Abstract
Kreft celle motstand mot anoikis drevet av avvikende signale vedvarende av svulsten mikromiljøet overfører høy invasiv potensial og terapeutisk motstand. Vi har nylig generert en roman bly kinazolin-baserte Doxazosin® derivat, DZ-50, som svekker tumorvekst og metastasering via anoikis. Genome-wide analyse i menneske prostatakreft cellelinje DU-145 identifiserte primære downregulated målene for DZ-50, inkludert gener involvert i fokal vedheft integritet (fibronektin, inte-α6 og Talin), tight junction dannelse (claudin-11) samt som insulin vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3) og angiogenese modulatoren thrombospondin 1 (TSP-1). Konfokalmikroskopi demonstrerte strukturelle forstyrrelser av både fokale sammenvoksninger og trange veikryss ved nedregulering av disse gen-mål, noe som resulterer i redusert celle overlevelse, migrasjon og vedheft til ekstracellulære matriks (ECM) komponenter i to androgen-uavhengig menneskelige prostata kreft cellelinjer, PC-3 og DU-145. Stabilisering av celle-ECM-interaksjoner ved overekspresjon av talin-1 og /eller utsette celler til et fibronektin-rikt miljø dempet effekten av DZ-50. Tap av uttrykk for den intracellulære brennvidde heft signal effektorer Talin-en og inte knyttet kinase (ILK) sensitivisert human prostatakreft til anoikis. Våre funn tyder på at DZ-50 utøver sin anti-tumor effekt ved å målrette de viktigste funksjonelle intercellulære interaksjoner, fokale sammenvoksninger og trange veikryss, støtte den terapeutiske betydningen av dette middel for behandling av avansert prostatakreft
Citation. Hensley PJ , Desiniotis A, Wang C, Stromberg A, Chen CS, Kyprianou N (2014) Novel Farmakologisk målretting av tett veikryss og Focal Adheranser i prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (1): e86238. doi: 10,1371 /journal.pone.0086238
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 04.11.2013; Akseptert: 12. desember 2013, Publisert: 31 januar 2014
Copyright: © 2014 Hensley et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra National Institutes of Health, R01-GRANT00491815 og ved Nasjonalt Senter for Forskningsressurser og Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, UL1RR033173. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Vær oppmerksom på at forfatterne har erklært følgende COI: Som den tilsvarende forfatter, Natasha Kyprianou sier at hun fungerer som en Academic redaktør i PLoS ONE Editorial Board, men bekrefter at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet i veiledningen for forfattere. Videre er det et patent vedrørende materiale relevant i denne artikkelen, dvs. genereringen av den nye medikament, DZ-50, av forfatterne Dr. Chen og Dr. Kyprianou. De erklærer dette patentet, som heter: «Nye antitumormidler og metoder for deres bruk i målretting Prostate Cancer», University of Kentucky /Ohio State University Joint Invention, US Patent S.N. 12/323073. (Ching-Shih Chen og Natasha Kyprianou, coinventors.) Forfatterne bekrefter at eierskapet /oppfinnelsen av dette patentet ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, slik det er beskrevet i veiledningen til forfattere.
Innledning
prostatakreft er den nest vanligste kreftformen blant menn, med 206,640 menn diagnostisert og 28 088 dør av prostatakreft i 2012 [1]. Kjemoterapeutisk målretting av androgen signale aksen i prostatakreft har bidratt til den beste kreft overlevelse hos menn. Men en undergruppe av pasienter bli ildfast til androgen ablasjon terapi ved å unnlate apoptose og videre til kastrering resistent prostatakreft (CRPC) [2]. Prostatakjertel epitelceller har en iboende behov for overlevelsessignaler formidles av inter og celle-ekstracellulær matrix (ECM) interaksjoner. Fokal adhesjon er viktige for både normal kontakt-avhengig signalisering av normale celler og invasjon, migrering og metastaser av ondartede celler.
Work fra dette laboratoriet identifiserte nye anti-tumor virkning som utøves av medikamenter klassisk brukes til behandling av godartet prostatahyperplasi (kinazolin-α
1-adrenoceptor antagonister) via induksjon av apoptose ytre kaskade (død reseptoraktivering, caspase-8-spaltning og inhibering av AKT overlevelse signalering) [3], [4], [5]. Strukturoptimalisering førte til dannelsen av nye forbindelser som er i stand til anoikis induksjon og inhibering av angiogenese [6], [7]. Anoikis, apoptotisk celledød følge utilstrekkelige celle-ECM interaksjoner, er en kritisk komponent i angiogenese og metastase [8]. Aggressive kreftceller grave denne mekanismen, opprettholde overlevelse gjennom formidling og seeding i fjerne organer [9]. Anoikis motstand er nært knyttet til økt metastatisk potensial i mange menneskelige maligniteter, inkludert prostata kreft [10], nyrecellekreft [11], brystkreft [12] samt svulster i mesenchymale opprinnelse [13].
Metastase nødvendiggjør avbrudd av cellulære interaksjoner med svulsten mikromiljøet, økt vandrende og invasjon kapasitet og evne til å overvinne de pro-apoptotiske signaler som formidles av forminskede intercellulære og celle-interaksjoner ECM [14]. ECM består av et mangfoldig nettverk av cytokiner påvirker cellevekst, motilitet og angiogenese som kan gjøres tilgjengelig for mobil bruk ved enzymatisk fordøyelse og ombygging [15]. Transmembran-integriner er karakterisert ved toveis signalering. Oligomerisering av integrin proteiner om en ECM substrat induserer konformasjonsendringer som overføres gjennom plasmamembranen til å modulere affiniteten av intracellulære signal effektorer på cytosoliske integrin-haler [16]. Protein aggregater, kollektivt kjent som midt vedheft kompleks (FAC), inkluderer aktin bindende proteiner (Talin-en, vinculin, vimentin, paxillin, filamin, ect.) Som stabiliserer cytoskjelettet og kinaser (brennvidde heft kinase [FAK], inte -koblet kinase [ILK], og SRC ikke-reseptor-tyrosinkinase) som forplanter seg intracellulær signalisering til kjernen. Dette integrin-mediert «utenfor-in» signalkaskade kontroller prosesser avgjørende for cellular funksjon og vekst som cellecyklusprogresjonen og differensiering [17].
Som aktin cytoskeletal nettverket gjennomgår dynamisk ombygging /organisasjon, de inte clustering induserer «inside-out» signaliserte til økt affinitet inte til ECM, effektivt etablere et samlings vedheft [18]. Ved utilstrekkelig integrin-ECM-interaksjoner, celler nedregulere medlemmer av anti-apoptotiske Bcl-2-familien og oppregulere Fas-ligand (Fasl), indusere anoikis via den ekstrinsiske reaksjonsveien apoptose [19], [20]. Talin-en bidrar funksjonelt til anoikis-motstand og prostatakreft metastase ved å styrke brennvidde heft formasjon og Akt-overlevelse signalering. Vi har nylig demonstrert en signifikant korrelasjon mellom Talin-en overekspresjon og metastasering i en musemodell for prostata tumorigenesis og i prostata kreft progresjon menneske [10].
Farmakologisk utnyttelse av α1-adrenoreseptorantagonist doxazosin® har ført til generering av nye kinazolin-baserte forbindelser, med ledningen middel, DZ-50, som har potente anoikis-induserende virkning mot kreftceller [6]. DZ-50 undertrykker vekst av menneskelige prostata kreft xenografter og hemmer deres metastatisk potensial
in vivo
av å svekke angiogenese, migrasjon og invasjon [7] gjennom målretting fokus vedheft signaliserer aksen [11]. Denne studien undersøkte de cellulære målene for DZ-50 i androgen-uavhengig menneskelige prostata kreft celler. Genome-wide analyse identifisert kritiske effektorer av brennvidde heft og stramme koblings interaksjoner som er rettet av romanen kinazolin agent.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
androgen -Uavhengig humane prostatacancercellelinjer PC-3 og DU-145 ble oppnådd fra American Type Tissue Culture Collection og dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og antibiotika (PenicilinG /streptomycin, 50 ug /ml). DU-145 celler ble transfektert med pEGFP eller Talin-1 plasmider og klonet i henhold G418 utvalg (Life Technologies Bethesda Research Laboratories). For å kneble Talin-1 uttrykk, ble shRNA Talin-en vektor (GIPZ shRNAmir Talin-1) som brukes fra Open Biosystems (Hunsville, AL) og shRNA talin1 DU-145 prostatakreftceller ble valgt under puromycin. Polyklonale populasjoner ble slått sammen etter valget, og stabile cellelinjer ble preget av immunoblotting. PC-3 celler ble stabilt transfektert med pTRIPZ vektor som inneholder TRE-ILK shRNA (Thermo Scientific). PC-3 shILK celler ble indusert med 2 mg /ml doksycyklin (Enzo Life Sciences) for to dager. DZ-50, et første-generasjons doxazosin-derivat (Shaw et al, 2004;.. Garrison et al, 2007), ble anvendt ved en konsentrasjon på 5 uM oppløst i DMSO for alle behandlinger. Steril DMSO ble brukt for kontroll /ubehandlede prøver.
celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble vurdert etter behandling med 5 mikrometer DZ-50 bruker kolo MTT (3- [4,5-dimetyltiazol – 2-yl] -2,5 difenyltetrazoliumbromid) analyse (1 mg /ml MTT i PBS), og kvantifisert ved anvendelse av en spektrofotometrisk måling. Statistisk analyse av 3 uavhengige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer, er uttrykt i forhold til ubehandlet kontroll.
Cell Migration analysen
såret ble påført ved hjelp av en steril pipette tips i konfluent cellemono i 6- brønners plater. Etter inkubasjon i 12-48 timer i nærvær av DZ-50 (5 uM), ble såret områder undersøkt ved lysmikroskopi (Axiovert 10, Zeiss). Celler migrere til de sårede områder ble talt under et mikroskop. Migrasjonspotensialet ble bestemt som gjennomsnittlig antall celler i tre tilfeldig høy effekt (400 ×) felt /brønn. Numeriske data er innhentet fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer og er uttrykt i forhold til ubehandlede kontroller.
celleadhesjonsanalyse
Kulturer av PC-3 og DU-145 underlinjer ble behandlet (24 timer) med DZ-50 (5 mm) og høstet. -Celler (1 x 10
5 /brønn) ble tilsatt til 6-brønns plater belagt med fibronektin (5 ug /ml, BD Biosciences) og følger en 30-minutters inkubasjon ved 37 ° C ble cellene fiksert med 100% ( vol /vol) kald metanol og underkastet bildeanalyse. Antallet overholdt celler ble talt i tre representative felt /brønn (400 ×). Numeriske data representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo og uttrykkes i forhold til ubehandlede kontroller.
Western Blot analyse
Menneskelige prostatakreftceller, DU-145 og PC-3, ble behandlet med DZ-50 (5 uM) for sekvensiell tidsperioder og cellelysatene ble samlet i lyseringsbuffer (150 mmol /l NaCl, 50 mmol /liter Tris (pH 8,0), 0,5% deoksykolsyre, 1% NP40 med 1 mmol /l fenyl metyl-sulfonylfluorid, pH 7.4). Proteinprøver ble underkastet SDS-PAGE og overført til Hybond-C-membraner (Amersham Pharmacia Biotechnology). Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C med de spesifikke primære antistoffer: Akt (Cell Signaling Technology), fosforylert Akt Ser 473 (Cell Signaling Technology), GSK-3β (Cell Signaling Technology), fosforylert GSK Ser 9 (Cell Signaling Technology), ILK-en (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Talin-en (Millipore) eller Actin (Calbiochem). Etter inkubering med de respektive primære antistoff, ble membranene utsatt for pepperrotperoxydase-merkede sekundære antistoffer og signal ble påvist med SuperSignal West Dura lengre varighet substrat (Pierce) og eksponert på røntgenfilm. Densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av ImageJ programvare og verdiene er uttrykt i forhold til kontrollene.
Gene (QRT-PCR) Analyse
RNA ble isolert fra cellelysatene ved hjelp TRIzol Reagens (Ambion) og Pure Link RNA Mini Kit (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens. Etter homogenisering og faseseparasjon ved sentrifugering (12.000 g, 4 ° C), ble RNA utfelt med isopropanol. Prøvene ble sentrifugert (12.000 g, 4 ° C) og cDNA ble syntetisert ved anvendelse av RNA (1 ug) og revers transkripsjon System (Promega). DNA rekke analyse ble utført ved University of Kentucky Microarray Kjerne Facility hjelp Affymetrix Genechip Technology. Transkripsjonene ble evaluert av ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc.); hver behandling (5 uM DZ-50 og 9 timer) ble utført i tre eksemplarer.
For RT-PCR-analyse, RNA (1 ug) ble utsatt for revers transkripsjon ved å bruke revers transkripsjon System (Promega). De følgende primere ble utformet (Sigma) for SYBR grønn kvantitativ sanntids-PCR (QRT-PCR) system: Fibronektin-1 (F: 5′-TCATGAGGCAACGTGTTATGATG-3 «, R: 5′- CGAGATATTCCTTCTGCCACTGT-3′), TALIN- 1, (F: 5»-GCAGAAGGGAGAGCGTAAGATC-3 «, R: 5′-TGAGAGAACGGGCTAGCTTCA-3′), Inte-α6 (F: 5»-CAGAAAGTGTGCATGGAGGAAA-3 «, R: 5′- TGGGAATGGGACGCAGTT-3′), og ZO-1 (F: 5»-GGAGCTGCGCTTACCACACT-3 «, R: 5′- TTTGCTCCAACGAGATAATTTGG-3»). De følgende primere ble oppnådd for TaqMan QRT-PCR-systemet (Invitrogen): 18 s ribosomalt RNA (rRNA), Thrombospondin-1, IGF-BP3, claudin-11, sneglen. cDNA ble anvendt for QRT-PCR-analyse i henhold til de respektive SYBR grønn og Taqman protokoller (Bio-Rad). For QRT-PCR-forsøk ble hver prøve analysert i tre paralleller og data representerer gjennomsnittsverdier fra tre uavhengige eksperimenter. Numeriske data for transkripsjonsnivåer ble normalisert til 18 s rRNA i kontroller og uttrykt i forhold til ubehandlede kontroller.
Immunofluorescensanalyse
Celler belagt i 4-brønn kammer lysbilder belagt med Fibronektin (5 mikrogram /ml , BD Biosciences) ble utsatt for DZ-50-behandling (5 uM) i 12 timer. Celler ble deretter fiksert i 100% (v /v) methanol, og etter blokkering ved 4 ° C (5% NGS, 0,3% Triton X), ble utsatt for det primære antistoff (4 ° C, over natten). De følgende spesifikke antistoffer ble brukt: ILK-en (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Snail (Cell Signaling Technology), Talin (Millipore). Cellene ble deretter inkubert med fluorokromkonjugerte konjugert sekundært antistoff (Invitrogen) (2 timer, romtemperatur) og utsatt for konfokalmikroskopi hjelp av en Olympus FV1000 konfokalmikroskop v1.21. og programvareversjon FV10-ASW 3.1.
Microarray analyse
shTalin eller vektor DU-145 menneskelige prostata kreft celler ble behandlet med DZ-50. RNA prøver fra celler før eller etter (9 timer) behandling ble sendt til University of Kentucky Microarray kjernefasilitet for analyse på Affymetrix Menneskelig Gene 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA). Forsøket under hver tilstand ble utført i duplikat.
Statistical Analysis
Microarray data ble normalisert ved hjelp av RMA og analysert ved hjelp av to-veis analyse av varians (ANOVA) modeller, med genotype (shTalin eller vektor) og behandling (før eller etter) som de to faktorer. Kontraster ble generert for å vurdere endringer i mRNA uttrykk mellom behandlet versus ubehandlet i vektor celler. Falske funnrate (FDR) og de tilhørende q-verdier ble beregnet ved hjelp av metoden i REF. Differensielt uttrykte gener ble bestemt på grunnlag av FDR 20% og fold change 1.5. Statistiske analyser for data fra alle andre forsøk ble utført basert på en utvalgs eller to-utvalg t-tester som passer. På P 0,05 verdiene ble vurdert som statistisk signifikant
Resultater
Novel kinazolin DZ-50 induserer Prostate Cancer Cell Anoikis
anoikis-induserende effekten av ledelsen quanazoline sammensatte DZ. -50 ble undersøkt i humane prostatakreftcellelinjer variably uttrykke FAC proteiner, Talin-1 og ilk. Stabil transfeksjon av DU-145 celler resulterte i knockdown av Talin (DU-145 shTalin) og overekspresjon av Talin (DU-145 Talin +) (figur 1, panel A). PC-3 celler som uttrykker en induserbar shILK vektor demonstrerte effektiv nedregulering av ILK etter induksjon med doksycyklin i 48 timer (fig.1, panel A). Det var en tidsavhengig reduksjon i celleviabilitet i respons til DZ-50 (figur 1, felt B). Tap av ILK og Talin uttrykk i PC-3 og DU-145 prostatakreftceller henholdsvis resulterte i økt følsomhet for DZ-50, mens Talin overekspresjon trykt anoikis. Dataene på panel C (Fig. 1) viser at i respons til DZ-50, er prostatakreft ell migrering betydelig økt. Tap av enten ILK (PC-3 celler), eller Talin (DU-145 celler), hemmet cellemigrasjon, mens ytterligere forbedret effekten av DZ-50. Tap av enten ILK eller Talin uavhengig ført til en betydelig reduksjon i celle adhesjon til fibronektin (figur 1, panel D).
Panel A, høyre, Western blot avsløre at shILK transfektant PC-3 celler vise totaltap av ILK-1 protein uttrykk i forhold til vektorkontrollceller ved induksjon med doxycycline (48 timer). På venstre, DU-145-celler hvori talin har vært stillhet (shTalin) eller overuttrykt (Talin +), oppviser betydelig reduksjon eller markert overekspresjon av talin protein nivåer henholdsvis, i forhold til foreldre DU-145-celler. Panel B, fører DZ-50 behandling til en signifikant reduksjon i prostatacancercellelevedyktighet i en tidsavhengig måte. Tap av ILK1 forbedrer DZ-50 indusert tap av celle levedyktighet; I motsetning Talin overekspresjon gir resistens mot DZ-50 indusert celledød. Panel C, DZ-50 reduserer prostata kreft celle migrasjon betraktelig. Tap av Talin resulterer i en betydelig reduksjon av prostatacancer cellevandring i forhold til foreldrekontroll DU-145-celler. Som svar på DZ-50, gjenoppretter talin overekspresjon celle vandrende evne til nivåene av ubehandlede celler. Panel D, Functional tap av ILK i PC-3 prostata kreftceller og tap talin i DU-145-celler i betydelig grad svekker evnen til de respektive prostata kreftceller til å forholde seg til fibronektin (ECM). Talin overekspresjon markant forbedrer prostata kreft celle vedheft til fibronectin, i forhold til foreldre DU-145 og DU-145 shTalin celler. Statistisk signifikans ble satt til * p. 0,05
Identifisering av molekylære mål av Lead kinazolin
Genome-wide analyse av genuttrykk i menneske prostatakreft cellelinje DU-145 ble anvendes for å identifisere primære mål for DZ-50 (fig. 2). Varmen kart fra genet rekke analyse etter behandling av prostata kreft celler med DZ-50 (for 9 timer) er vist på figur 2 (panel A). DZ-50 resulterte i en betydelig nedregulering av gener som koder for plasma membran assosierte proteiner, inkludert regulatorer av ECM (
fibronektin Hotell og
inte-α
6
), og tett veikryss (
claudin-11
), insulin vekstfaktorbindende protein 3 (
IGFBP-3
), samt angiogenese mediator thrombospondin 1 (
TSP-1
). For å validere panel av kandidat genet målene identifisert av genet rekke molekylære profilering, vi senere gjennomført kvantitativ real time PCR (QRT-PCR) analyse (fig. 2, panel B). Eksponering av DU-145-celler til DZ-50 (3 og 9 timer) førte til en signifikant inhibering av ekspresjon for et utvalgt gen signatur identifisert rekke analyse (figur 2, felt A), inkludert gener som koder for nøkkelkontaktklebealiserte effektorer , intracellulært (Talin) og ekstracellulært (fibronektin) og trange veikryss proteiner (claudin-11 og ZO-1). En transcriptional formidler av EMT,
snegle, etter reduseres også ved DZ-50. Den kjemiske strukturen til kinazolin-basert forbindelse DZ-50, er vist i panel C (fig. 2).
Panel A, Heat kart over differensielt uttrykte gener i DU-145 humane prostatacancerceller før og etter behandling med DZ-50 (9 timer). Vi identifiserte 17 markert downregulated gener etter behandling med DZ-50 (9 timer), inkludert gener som koder for ECM regulatorer
fibronektin Hotell og
inte α6
, tight junction mekler
claudin-11
og angiogenese signale effektor
thrombospondin en
. (Endring 1,5, falske funnraten 20%). Panel B, Validering av genuttrykk ved bruk QRT-PCR etter DZ-50 behandling av prostata kreft celler (5 mm) for 3 og 9 timer. En betydelig reduksjon i mRNA i forhold til ubehandlede celler ble oppdaget for gener involvert i ECM-focal vedheft signale komponenter
(fibronektin
,
inte-α6 Hotell og
Talin
), tett veikryss (
claudin-11
), angiogenese (
thrombospondin-1
) og EMT (
Snail
). * Indikerer signifikant forskjell ved p 0,05. Panel C, molekylære strukturen av Doxazosin © derivat, DZ-50.
DZ-50 Targets vitale cellulære interaksjoner i prostata kreft celler
For å karakterisere effekten av DZ-50 på tett veikryss (TJ) ko-lokalisering av ZO-1 og claudin-11, to proteiner vesentlig for disse intercellulære interaksjoner, ble vurdert ved bruk av fluorescerende konfokal mikroskopi i to forskjellige humane prostatacancercellelinjer, PC-3 og DU-145 (fig . 3, panelene A og B henholdsvis). Behandling med DZ-50 (12 timer) markert redusert claudin-11 uttrykket (rød) i begge foreldrecellelinjer, noe som resulterer i nevneverdig svekkelse av TJ formasjonen. Subcellulære lokalisering av ZO-1 (grønn) til plasmamembranen resulterte i respons til DZ-50. Celler som uttrykker funksjonelle tap av de sentrale adhesjonsproteiner ilk (PC-3 shILK) og talin (DU-145 shTalin) beholdt noe claudin-11 ekspresjon til tross for behandling med DZ-50 i forhold til de respektive foreldrecellelinjer (hvite piler). Denne ekspresjon av claudin-11 komplekser med ZO-1 i plasmamembranen som dårlig definert, punktformet TJ komplekser er vist på figur 3 (sammensatte bilder, panelene A og B). Som svar på DZ-50, var det en tidsavhengig oppregulering i ZO-1-proteinnivåer. ZO-1-ekspresjon ble inverst korrelert med ekspresjonen av fokal adhesjon protein ILK (fig. 3, paneler C og D). Western blot analyse viste at talin overekspresjon i DU-145-celler resulterte i reduserte ZO-1-proteinnivåer, mens nedregulering av talin var assosiert med øket ZO-1 (fig. 3, paneler E, F).
Karakteristisk konfokalmikroskopi bilder av PC-3 celler (panel A) og DU-145 celler (panel B). Behandling med DZ-50 (12 timer, 5 mm) reduserer claudin-11 uttrykk og hemmer tight junction formasjon. Tett veikryss komplekser (piler), preget av colocalization av den stramme krysset proteiner claudin-11 (rød) og ZO-1) (grønn) er fullstendig avskaffet ved DZ-50. I PC-3 shILK og DU-145shTalin celler det er svak dannelsen av TJ komplekser (pil hoder), som svar på DZ-50. DAPI (blå) brukes for atom deteksjon (paneler A og B). Forstørrelse x100. Paneler C-F, Western blot og respektive densitometrisk analyse avslører ekspresjon av TJ protein ZO-1 som svar på DZ-50 i PC-3 (paneler C og D) og DU-145 (Panel E og F) prostatakreftcellelinjer .
Fluorescent mikroskopi ble brukt for å undersøke effekten av DZ-50 på fokale vedheft dynamikken i de to forskjellige menneskelige prostata kreft cellelinjer PC-3 (fig. 4) og DU-145 (fig. 5). Resultatene på figur 4 viser at i respons til DZ-50 (12 timer), var det en signifikant reduksjon i talin (rød) og ILK (grønn) proteinekspresjon, noe som påvirker det sentrale adhesjon integritet (sammensatte bilder fig. 4, panel A ; DAPI-blå nukleær farging). For å bestemme effekten av ECM på cellulær respons overfor DZ-50, PC-3-celler ble dyrket i nærvær av fibronektin. Tilstedeværelsen av fibronektin tilrettelagt brennvidde heft stabilisering og varig uttrykk for Talin og ILK, redde prostata kreft celler fra anoikis effekten av DZ-50 (sammensatte bilder Fig. 4, paneler A og B). Funksjonell tap av ILK i PC-3 celler (fig. 4, panel B) resulterte i FAC ustabilitet med samtidig nedregulering av Talin i forhold til foreldre PC-3 celler (fig. 4, panel A). Behandling av celler med shILK DZ-50 resulterte i fullstendig oppheving av FAC signalering, et fenomen som delvis ble reddet i nærvær av fibronektin.
PC-3 prostata kreftceller og PC-3-celler som shILK tap av ILK (panelene A og B, henholdsvis) ble behandlet med DZ-50 (12 timer, 5 uM) i fravær eller nærvær av fibronektin-ECM. Fluorescerende bilder avsløre den ko-lokalisering av fokal adhesjon regulatorer talin (rød) og ILK (grønn) for å bli forstyrret av DZ-50-behandling, sammenlignet med ubehandlede kontroller. DAPI (blå) brukes for atom deteksjon. Stanse ILK uttrykk fører til redusert deteksjon av sin primær oppstrøms partner, Talin og påfølgende forstyrrelse av fokale sammenvoksninger (Panel B), i forhold til foreldre PC-3 celler (panel A, kompositt, fokale sammenvoksninger identifisert i gult). Prostata kreft celler dyrket på en fibronektin-belagt substrat (ECM integritet) stabilisere midt vedheft komplekse og redusere målretting evne DZ-50 på følgende underlag i både PC-tre foreldre og PC-shILK celler. Forstørrelse x 100
DU-145 (panel A) og DU-145 shTalin (panel B) ble dyrket i fravær eller nærvær av fibronektin-belegg og behandlet med DZ-50.; Cellene ble deretter utsatt for konfokal mikroskop for påvisning av Talin (rød), ILK (grønn), og fokale sammenvoksninger (gule). Cellekjernene ble påvist ved farging DAPI (blå). DZ-50 redusert brennvidde heft formasjon gjennom målretting av Talin og ILK. Denne effekten ble opphevet ved nærværet av fibronektin-ECM, som dratt motstand mot DZ-50 (panel A). Tap av Talin medførte redusert samlokalisering med ILK og forsvinningen av fokale sammenvoksninger i DU-145 shTalin celler (panel B). Forstørrelse x100. Paneler C-E, Western blot og kvantitativ analyse av den tidsavhengige effekt av DZ-50 på nedstrømscelleoverlevelse signalisering. DZ-50 fører til defosforylering overleve signale effektorer AKT (Panel D) og GSK-3β (Panel E). Talin overekspresjon gir resistens mot DZ-50 anoikis effekt ved å opprettholde aktivering /fosforylering av AKT og GSK-3β signalering.
Vi deretter undersøkt konsekvensene av Talin reduksjon på prostatakreft celle brennvidde heft integritet og deres følsomhet til DZ-50. Konfokalmikroskopi bildene som er vist på figur 5, viser at tilstedeværelsen av fibronektin antagoniserte den anoikis effekten av medikamentet på fokal adhesjon i DU-145-celler (fig. 5, panel A) under funksjons Talin nivåer. Stanse av Talin i prostatakreftceller imidlertid resultert i fokal adhesjon kompleksdannelsen for å oppheves selv i nærvær av fibronektin (fig. 5, panel B). Det var ingen så signifikante forskjeller i fokusvoksninger i DU-145shTalin celler.
DZ-50 Svekker Nedstrøms Intracellulær Survival Signa
For å undersøke konsekvensene av DZ-50 på intracellulære signal nedstrøms fokus vedheft komplekse og tett veikryss, AKT og GSK3p ble profilert som mellom overlevelse signale effektorer [11], [21]. Som vist på figur 6 målretting av disse cellulære interaksjonene av DZ-50 resulterer i markert reduksjon av fosforylering av både AKT og GSK3P i løpet av 3-6 timer fra behandlingen (Panel B og C). Overekspresjon av Talin i prostatakreftceller indusert phosporylation av Akt og GSK-3β, og dermed fører til forbedret overlevelse og motstand mot virkningen av DZ-50. I kontrast, DU-145 celler med redusert Talin nivåer, utviste redusert Akt og GSK3p fosforylering (Fig. 6, panel C).
DZ-50 retter seg mot celle-celle interaksjoner (trange veikryss) og celle-ECM interaksjoner (fokale sammenvoksninger) for å redusere intracellulære overlevelsessignaler og forstyrre aktin cytoskeletal integritet til å indusere anoikis. Stabilisering av fokal adhesjon komplekse signalisering av ECM-komponenter og forhøyet Talin, forbedrer toveis integrin signalering, noe som resulterer i cellulær resistens overfor anoikis (høyre). DZ-50 mål ekstracellulært, inter og intracellulære voksninger og signalmolekyler å indusere anoikis (til venstre).
Diskusjoner
Genome-wide analyse av genuttrykk i DU-145 human prostatakreft -celler viste nedregulering av lovende anti-tumor mål ved den nye kinazolin-derivat DZ-50, inkludert EMT-assosierte gener (integrin-α6, fibronektin og Talin), angiogenese assosiert gener (TSP-1), gener assosiert med inter TJS (claudin- 11 og 14), så vel som serin treonin-kinase 31 (TSK31) og insulinvekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3). Konfokalmikroskopi undersøkelse bekreftet at DZ-50 er rettet mot kritiske proteiner involvert i dannelsen av både TJs og fokale sammenvoksninger, og dermed svekke ekstracellulære interaksjoner, aktin cytoskjelettet integritet og pro-overlevelse intracellulær signalering. Vi har tidligere etablert
in vivo
antitumor handling av DZ-50 i to menneskelige androgen-uavhengig prostatakreft xenografter, PC-3 og DU-145 [7]. Nyere bevis antydet at talin overfører anoikis motstand i prostatakreftceller mot metastaser, via sin evne til å stabilisere fokal adhesjon og forplante fokal adhesjon komplekse signalisering gjennom Akt overlevelse signalering [10]. I denne studien, ved hjelp av to forskjellige androgen-uavhengig menneskelige prostata kreft cellelinjer og DU-145 og PC-3, som
in vitro
eksperimentelle systemer, vi viste at to forskjellige intracellulære samlings vedheft komplekse komponenter, Talin og ILK, blir målrettet av ledelsen kinazolin DZ-50 (fig. 6). Talin overekspresjon overfører ufølsomhet for DZ-50, mens tap av Talin redusert svulst celle overlevelse, migrasjon og vedheft, allergifremkallende prostata kreft celler til anoikis effekt ved DZ-50. De fenotypiske endringer og økt følsomhet for DZ-50 observert i DU-145 celler med lav Talin uttrykk, og PC-3 celler som tap av ILK funksjon, støtte en regulerende rolle for disse to kritiske komponenter av det sentrale vedheft kompleks i kreftcelle anoikis motstand. Figur 6 illustrerer et mekanistisk skjema av DZ-50 mediert anoikis signalering. Tett veikryss er plassert på apicobasal plasmamembranen, som danner en selektivt permeabel barriere avgjørende for væske- og elektrolyttbalansen. Claudins er trans adhesjonsproteiner som spenner inter plass til å danne homo- eller heterodimerer på opposisjonelle celler [22]. Cytoplasmatiske haler av Claudins samhandle med aktin stabiliserende proteiner, zonula occludins (ZO) [23]. Claudin-en oppregulering er assosiert med kolorektal tumorprogresjon via anoikis motstand, bevis knytter anoikis til tett veikryss påvirket av Bcl-2 og AKT overlevelse signalering [24].
målretting av kritisk intra- og ekstracellulære fokale vedheft komponenter i
