Abstract
Regulatory T-celle (treg) -mediert immunsuppresjon representerer en av de avgjørende tumor immun evasion mekanismer og er en største hinderet for en vellykket svulst immunterapi. Hypoksi, et felles trekk ved solide tumorer, har vært assosiert med poten immunsuppresjon, redusert terapeutisk respons, ondartet progresjon og lokal invasjon. Dessverre forblir koblingen mellom hypoksi og treg-mediert immuntoleranse i magekreft dårlig forstått. I vår studie ble Tregs og hypoksi induserbar faktor-1α funnet å være positivt korrelert med hverandre og ble øket med tumorprogresjon. En etterfølgende
in vitro
studien indikerte at supernatanter avledet fra magekreft cellene under hypoksisk tilstand, kan indusere ekspresjon av foxp3 via TGF-β1. Disse funnene bekrefter den avgjørende rollen som tregs som et terapeutisk mål i magekreft terapi og gitt nyttige tanker for utforming av immunterapi for magekreft i fremtiden
Citation. Deng B, Zhu JM, Wang Y, Liu TT, Ding YB, Xiao WM, et al. (2013) intratumor Hypoksi Fremmer immuntoleranse ved å indusere regulatoriske T-celler via TGF-β1 i magekreft. PLoS ONE 8 (5): e63777. doi: 10,1371 /journal.pone.0063777
Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 10 januar 2013; Godkjent: 06.04.2013; Publisert: May 27, 2013
Copyright: © 2013 Deng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Shanghai Science and Technology Commission (10410709400, 10411950100), Natur Science Foundation National of China (81000968, 81101540, 81101637 og 81172273) og National Clinical Key Special Subject of China. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP representerer en av de vanligste årsakene til kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. Til tross for betydelige fremskritt i diagnostiske og terapeutiske tilnærminger i løpet av de siste tiårene, prognosen for magekreft er fortsatt trist på grunn av sin høye tilbakefall og metastase [2]. Immunocyttene har lenge vært anerkjent som en faktor som fremmer tumorvekst i svulsten mikromiljøet [3], men er fortsatt den underliggende molekylære grunnlaget i stor grad gåtefull. En bedre forståelse av mekanismene i magekreft vil være gunstig for å utvikle effektive terapeutiske ordninger.
intratumor hypoksi er et felles trekk ved solide tumorer, som kan påvirke utviklingen av svulster ved å aktivere viktige biokjemiske og cellulære trasé [4 ], [5], [6]. Studier har også vist at hypoksi spiller en sentral rolle i tumor-medierte immun-suppresjon, og bidrar til å opprettholde immunologisk unnslipping av tumorer [7], [8]. Nylig har en bekreftet sammenheng mellom tumor hypoksi og immuntoleranse gjennom rekruttering av regulatoriske T-celler (tregs) er etablert i eggstokkreft [9]. Dermed har en hypotese blitt presentert som hypoksi kan gi hindringer for terapeutiske immun intervensjoner.
Økt Tregs har blitt rapportert i sirkulasjon og tumorvev av pasienter med ulike kreftformer, blant annet magekreft, tykktarmskreft, leverkreft og bukspyttkjertelkreft [10]. Akkumulerende data viste også at tilstedeværelsen av Tregs resulterte i en økt risiko for progresjon av kreft [11], [12], [13]. Videre er treg-mediert immunosuppresjon ansett for å være en av de viktige immun unnvikelse mekanismer i tumoren hvorved de er i stand til å overvinne den anti-tumor aktivitet av CD8 cytotoksisk celle, dendrittisk celle og naturlige drepeceller [14]. Således vil belysning av den underliggende mekanisme for treg anrikning i magekreft være av verdi for målretting Tregs for en gunstig klinisk resultat. Selv om mekanismene ikke er godt forstått, har noen studier indikerer at TGF-β1 er involvert i det [15].
I denne studien har vi en hypotese om at magekreft kan erverve en selektiv fordel ved induksjon av Tregs etter hypoksi via TGF-β1 signalveien og dermed unndra immune overvåking. For å demonstrere vår hypotese, analyserte vi uttrykk for hypoksi induserbar faktor-1α (HIF-1α) og foxp3 i mage kreft vev, vurdert effekten av hypoksi på TGF-β1 produksjon i kreftcellelinjer, og endelig klarlagt hvilken rolle hypoksi medier treg berikelse i magekreft.
Materialer og metoder
pasienter og Prøvene
Parafin-embedded, formalinfiksert tumorsnitt ble oppnådd fra 99 pasienter med magekreft som gjennomgikk kirurgisk reseksjon fra desember 2006 til februar 2008 kl Second Clinical Medical School Yangzhou University. Oppfølgingsdata ble oppsummert som i oktober 2012 med en median oppfølgingstid på 53 måneder (4-70 måneder). Total overlevelse (OS) ble definert som fra tidspunktet for kirurgi for å vare oppfølging eller dødstidspunkt.
Perifere blodprøver ble samlet inn fra 20 pasienter med magekreft en dag før og 10 dager etter operasjonen fra juli 2012 til oktober 2012. Sera ble frosset ved -80 ° C umiddelbart etter sentrifugering for fremtidig bruk. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert umiddelbart av en Ficoll tettshetsgradient.
Ingen av pasientene hadde fått immundempende medisiner eller kjemoterapi før kirurgisk reseksjon. Studien ble godkjent av etikkomiteen (Ethics Committee of Second Clinical Medical School Yangzhou University, Yangzhou), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne.
immunhistokjemisk farging
Serial seksjoner (5 um) av formalinfikserte, parafininnstøpte prøver ble foretatt. Snittene ble deparaffinized og rehydrert i gradert alkohol. Antigen gjenfinning ble utført ved behandling av de glir i EDTA-buffer i en mikrobølgeovn i 10 minutter. Kanin-anti-human HIF-1α primære antistoff (BioWorld, USA), muse-anti-human TGF-β1 antistoff (Santa Cruz, USA) og muse anti-humant foxp3 antistoff (Abcam, USA) ble anvendt for de primære antistoffer. Diaminobenzidin (DAB) ble anvendt for substrat følgende kontra med hematoksylin for engangs farging. Double farging ble utført med 2 forskjellige kromogenene:. DAB kromogen (brun farge) for HIF-1α og rask rød kromogen (rød farge) for TGF-β1 eller foxp3
immunreaktivitet Scoring
HIF -1α kjernen farging ble vurdert ved å følge den rapporterte metoden [16], beising poengsum = intensiteten av immunreaktivitet (IR) x andel av positivt fargede celler. IR intensitet ble delt i fire kategorier: 0, ingen IR; 1, svak IR; 2, moderat sterk IR; og 3, sterk IR. Andelen av positive celler ble klassifisert i fem grupper: 0, ingen farging; 1, 2% flekker; 2, 2-10% fuktighet; 3, 11-29% fuktighet; og 4, . 30% farging
En modifisert scoring systemet ble brukt for foxp3
+ celler [17]. Ti felt ble talt ved høy effekt for foxp3. Det absolutte antall lymfocytter per høy effekt felt (HPF 400) ble bestemt. Gjennomsnittlig antall positive fargede celler per høy effekt felt ble beregnet.
Cell Kultur og Hypoksi Induksjon
Menneskelige mage kreft cellelinjer, AGS og BGC823, ble hentet fra Shanghai Institute of Cell biologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle celler ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C i DMEM eller RPMI 1640 (HyClone Tianjin, Kina) supplert med 10% FBS (Gibco, Australia), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin ( HyClone Tianjin, Kina). For hypoksi eksperimenter ble celler utsådd i 6-brønners plater, vasket to ganger med PBS når de økte til 60-80% konfluens, holdt i serumfritt medium AIMV (Invitrogen, USA) for en inkubering over natten, og deretter plassert i en modulær inkubator kammer (Ruskinn Works, YK) i 24 timer under hypoksiske (1,0% O
2) eller normoksiske (21% O
2) betingelser, både med 5% CO
2 ved 37 ° C. Supernatanter ble samlet opp og lagret ved -80 ° C for senere bestemmelse av konsentrasjoner av TGF-β1 og for ko-kultur-analyse. Alle
in vitro
valideringsforsøk ble utført minst tre eksemplarer.
immunfluorescens
Cellene (1 × 10
5 /brønn) ble sådd ut på dekk i en 24-brønners plate for en 24 timers kultur. Deretter ble de fiksert i kald metanol i 30 min for å bli permeabilisert med 0,5% TritonX-100 ° C i ytterligere 30 min. Cellene ble vasket tre ganger, blokkert med 10% geiteserum i PBS i 30 min, og inkubert med anti-human TGF-β1 antistoff (Santa Cruz, USA) og anti-human HIF-1α antistoff (Epitomics, USA) i en fryser ved 4 ° C over natten. Det primære antistoff ble detektert via henholdsvis alexa488-konjugert andre antistoff (Invitrogen, USA) og Alexa 594 fluor-konjugert andre antistoff (Invitrogen, USA). Glassene ble undersøkt under OLYMPUS florescence mikroskopi.
RNA Utvinning og kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Hver av de to cellelinjene er beskrevet ovenfor var dyrket i triplikatbrønner henhold normoksiske eller hypoksiske forhold som beskrevet ovenfor. Totalt RNA ble umiddelbart isolert fra normoksisk eller hypoksiske celler ved slutten av forsøket, ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, USA). Total RNA (5 ng) ble revers transkribert ved bruk av cDNA revers transkripsjon kits (Takara, Dalian, Kina), i henhold til produsentens instruksjoner. qPCR ble gjennomført i en SYBR Grønn PCR Master Mix (Takara, Dalian, Kina). Brett endringer i ekspresjon av hvert TGF-β1 mRNA i forhold til GAPDH ble beregnet på grunnlag av terskelen syklus (Ct) som 2
-Δ
(ΔCt), hvor ΔCt = Ct
target – Ct
GAPDH og Δ (ΔCt) = ΔCt
hypoksi – ΔCt
normoxia. TGF-P1 primere var: forover, 5′-GCCAG AGTGG TTATC TTTTG ATG-3 «; revers, 5’AGTGT GTTAT CCCTG CTGTC AC -3 «, og GAPDH primere var: fremover, 5’GGACC TGACC TGCCG TCTAG AA-3′; revers, 5»-GGTGT CGCTG TT GAAGT CAGAG-3 «. qPCR ble utført in triplo.
Enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA)
Konsentrasjonen av TGF-β1 i kultursupernatantene og sera ble bestemt ved å bruke et ELISA-sett (eBioscience, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Isolering og kultur av T-celler
PBMC fra donorer ble indirekte merket med biotin-antistoff bocktail og anti-biotin mikroperler. CD4
+ T-celler ble separert ved negativ seleksjon i henhold til produsentens instruksjoner (Miltenyi Biotec, Tyskland). CD4
+ T-celler ble direkte merket med CD25 mikroperler og CD4
+ CD25
– T-celler ble isolert ved negativ seleksjon i henhold til produsentens instruksjoner (renhets 95%, Miltenyi Biotec, Tyskland) . Supernatantene samlet inn fra dyrkede AGS cellene under normoksiske eller hypoksiske forhold ble fortynnet med fersk AIMV medium (01:03), kalt normoksiske medium og hypoksisk medium, henholdsvis. Til sammen 1,0 × 10
6 /ml CD4
+ CD25
– T-celler ble stimulert med anti-CD3 /CD28-kuler (1:05; Invitrogen, USA) ± IL-2 (200 U /ml; Peprotech) i 72 timer i AIM-V serumfritt medium (kontroll medium), normoksiske medium eller hypoksisk medium. I noen eksperimenter, rekombinant humant TGF-β1 (2 ng /ml; R Merck, Tyskland) ble tilsatt til kulturene
Flowcytometri
Phenotype analyse av tregs ble utført med en BD FACS AriaII flowcytometer (BD, USA). Kort, ble cellene merket med CD4-FITC og foxp3-PE (eBioscience, San Diego, California) etter produsentens protokoll. For å analysere utbredelsen av Tregs, CD4
+ foxp3
+ T-celler ble evaluert etter gating på CD4
+ T-celler og ble uttrykt som en prosentandel av den totale CD4
+ T-celler.
Statistical Analysis
Statistiske analyser ble utført på SPSS 17.0 for Windows. Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved hjelp av en enveis ANOVA, Mann-Whitney U test eller χ
2 test, der det er hensiktsmessig. Korrelasjonen ble undersøkt av en Pearson korrelasjon. Akkumulert overlevelse ble beregnet via Kaplan-Meier og analysert via log-rank test. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk signifikans ble satt til
P
. 0,05
Resultater
HIF-1α og foxp3 Expression i Gastric Cancer Vev
Etter histologisk bekreftelse av mage kreft (fig. 1A, øverst til venstre og ned-venstre), undersøkte vi uttrykket av HIF-1α og foxp3 ved immunhistokjemi på 99 pasienter. HIF-1α med lav uttrykk (Fig. 1A, øvre) og høy uttrykk (Fig. 1A, ned) ble funnet hovedsakelig i cytoplasma og kjernen av kreftceller i svulsten margin, og kun kjernefysisk HIF-1α farging ble scoret. Det er interessant å merke seg at i noen tilfeller, lymfocytter viste også sterkt uttrykk av HIF-1α. Foxp3 med lav uttrykk (Fig. 1A, øverst til høyre) og høy uttrykk (Fig. 1A, nede til høyre) ble sett i kjernen av lymfocytter, hvorav de fleste var plassert på svulsten margin.
( A) foxp3 og HIF-1α uttrykk i magekreft prøver (seriesnitt) ble bestemt ved H E og immunhistokjemi flekker. Representant H E-farging (øverst til venstre og ned-venstre) og bilder fra tumorer uttrykker små (øvre og nedre-høyre) eller store (ned og ned-høyre) mengder av HIF-1α og foxp3, henholdsvis. (B) histogrammer viste at uttrykket av HIF-1α (venstre) eller foxp3 (til høyre) er betydelig høyere i metastatisk svulst enn i ikke-metastatisk tumor. (C) Kaplan-Meier analyse ble utført for å sammenligne total overlevelse mellom pasienter med høyt og lavt uttrykk for foxp3 (til venstre), samt positive og negative uttrykk for HIF-1α (til høyre). Originale forstørrelser: × 100; × 400 (innfellinger); Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
. 0,001
Deretter ble de uttrykk for HIF-1α og foxp3 i tumorvev sammenlignet hos pasienter med metastatisk (n = 52) og metastatisk (n = 47) magekreft. Både gjennomsnittlig score på HIF-1α og antall foxp3
+ celler i metastatiske pasienter var høyere enn i ikke-meta pasienter (HIF-1α, 7,69 ± 0,45 vs 5,41 ± 0,40,
P
0,001 fig 1B, venstre;. foxp3, 14,61 ± 1,01 vs 8,07 ± 0,95,
P
0,001, figur 1B, høyre)
Forholdet mellom OS og HIF-1α eller foxp3.. i Gastric Cancer Vev
Som for siste oppfølging, 50 av 99 (50,5%) av pasientene var i live, med en median oppfølgingstid på 64 måneder (range 57-70), mens 49 døde av sykdom , med en median tid til døden av 28 måneder (spredning 4-64). For å belyse forholdet mellom ekspresjonen av HIF-1α eller foxp3 og OS, ble HIF-1α kategorisert som negativ (n = 34; Stillingen ≤4) eller positiv (n = 65; Stillingen 4), mens foxp3 ble kategorisert som lav (n = 51F) eller høy (n = 48) ved hjelp av median nummer (8,6 celler /HPF) som cutoff. I vår studie, OS i foxp3-lav gruppen var signifikant høyere enn i foxp3-høy gruppe (
P
= 0,017, Fig. 1C, venstre), mens HIF-1α-negative gruppen var signifikant høyere enn HIF -1α-positive gruppe (
P
= 0,009, Fig.1C, høyre).
Association mellom HIF-1α eller foxp3 og Clinicopathologic Kjennetegn
sammenhengen mellom clinicopathological funksjoner og ekspresjon av HIF-1α eller foxp3 ble deretter evaluert (tabell 1). Ingen korrelasjon ble funnet mellom HIF-1α eller foxp3 uttrykk og alder eller kjønn på pasientene, samt tumorstørrelse. Men var det en økning i positive frekvensen av HIF-1α med dybde på tumorinvasjon (
P =
0,013). En lignende trend ble også funnet mellom uttrykket av HIF-1α (
P
0,001) eller foxp3 (
P
= 0,008) og tumorstadium. I tillegg ble en signifikant korrelasjon finnes mellom lymfeknutemetastase og uttrykk for HIF-1α (
P
= 0,029) eller foxp3 (
P
0,001).
Forholdet mellom HIF-1α og foxp3 eller TGF-β1 i Gastric Cancer Vev
den ovennevnte immunhistokjemiske resultat indikerte at antall foxp3
+ celler var sterk positiv korrelasjon med resultatet av HIF-1α hos pasienter med metastaser
(r
= 0,772,
P
0,001 fig. 2A, til venstre), men ikke hos pasienter uten metastaser (
r =
0,461,
P
= 0,001, fig. 2A, høyre). Vi utførte deretter immunhistokjemisk dobbelt-farging for å evaluere nærværet av koekspresjonen mellom HIF-1α og foxp3 eller TGF-β1. Resultatene viste at foxp3
+ celler i hovedsak sammen i områder nær hypoksisk tumor region med høy HIF-1α uttrykk (Fig. 2B). Videre er de fleste høye HIF-1α tumorceller var høy ekspresjon av TGF-β1 (Fig. 2C).
(A) Korrelasjonen av HIF-1α og foxp3 i metastatisk (til venstre) og ikke-metastatisk tumor (til høyre) , som bestemt ved hjelp av immunhistokjemi farging. (B) Double farging av HIF-1α (brun, kjernen av kreftceller) og foxp3 (rød, kjernen av lymfocytter). Røde piler indikert tumorceller som uttrykker høy HIF-1α, og blå piler foxp3
+ celler. (C) Dobbelt farging av HIF-1α (brun, kjernen av kreftceller) og TGF-β1 (rød, cytoplasma av kreftceller). Røde piler indikert tumorceller samtidig uttrykte høy HIF-1α og TGF-β1, og blå pilene for høy HIF-1α. Original forstørrelse × 200.
Sirkulasjons Tregs og TGF-β1 i Pre-kirurgi og Post-kirurgi Pasienter
For å belyse forholdet mellom Tregs og konsentrasjonen av TGF-β1 i serum, CD4
+ foxp3
+ T-celler ble analysert i pasienter med magekreft via flowcytometri (fig. 3A). Hyppigheten av Tregs før kirurgi var høyere enn den etter kirurgi (9,84 ± 0,40% vs. 8,47 ± 0,33%,
P
0,001, figur 3B.). TGF-P1 konsentrasjoner etter operasjonen sunket betraktelig sammenlignet med dem før kirurgi (6431,95 ± 629.24 vs 7581,56 ± 556.45 pg /ml,
P
= 0,005, fig. 3C). En positiv korrelasjon mellom treg frekvens og TGF-β1 konsentrasjon ble funnet i serum før drift (
r
= 0,454,
P
= 0,044, fig. 3D).
( A) Representative plott viser hyppigheten av CD4
+ foxp3
+ T-celler før og 10 dager etter kirurgi i perifert blod av magekreftpasient, som bestemt ved strømningscytometrisk analyse. (B) Et histogram viser hyppigheten av CD4
+ foxp3
+ -T-celler i perifert blod av magekreftpasienter før og 10 dager etter operasjonen. (C) Et histogram viste at konsentrasjonen av TGF-β1 i perifert blod av magekreftpasienter før og 10 dager etter operasjonen. (D) Korrelasjon av CD4
+ foxp3
+ T-celler frekvens og TGF-β1 konsentrasjon i perifert blod av 20 magekreftpasienter før kirurgi. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
. 0,001
TGF-β1 er sterkt oppregulert i magekreft cellelinjer under hypoxi
For å finne ut om hypoksi induserer sekresjon av TGF β1 i magekreftceller, ble TGF-P1 nivåer undersøkt i to magecancercellelinjer, AGS og BGC823 under hypoksiske eller normoksisk betingelser. MRNA-ekspresjon av TGF-β1 henhold hypoksi ble øket sammenlignet med normoksisk betingelser (Fig. 4A). I samsvar med qPCR, TGF-P1 nivåer i kultursupernatanten viste lignende resultater (fig. 4B). Videre er uttrykk for TGF-β1 og HIF-1α ble også påvist ved immunfluorescens, og resultatene viste økt TGF-β1 og HIF-1α til uttrykk under hypoksiske betingelser sammenlignet med den for henhold til normoksisk betingelser (Fig. 4, C).
. (A) Et histogram viser mRNA-ekspresjon av TGF-β1 i AGS og BGC823 cellelinjer. (B) Et histogram viste TGF-β1 nivå i kultursupernatanten fra de to cellelinjene. (C) Immunofluorescent dobbeltfarging viste TGF-β1 og HIF-1α uttrykk i de to cellelinjene. Alexa fluor594 (atom rød), alexa488 (indocarbocyanin grønn) og DAPI (atomkontra blå). Original forstørrelse × 200. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. * P. 0,001
Hypoksi forsterker Evne til å indusere Tregs via TGF-β1 i magekreft cellelinjer
For å teste hypotesen om at hypoksi-indusert TGF-β1 bidrar til økning på tregs, sirkulerende CD4
+ CD25
– T-celler fra friske individer ble behandlet med supernatanter fra celler under forskjellige forhold. Dot tomter viste ulike medier som induserer uttrykk for foxp3 i CD4
+ T-celler (fig. 5A). Den foxp3 ekspresjon av T-celler i normoksiske medium, hypoksisk medium og rekombinant humant TGF-β1 medium ble alle økes sammenlignet med kontrollmediet (
P
0,001). I tillegg foxp3 ekspresjon i hypoksisk medium var signifikant høyere enn i normoksiske medium (13,04 ± 0,74% vs. 6,76 ± 0,35%,
P
0,001, figur 5B.). Videre, som LY-364947 ble lagt til hver type medium, redusert foxp3 uttrykk åpenlyst (
P
. 0,001, figur 5C).
(A) Representative tomter viste foxp3 uttrykk i CD4
+ CD25
– T-celler dyrket med ulike medier i 72 timer. Supernatantene av AGS-celler dyrket under normoksiske og hypoksiske tilstand ble kalt normoksiske medium og hypoksisk medium, henholdsvis, mens AIM-V medium med eller uten rekombinant humant TGF-β1 (reTGF-β1) ble kalt reTGF-β1 medium og kontrollmedium, henhold . (B) Et histogram viste foxp3 uttrykk i CD4
+ CD25
– T-celler dyrket med ulike medier. (C) Et histogram viste at TGF-β1 reseptor kinase inhibitor LY-364947 (TGF-β1 I) delvis ablates indution av foxp3 i CD4
+ CD25
– T-celler dyrket i ulike medier. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
. 0,001
Diskusjoner
I løpet av det siste tiåret, har nye bevis antydet at tregs bidra til etablering av svulster ved å svekke antitumorimmun reaksjon, eller til og med stimulere metastase direkte [18], [19]. Bevis innhentet i de siste årene vist økt frekvens av intratumorale Tregs i magekreft, som har vært knyttet til ugunstige clinicopathological funksjoner og dårlig prognose [20], [21], [22]. I samsvar med disse tidligere rapporterte resultater, vår studie gitt bevis for at hyppigheten av tumor-infiltrerende Tregs øker med fremskridende tumorstadier. Videre Tregs også gitt en prognose faktor for post-kirurgi for magekreft. I tillegg fikk vi bekreftet at antallet Tregs i magekreft med spredning er betydelig høyere enn i ikke-metastatisk ventrikkelkreft. Resultatene ovenfor gir støtte til ideen om at tregs kan bidra til tumorprogresjon og kan være en potensiell terapeutisk mål for magekreft. Vi dermed neste forsøkt å utforske den underliggende mekanismen formidling Treg berikelse i magekreft.
Tumor hypoksi er godt anerkjent som en viktig faktor som resulterer i behandling motstand og dårlig prognose for magekreft [6], [16], [ ,,,0],23]. HIF-1α, som den viktigste molekylære signatur for hypoksi, er den viktigste nedstrøms regulator av hypoksisk respons i tumorceller [24]. Resultater fra studien viste at HIF-1α korrelert med en ondartet oppførsel kategorien, inkludert dybde av invasjonen, lymfeknutemetastase og fremme tumorstadium. Påfallende, magekreftpasienter med høy HIF-1α hadde dårligere overlevelsen enn de med lav HIF-1α, noe som ytterligere forsterket vårt forslag om at HIF-1α, eller snarere hypoksi, er forbundet med progresjon av magekreft.
det har lenge vært kjent at tumorceller blir beskyttet mot immun skader på hypoksiske tumor microenvironments; Men de underliggende mekanismene fortsatt under gransking [25]. Per nå, er lite kjent om hvorvidt det er en sammenheng mellom hypoksi og treg-mediert immunsuppresjon i tumorer. Flere nyere studier har studert hypoksisk regulering av tregs, med motstridende resultater. Ben-Shoshan
et al.
[26] rapporterte at hypoksi øker antallet og undertrykkende egenskaper av Tregs å diktere en anti-inflammatorisk program. Wei
et al.
[7] også bekreftet at hypoksi øker muligheten for glioblastom multi å indusere Tregs, og dermed spiller en nøkkelrolle i tumor-mediert immunsuppresjon. Imidlertid Dang et al. [27] fant at HIF-1α hemmer Treg differensiering ved å målrette foxp3 protein for degradering. I vår studie, presenterte vi en sterkt positiv korrelasjon mellom Tregs nummer og HIF-1α uttrykk, noe som tyder på at hypoksi kan bidra til Tregs infiltrasjon i magekreft. Det er verdt å merke seg at i våre studier, var de fleste Tregs ligger i regionen nær kreftceller uttrykker HIF-1α. Således blir ytterligere klarlegging av hvorvidt hypoksi-assosierte molekyler som frigjøres fra kreftceller bidra til berikelse av Tregs i magekreft er nødvendig.
Mens de involverte i anriking av Tregs i tumorer mekanismer er fortsatt ikke godt forstått, Vi og andre forskere har nylig vist at tumorceller kan tjene som en kilde for TGF-β1, som er nødvendig for induksjon og vedlikehold av Tregs
in vitro
og
in vivo product: [28], [29], [30]. I denne studien, hyppigheten av Tregs og TGF-β1 i omløp før kirurgi var høyere enn den etter kirurgi, og de to parametere viste en positiv korrelasjon, hvilket antyder at tumor-avledet TGF-β1 kan bidra til økningen av Tregs i gastrisk kreft.
Hypoksi, et felles trekk ved kreft, kan forårsake kreft celler til hemmelige immunsuppressive cytokiner inkludert TGF-β1 [7], [31]. Resultater fra studien viste de fleste high TGF-P1 cellene kreftceller uttrykker HIF-1α i tumorer. En
in vitro
studien viste en ekspresjon av TGF-β1 øket i større grad i magekreftceller i henhold til hypoksiske kultur, som også er i overensstemmelse med ovennevnte studier. Basert på våre funn, hypotese vi at kreftcellene skiller ut TGF-β1 å indusere produksjon av Tregs i magekreft. For å teste vår hypotese, isolerte CD4
+ CD25
– T-celler fra friske individer ble dyrket i utvannet supernatanter av kreftceller under ulike dyrkningsforhold. Resultatene viste at foxp3 ekspresjon av T-celler dyrket i hypoksisk medium var betydelig høyere enn celler dyrket i normoksiske medium. Videre tilsetning av ekstra rekombinant humant TGF-β1 betydelig økt foxp3 ekspresjon, mens tilsetning av LY-364947, et TGF-β1 reseptor-inhibitor, redusert foxp3 uttrykk. Dermed disse resultatene etablere en direkte kobling mellom hypoksi, TGF-β1 og Tregs i magekreft.
Men vår foreløpige studien viste også at TGF-β1 var uendret av HIF-1α stabilisator, kobolt klorid (CoCl
2), eller HIF-1α inhibitor, 2-methoxyestradiol (2ME2) i AGS og BGC823, selv om den HIF-1α ble økt med hypoksi (data ikke vist). Disse resultatene antydet at HIF-1α kan være unassociated med induksjon av TGF-β1 i magekreftceller etter hypoksi, som er i overensstemmelse med tidligere studier [32]. Videre er produksjonen av Tregs ble ikke fullstendig ablated ved blokkering av TGF-β1, noe som indikerer at andre cytokiner eller baner kan også være involvert. I tillegg har kreftceller er ikke den eneste kilde av cytokiner i svulsten mikromiljøet. Dermed er ytterligere studier for å bekrefte den underliggende mekanismen for treg opphopning i magekreft.
I konklusjonen, denne studien viste at hypoksi forsterker muligheten for magekreft for å unngå immun overvåking med opp-regulerer uttrykket av TGF-β1, for derved å indusere Tregs i tumorer. Videre våre data også tilveiebrakt bevis for eksistensen av intercellulære krysstale mellom tumorceller og Tregs, som kan regulere anti-tumor immunresponser.
