for multippel testing med Benjamini-Hochberg metoden [18]. Kandidat gener ble beholdt hvis de var signifikant oppregulert ved 5% FDR i fettvev av fete personer i henhold til en tidligere studie [11]. Bruke FANTOM5 uttrykk databasen, kreves vi minst 10 TPM CAGE genuttrykk over en reseptor locus i en eller flere fedme assosiert kreft cellelinjer for å beholde den for videre etterforskning.
Statistisk analyse
Verdier er gjennomsnitt ± standard feil. De ble sammenlignet ved variansanalyse (gjentatt tiltak), uparet t-test og lineær regresjonsanalyse.
Resultatene
Første analyse av den FANTOM 5 data base [10], og den publiserte fettvev matrisen [11] identifiseres 700 gener som var signifikant uttrykt (≥10 TPM) og minst to-ganger anriket med hensyn til en kreftcellelinje av interesse, men ikke anriket på de tilsvarende vev eller primærceller, og oppregulert i fettvev overvektige. Det var ikke mulig å utføre en detaljert analyse av alle identifiserte gener eller for å finne ut hvilke av dem som faktisk ble utskilt fra fettcellene. Derfor har vi videre begrenset listen ved å begrense ekspresjon i den aktuelle kreftcellelinje for å ≥100 TPM (et høyt ekspresjonsnivå), minst fem gangers anrikning i kreftcellelinje sammenlignet med tilsvarende friskt vev /celle, og i det minste to -gangers oppregulering i fettvev i fedme. Bare to gener møtt disse strengere kriterier, nemlig ceruloplasmin (geneID:
CP
) og osteopontin (geneID:
SPP1
). Overraskende, begge kodede proteiner tilstede i blodsirkulasjonen, og ble derfor ansett som mulige adipokines. Vi undersøkte om ceruloplasmin og osteopontin var aktivt utskilt fra fettcellene ved å avgjøre om det var en tidsavhengig utslipp i media. Mens osteopontin var ikke påvisbar i inkubasjonsmediet (kurve ikke vist), ceruloplasmin ble faktisk kommet i en tidsavhengig måte i differensierte adipocytter (Fig. 1a). Derfor, selv om osteopontin mRNA uttrykkes i fettvev ifølge microarray, og blir oppregulert i fedme [11], det kodede proteinet synes ikke å bli utskilt fra fettceller som antyder at osteopontin er ikke en adipokin. Påvirkningen av fedme på plasmanivåer og sekresjon av ceruloplasmin fra subkutane fettvev ble også undersøkt (fig 1 b-d). Plasmanivåer og adipose sekresjon ble betydelig økt i prøver fra overvektige pasienter. Det var en sterk positiv sammenheng mellom sirkulerende og adipose-utskilt ceruloplasmin. Faktisk, den sistnevnte forklarte 45% av den inter-individuell variasjon i plasma ceruloplasmin (justert r
2), som var uavhengig av BMI (delvis r = 0,36; p = 0,026) eller kroppsfett (delvis r = 0,44; p = 0,007). Bidraget av fettvev til total ceruloplasmin produksjon ble bestemt som beskrevet i Metoder og ble anslått til å være 13 ± 5% i ikke-overvektige og 22 ± 6% hos overvektige (p 0,0001).
A. Sekresjon under differensiering av stamceller til fettceller. Data analyseres ved hjelp av ANOVA, gjentatte målinger. B og C. Virkning av fedme på plasmanivåer og sekresjon fra fettvev som analyseres med uparede t-test. D. Forholdet mellom skilles ceruloplasmin og sine plasmanivåer som analyseres med lineær regresjon.
Vi undersøkt videre uttrykk mønster av
CP
i humane kreftceller. Figur 2 viser den genomiske plasseringen av
CP plakater (figur 2a, b), fordelingen av promoter-aktivitet som målt ved hjelp av hetten analyse genekspresjon (merd, figur 2c) og
CP
uttrykk på tvers av en bredt panel av kreft celletyper sortert etter uttrykksnivå (figur 2d). Spesielt, kreftcellen tråd med det høyeste uttrykk for
CP
er en klar cellekreft fra endometrium (Fig 2d, top solid pil). Andre fedme-assosiert kreft (nyre, endometrial) også vise relativt høy
CP
uttrykk (fig 2d, solide piler). Lever kreft var ikke inkludert i denne studien fordi den ikke oppfyller våre kriterier for fedme /kreft foreningen odds ratio på 1,30 eller mer; Likevel er det interessant å merke seg at det er forbundet med fedme hos menn når man bruker litt mindre strenge kriterier (odds ratio = 1,24 i referanse [3]) og at flere leverkreft cellelinjer er blant de med høyest
CP
uttrykk (fig 2d, ødelagte piler). Blant de ni kreftcellelinjer med høyest
CP
uttrykk, syv ble forbundet med fedme.
A. CP ligger på den negative (lilla) strand av kromosom 3 i posisjon 3q23-Q25, flankert av HPS3 på den positive (grønn) strand og CPHL1 på det negative strand. B. RefSeq mRNA modeller av locus. C. promoteraktivitet signalfordeling som målt ved buret i locus. Flertallet av ekspresjon kommer fra 5′-enden av CP. D. Expression (tags per million, TPM) over locus for cellelinjene som finnes i FANTOM5. Cellelinjer med uttrykket ovenfor 10 TPM er vist her; totalt 269 cellelinjer ble profilert. Fedme er forbundet cellelinjer er angitt med svart (OR = 1,30) og grå (OR = 1,20). Pilene
Diskusjoner
I denne studien tok vi en systematisk tilnærming for å identifisere nye adipokines som var assosiert med fedme og fedmerelaterte kreftformer ved å sammenligne ekspresjon av alle fedme-induserte gener i fettvev med gener anriket på alle kreftcellelinjer som inngår i FANTOM5 studien. Bruke heller strenge kriterier valg, bare to gener scoret svært høyt i denne sammenligningen. I teorien kan disse gener er kodet utskilt så vel som ikke-utskilte proteiner med en hvilken som helst type funksjon. Men det viste seg at både gener kodet sirkulasjons proteiner, nemlig osteopontin og ceruloplasmin. Osteopontin ikke kunne defineres som en adipokin (protein utskilt fra fettcellene) i henhold til våre funn. I motsetning til dette, ceruloplasmin oppfylte kriteriene for en sann adipokin, dvs. at den blir utskilt i en tidsavhengig måte. Dessuten, siden det ikke er inkludert i den publiserte secretome for menneskefettceller, anser vi det som en roman adipokin [9]. Imidlertid kan denne studien ikke fastslå om det er et tilfeldig forhold mellom ceruloplasmin og fedme-assosiert kreft, og videre studier er nødvendig for å fastslå i hvilken grad, hvis noen, ceruloplasmin avledet fra adipocytter eller tumorceller spiller en funksjonell rolle i veksten av kreft vev. Likevel kan vi si at
CP
er overuttrykt i obese fettvev og i kreftcellene som er forbundet med fedme.
ceruloplasmin i sirkulasjon antas å være primært produsert av leveren [15], [19]. Men dagens data tyder på en hittil ukjent medvirkende rolle fettvev. I tråd med tidligere funn [20], [21], de sirkulerende nivåene ble økt i fedme. Videre adipose sekresjon ble markert økt i obese versus ikke-overvektige pasienter. Våre anslag tyder på at fettvev i fedme bidrar med inntil 22% til de sirkulerende nivåer av ceruloplasmin og dette sekresjon forklart så mye som 45% av den inter-individuell variasjon i plasma ceruloplasmin i både ikke overvektige og overvektige pasienter. Forholdet mellom sirkulerende og adipose-utskilt ceruloplasmin var uavhengig av BMI eller body fettmasse. Det bør understrekes at den estimerte
in vivo
verdiene beregnes basert på
in vitro
resultater som kan være forskjellige fra de som
in vivo
. Videre kan resultatene være kjønn partisk siden adipose tissue microarray data som brukes her var fra kvinner, mens forutsetninger om ceruloplasmin distribusjon ble delvis basert på en tidligere studie hos menn [14]. Faktisk, selv om vi målt ceruloplasmin sekresjon i fettvev fra kvinner, brukte vi mannlige data for hele kroppen vann [14] siden de sistnevnte verdier ble oppnådd ved hjelp av en state-of-the-art teknikk. Men total kroppsvæske verdier for kvinner målt med mindre nøyaktige biompedance metode er sammenlignbare med de som brukes i våre nåværende beregninger, nemlig 0,527 ± 0,04, 0,472 ± 0,03, og 0,426 ± 0,028 l /kg kroppsvekt i lean, overvekt og fedme kvinner, henholdsvis [22].
Til slutt, vår studie undersøkte bare subkutant fettvev. Siden uttrykk og sekresjon av enkelte adipokines er forskjellig regulert i ulike fettdepoter [23], vet vi ikke om ceruloplasmin uttrykt og frigjøres fra andre depoter kan vise andre sammenhenger med fedme. På den annen side, er subkutan adipose tissue langt kroppens største fett depot og derfor kvantitativt den viktigste determinant av sirkulerende adipokin nivåer.
I sammendrag, ved bioinformatically å utføre en systematisk screening for gener overuttrykt i fedme forbundet kreftformer denne studien identifisert ceruloplasmin som en roman menneskelig adipokin. Dens sekresjon og uttrykk er økt i fedme og adipose ceruloplasmin er en stor bidragsyter til det sirkulerende ceruloplasmin nivå.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Liste over FANTOM5 medlemmene av konsortiet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0080274.s001 plakater (docx)
Takk
Vi vil gjerne takke alle medlemmer av den FANTOM5 konsortium for å bidra til generasjon av prøver og analyser av datasettet og takke Genas for dataproduksjon
Merk:. Riken omics Science Center opphørt å eksistere som fra 1 april 2013, på grunn av Riken omorganisering.
