Abstract
Innledning
78-kDa glukose -regulated protein (GRP78) blir indusert i kreft mikromiljøet, og kan betraktes som en ny prediktor for respons på kjemoterapi i mange kreftformer. I denne studien fant vi at intracellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS) og nukleær faktor erytropoide 2 relatert faktor 2 (Nrf2) kjernefysisk trans var høyere i grp78 knockdown DLD-1 tykktarmskreftceller sammenlignet med eggekontrollceller.
metodikk /Principal Funn
Behandling med epirubicin i GRP78 knockdown DLD-1 celler forbedret apoptose og var assosiert med redusert produksjon av intracellulær ROS. I tillegg ble apoptose økt ved antioksidanter propylgallat (PG) og ditiotreitol (DTT) i epirubicin-behandlede eggekontrollceller. Epirubicin-behandlede grp78 knockdown-celler resulterte i flere inaktiverte Akt pathway medlemmer, for eksempel fosforylert Akt og GSK-3β, samt nedstrøms mål for β-catenin ekspresjon. Knockdown av Nrf2 med små interfererende RNA (siRNA) økt apoptose i epirubicin behandlet grp78 knockdown celler, noe som antydet at Nrf2 kan være en primær forsvarsmekanisme i grp78 knockdown celler. Vi demonstrerte også at epirubicin-behandlede grp78 knockdown-celler kunne redusere overlevelsesreaksjonsveien signalisering gjennom redoks-aktivering av proteinfosfatase 2A (PP2A), som er en serin /treonin-fosfataser som negativt regulerer Akt veien.
Konklusjoner
Våre resultater indikerer at epirubicin redusert den intracellulære ROS i grp78 knockdown celler, som redusert overlevelse signalering gjennom både Akt sti og aktivering av PP2A. Sammen utgjør disse mekanismene bidrar til økt nivå av epirubicin-indusert apoptose som ble observert i grp78 knockdown cellene
Citation. Chang YJ, Huang YP, Li ZL, Chen CH (2012) GRP78 knockdown Forbedrer apoptose via nedregulering av oksidativt stress og Akt Pathway etter Epirubicin Behandling i tykktarmskreft DLD-1 celler. PLoS ONE 7 (4): e35123. doi: 10,1371 /journal.pone.0035123
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 03.02.2012; Godkjent: 13 mars 2012; Publisert: 18 april 2012
Copyright: © 2012 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Science Council, Taiwan (NSC 99-2320-B-415-002-My3, National Science Council hjemmeside: https://web1.nsc.gov.tw/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
GRP78 er en høvding regulator av endoplasmatisk retikulum (eR) -funksjonen. Rollene til GRP78 omfatter (1) proteinfolding og montering, (2) rettet mot misfolded protein for degradering, og (3) ER Ca
2 + -binding og styring av aktiveringen av transmembrane ER stress-sensorer. Dessuten, på grunn av sin anti-apoptotiske egenskap, er GRP78 indusert i en rekke kreftceller og medikamentresistente cancerceller [1]. Interessant er GRP78 uttrykk betydelig sterkere i tykktarmskreft enn i tykktarm adenom og normalt vev [2]. I tillegg er en fersk studie viste at GRP78 knockdown ikke bare effektivt undertrykt spredning av RKO tykktarmskreftceller, men også indusert tidlig apoptose av cellene [3]. Videre har GRP78 nedregulering vist seg å resultere i tykktarmskreft sensibilisering til paclitaxel-indusert apoptose [4]. Samlet utgjør disse rapportene fremheve den viktige rollen GRP78 i terapeutisk behandling.
Flere cytostatika føre til oksidativt stress ved å produsere reaktive oksygenforbindelser (ROS) og indusere cytotoksisitet og apoptose i kreftceller [5]. Oksidativt stress som oppstår under kjemoterapi kan imidlertid interferere med den cytotoksiske effekten av anticancermidler, som avhenger av den hurtige spredning av kreftceller for optimal aktivitet [5]. Andre studier har også vist at moderate oksidativt stress kan stimulere proliferasjon og overlevelse av kreftceller gjennom kondisjoneringsmekanismer, mens forbedringen av ROS overproduksjon av prooxidants under sterkt oksidativt stress kan føre til apoptose og celledød [6]. I redoks-signalering, spiller Nrf2 en avgjørende rolle i transkripsjon av en rekke gener som bidrar til fase II /III enzymer og forsvar mot oksidativt stress [7]. Det er økende bevis for hyppige mutasjoner av Nrf2 i humane kreftformer, som resulterer i en stor mengde Nrf2 kjernefysisk translokasjon og føre til konstitutiv ekspresjon av cellebeskyttende og avgiftning gener. Vekst fordeler og motstand mot apoptose som tilbys av disse genene gir chemoresistance under behandling [8]. Andre rapporter har også illustrert at behandling med cellegifter aktiverer Nrf2 sti, som induserer cellebeskyttende gener og modulerer kjemosensitivitet i tykktarm kreft celler [9]. Derfor kan inhibering av Nrf2 nukleær translokasjon antas å undertrykke celledeling og øke apoptose i kreftformer. Samlet utgjør disse studiene viser at oksidativt stress og Redox regulering spille viktige roller i kjemoterapi.
Akt er en apoptotisk regulator som aktiveres i mange kreftformer og kan fremme resistens
in vitro product: [10 ]. Overlevelses signaler forårsaket av ulike reseptorer er primært mediert av Akt; således kan den Akt veien fremme resistente fenotyper [11]. Den tilbakevendende deregulering av Akt overlevelse signalveien i kreft har ført til betydelig interesse blant forskere som forsøker å blokkere denne veien for behandlingsformål [12]. Derfor, inhibering av Akt reaksjonsveien blir betraktet som en ny strategi for å sensibilisere kreftceller for legemidler mot kreft [13].
Epirubicin er en doksorubicin-derivat antracyklin analog som har en bedre terapeutisk indeks enn doksorubicin [14]. Med den samme dose, fremkaller epirubicin lavere hematologisk og hjertetoksisitet enn doxorubicin [15]. Mekanismen for epirubicin på cytotoksisitet ser ut til å involvere produksjon av ROS [16]. Til dags dato har den detaljerte anticancer mekanisme av epirubicin i grp78 knockdown tykktarmskreftceller ikke er klarlagt. I denne studien, var vi interessert i å forstå anticancer effekten av epirubicin på apoptotiske potensialet GRP78 knockdown i menneskets tykktarm DLD-en kreftceller. Vi var også interessert i å forstå apoptotiske mekanismen av GRP78 knockdown på oksidativt stress, redox regulering og Akt overlevelse sti under epirubicin behandling, slik at en veiledning kan utvikles for ytterligere antineoplastiske therapeutics for menneske tykktarm kreft.
Materialer og metoder
Cell linje, reagenser og kjemikalier
den menneskelige tykktarmskreft cellelinje DLD-en ble hentet fra Bioresource Collection og Research Center (Hsinchu, Taiwan). RPMI-1640 medium og føtalt bovint serum (FBS) ble oppnådd fra Hyclone (South Logan, UT) og Gibco Inc. (Freehold, NJ), henholdsvis. Arrest-In transfeksjon agenten ble hentet fra Open Biosystems Inc. (Huntsville, AL). Den Nrf2 siRNA, egge siRNA, primære antistoffer mot p-Akt (Thr308), Akt, NRF-2, GSK-3β, β-catenin, SP-1 og GAPDH ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA ). Den Akt kinase assay kit ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Boston, MA). Bio-Rad proteinanalyse-reagens ble anskaffet fra Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). Den Ser /Thr fosfatase testsettet ble kjøpt fra Millipore Corporation (Rica, MA). Propylgallat (PG), ditiotreitol (DTT), propidiumjodid (PI), 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), DNase-fri RNase A, dimetylsulfoksyd (DMSO), trypanblått, anti-actin primær antistoff og andre kjemikalier ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og behandling
DLD-1-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS . Stamoppløsningen av epirubicin ble oppløst i DMSO, og den behandlede konsentrasjon (500 ng /ml) ble fremstilt i RPMI-1640 medium.
Generering av grp78 knockdown DLD-1-celler
Uttrykket av GRP78 ble slått ned i DLD-1 celler med siRNA. I korthet target-sekvensen for det humane GRP78 mRNA var 5′-AAGGTTACCCATGCAGTTGTT-3 «. Det omkastede siRNA-sekvensen var 5»-AAGGTGGTTGTTTTGTTCACT-3 «. Den GRP78 siRNA og egge siRNA ble innsatt i pSUPERIOR vektor og transfisert inn i DLD-1-celler. Celler som ble vellykket transfektert og ble valgt ved antibiotisk resistens, som tidligere beskrevet [17] – [19]. I den foreliggende undersøkelse, ble DLD-1-celler transfektert med GRP78 siRNA heter grp78 knockdown-celler, og DLD-1-celler transfektert med egge siRNA het eggekontrollceller. Ekspresjonen av GRP78 i de omkastede kontrollcellene og grp78 knockdown-celler ble evaluert ved western blotting.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble evaluert av trypan blå eksklusjon assay. -Celler (1 x 10
6) ble dyrket i 60 mm vevskulturskåler i 24 timer. Dyrkningsmediet ble erstattet med nytt medium, og cellene ble utsatt for epirubicin i 48 timer. Etter behandling, ble en blanding fremstilt med en del 0,4% trypanblått og en del cellesuspensjon. Blandingen ble deretter inkubert i ca. 3 minutter ved romtemperatur, ble en dråpe av trypan blå /celleblandingen påføres på et hemacytometer og de ufargede (levedyktighet) og farget (ikke-levedyktige celler) ble hver for seg talt i et hemacytometer.
DNA skade og cellesyklusanalyse
DNA skade og cellesyklusen ble evaluert ved PI farging og flowcytometri. -Celler (1 x 10
6) ble dyrket i 60 mm vevskulturskåler over natten. Dyrkningsmediet ble erstattet med friskt medium, og cellene ble behandlet med epirubicin i 48 timer. Etter behandling ble cellene samlet opp, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS), fiksert i PBS-metanol (1:02, volum /volum) løsning, og holdt ved 4 ° C i minst 18 timer. Etter en PBS-vask, ble cellepelletene farget med en PI løsning (PBS, 40 ug /ml PI, og 40 ug /ml DNase-fri RNase A) i 30 minutter ved romtemperatur i mørke og analysert ved hjelp av et Becton-Dickinson FACScan flowcytometer (Franklin Lakes, NJ). Minst 10.000 celler ble tellet pr prøve, og DNA-histogrammer ble ytterligere evaluert ved hjelp av Modfit programvare på en PC-arbeidsstasjon for å beregne prosentandelen av celler i de ulike faser av cellesyklusen, og for å kvantifisere celler med DNA-skade (subG
1 fase).
intracellulær ROS måling
produksjon av intracellulær ROS ble oppdaget av flowcytometri hjelp DCFH-DA. Etter behandling ble cellene vasket en gang med PBS, ble behandlet med 20 uM DCFH-DA i 30 minutter i mørke, ble vasket en gang med PBS, samlet ved sentrifugering, og suspendert i PBS. Intracellulær ROS nivåer, som ble indikert av fluorescens av dichlorofluorescein (DCF), ble målt gjennom en 530/22-nm barriere filter ved hjelp av en Becton Dickinson FACScan strømningscytometer.
Nrf2 siRNA transfeksjon
for å slå av genuttrykk av Nrf2, tre sett med siRNA oligonukleotider ble utformet: (1) 5′-GCAUGCUACGUGAUGAAGAtt-3 «(fornuft) og 5′-UCUUCAUCACGUAGCAUGCtt-3′ (antisense); og (2) 5»-CUCCUACUGUGAUGUGAAAtt-3 «(sense) og 5′-UUUCACAUCACAGUAGGAGtt-3′ (antisense); og (3) 5»-GUGUCAGUAUGUUGAAUCAtt-3 «(sense) og 5′-UGAUUCAACAUACUGACACtt-3» (antisens). Cellene (4 x 10
5) ble dyrket i 60-mm skåler i 5 ml RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS og transfektert ved 40% konfluens ved å tilsette arrest-In transfeksjon middel (Huntsville, Alabama) og Nrf2 siRNA. Kontrollceller ble behandlet med arrest-In transfeksjon middel og det forvrengte siRNA [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «(sense) og 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3» (antisense)], som ikke fører til den spesifikke nedbrytning av eventuelle meldinger cellulære . Celler ble skylt med medium etter 25 min inkubasjon og deretter holdt i kultur i ytterligere 24 timer. Atom Nrf2 uttrykk ble evaluert av western blotting.
Akt kinase aktivitet assay
Akt kinase aktivitet ble oppdaget ved hjelp av ikke-radioaktivt Akt kinase assay kit. I korthet ble celler dyrket i 60-mm skåler ble behandlet med 500 ng /ml epirubicin eller bærer som kontroll. Etter epirubicin behandling ble cellene vasket to ganger med iskald PBS og høstet med en cellelyseringsbuffer [20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfat , 1 mM β-glycerofosfat, 1 mM Na
3VO
4, og 1 ug /ml leupeptin]. Proteininnholdet ble målt ved anvendelse av en Bio-Rad proteinanalyse reagens. Akt kinase ble immunopresipitert fra celleekstrakt (300 ug protein) ved hjelp av en kule-konjugert fosfo-akt (Ser473) kanin-monoklonalt antistoff og inkubert med forsiktig gynge over natten ved 4 ° C. Pelletene ble vasket to ganger med en cellelyseringsbuffer og deretter vasket to ganger med 500 μ1 av kinasebuffer. Pelletene ble suspendert i 50 ul kinase-buffer supplert med 1 pl 10 mM ATP og en passende mengde av kinase-substrat (GSK-3-fusjonsprotein) i 30 minutter ved 30 ° C. Reaksjonen ble terminert med 25 ul av 3 x SDS-prøvebuffer. Fosforylering av GSK-3-fusjonsprotein ble oppdaget av vestlige blotting med antiphospho-GSK-3α /β (Ser21 /9) kanin monoklonalt antistoff.
Protein fosfatase 2A (PP2A) aktivitetsanalyse
PP2A aktiviteten ble analysert ved anvendelse av Ser /Thr fosfatase assay kit. I korthet ble cellene lysert med lyseringsbuffer som foreslått av den protokoll som inngår i settet. En alikvot tilsvarende 50 ug protein ble anvendt for å evaluere PP2A-aktivitet ved anvendelse av protokollen fra produsenten. Absorbansen av reaksjonsoppløsningen ble målt i 96-brønners plater ved 405 nm i en mikroplateleser (Bio-Rad, Richmond, CA).
Western blot-analyse
etter behandling, cellene ble vasket med PBS, resuspendert i en proteinekstraksjon buffer i 10 minutter, og sentrifugert ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C for å oppnå de ekstraherte proteiner (supernatant). Proteinkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av en Bio-Rad proteinanalyse reagens. De ekstraherte cellulære proteiner ble kokt i ladningsbuffer, og en målt andel svarende til 50-100 ug protein ble separert på en 12% SDS-polyakrylamidgel. Etter elektroforese ble proteinene elektrooverført til en polyvinylidenfluorid overføring membran. Etter blotting ble membranene inkubert med forskjellige primære antistoffer natten over og deretter vasket med PBST-løsning (0,05% Tween 20 i PBS). Etter vasking ble det sekundære antistoff, som var merket med pepperrot peroksidase, tilsatt til membranen i 1 time og deretter vasket med PBST-løsning (0,05% Tween 20 i PBS). De antigen-antistoff-komplekser ble påvist ved forsterket kjemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) med en kjemiluminescens-analysator.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik fra minst tre uavhengige eksperimenter og ble analysert ved hjelp av Student
t
tester. En
P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant [20].
Resultater
GRP78 knockdown forbedret celledød og apoptose indusert av epirubicin behandling
Figur 1A viser uttrykk for gRP78 i eggekontroll DLD-1 celler og grp78 knockdown DLD-1 celler. Grp78 knockdown DLD-1 celler viste en lavere uttrykk for GRP78 enn eggekontroll DLD-1 celler. Vi evaluerte ytterligere celleviabilitet og apoptose etter behandling epirubicin i GRP78 knockdown og kryptert kontroll DLD-1-celler. Figur 1B viser at cellelevedyktigheten var signifikant redusert i grp78 knockdown-celler sammenlignet med de omkastede kontrollcellene etter 48 timer med 500 ng /ml epirubicin behandling. I tillegg apoptose prosentandelen av grp78 knockdown-celler (83,17%) var mye høyere enn den prosentvise observert i de omkastede kontrollcellene (35,12%) 48 timer etter behandling epirubicin (figur 1C). Disse resultater antyder at GRP78 er et målprotein for epirubicin-indusert celledød og apoptose i DLD-1 tykktarmskreft.
(A) Analyse av GRP78 ekspresjon i egge og grp78 knockdown DLD-1-celler ved hjelp av Western blotting . Analyse av (B) cellelevedyktighet og (C) apoptose etter behandling med bærer (kontroll) og epirubicin (epi). Egge kontroll og grp78 knockdown DLD-1-cellene ble behandlet med epirubicin (500 ng /ml) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble evaluert av trypan blå eksklusjon assay. De prosenter av celler som var i subG
1 fase (indikert av DNA-skade) ble bestemt som beskrevet i
Materialer og metoder
. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 5-8) av de individuelle eksperimentene. Signifikante forskjeller for kontrollgruppen og den krypt kontrollgruppen er
P
0,05 (*) og
P
0,05 (#), respektivt. Disse eksperimentene ble utført minst 3 ganger, og en representant eksperimentet er presentert.
GRP78 knockdown redusert epirubicin-indusert intracellulær ROS
For å evaluere den intracellulære oksidativt stress, intracellulær ROS ble evaluert av DCFH-DA flekker i eggekontrollcellene og grp78 knockdown celler. Figur 2A viser at grp78 knockdown celler utstilt 7- til 10-doble større DCF fluorescens enn eggekontrollcellene etter 24-48 timer av kultur, som indikerte at betydelig oksidativt stress eksistert i grp78 knockdown celler. Behandling av eggekontrollcellene med epirubicin resulterte i ROS økning av 1.3- og 1,5 ganger ved 24 og 48 timer, sammenlignet med eggekontrollceller uten epirubicin (figur 2B). I motsetning til dette, ble intracellulær ROS redusert med 0.65- og 0,81 ganger i epirubicin-behandlede grp78 knockdown-celler ved 24 og 48 timer, sammenlignet med grp78 knockdown celler uten epirubicin (figur 2B). Dosen av epirubicin over enn 500 ng /ml økte ikke ROS i den GRP78 knockdown DLD-1-celler. Epirubicin hemmet ROS på en doseavhengig måte i grp78 knockdown DLD-1 celler (figur 2C). Disse resultatene tyder på at intracellulær ROS reduksjon kan forbedre apoptose i epirubicin-behandlede eggekontrollceller. Når antioksidanter PG og DTT, som blir brukt til å redusere intracellulære ROS, ble tilsatt til de epirubicin-behandlede eggekontrollceller, ble apoptose øket fra 35,12% til 53,18% og 83,06%, henholdsvis (figur 2D). Interessant, kunne hverken PG eller DTT alene indusere apoptose i de kodede kontrollcellene.
Kryptert kontroll og grp78 knockdown DLD-1-celler var (A) dyrket i 24 og 48 timer, eller (B) behandles med epirubicin (500 ng /ml) i 24 eller 48 timer. (C) grp78 knockdown DLD-1-cellene ble behandlet med epirubicin (500, 750, 1000 ng /ml) i 48 timer. Intracellulær ROS ble evaluert av DCFH-DA flekker og flowcytometri som beskrevet i
Materialer og metoder
. (D) kodet kontroll DLD-1-cellene ble behandlet med 500 ng /ml epirubicin (epi) alene, 25 uM propylgallat (PG) alene, 1 mM ditiotreitol (DTT) alene eller i kombinasjon med epirubicin PG eller DTT i 48 timer. De prosenter av celler som var i subG
1 fase (indikert av DNA-skade) ble bestemt som beskrevet i
Materialer og metoder
. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 5-8) av de individuelle eksperimentene. En vesentlig forskjell fra kontrollgruppen ble satt til
P
. 0,05 (*)
Nrf2 er involvert i forsvarsmekanisme i grp78 knockdown cellene
Nrf2 er en transkripsjonsfaktor som svarer til intracellulære ROS stimulering og translocates til kjernen ved å binde den antioksydant responselement og transkribere fase II-enzymer. Vi studerte Nrf2 atomtrans i eggekontrollcellene og grp78 knockdown celler. Figur 3A viser at Nrf2 kjernefysisk trans økte omtrent 1,6 ganger i grp78 knockdown celler sammenlignet med eggekontrollcellene. Vi vurderte også om Nrf2 kjernefysisk trans spilte en defensiv rolle mot epirubicin-indusert apoptose i grp78 knockdown celler. Grp78 knockdown-celler ble behandlet med Nrf2 siRNA i 24 timer for å inhibere ekspresjon Nrf2 før inkubering med epirubicin i 48 timer. Etter epirubicin inkubering ble apoptose evaluert ved flow cytometri. Figur 3B viser at, Nrf2 ekspresjon ble betydelig inhibert av Nrf2 siRNA i grp78 knockdown-celler, og figur 3C viser at apoptose ble betydelig øket ved Nrf2 siRNA behandling i epirubicin-behandlede GRP78 knockdown-celler, noe som indikerer at Nrf2 gitt en viktig forsvarsmekanisme når gRP78 ble slått ned i DLD-1 celler.
(A) kodet kontroll og grp78 knockdown DLD-1-celler ble dyrket i 48 timer, og atom Nrf2 ekspresjon ble undersøkt ved western blotting. (B) Den GRP78 knockdown DLD-1-celler ble forbehandlet med egge siRNA (sc) eller Nrf2 siRNA i 24 timer, og atom Nrf2 ekspresjon ble undersøkt ved western blotting. (C) Et GRP78 knockdown DLD-1-celler ble forbehandlet med egge siRNA (scramble) eller Nrf2 siRNA i 24 timer og behandlet med 500 ng /ml epirubicin (epi) for en annen 48 timer. Etter behandling, ble prosentandelen av celler som var i subG
1 fase indikert ved DNA-skade bestemt som beskrevet i
Materialer og metoder
. Disse eksperimentene ble utført minst 3 ganger, og en representant eksperimentet er presentert.
GRP78 knockdown forbedret epirubicin-mediert hemming av Akt veien
Det er økende bevis for at Akt veien gir en forbindelse mellom ekstracellulære overlevelsessignaler og de faktorer som induserer apoptotiske hendelser innenfor celler [21]. For å undersøke hvorvidt den Akt reaksjonsveien er involvert i epirubicin-mediert apoptose, undersøkte vi fosforyleringstilstanden av Akt i de omkastede kontrollcellene og den GRP78 knockdown-celler etter behandling epirubicin. Cellelysater ble fremstilt, og fosforyleringen nivået av Akt ble analysert ved western blotting med anti-fosfo-Akt (Thr308) antistoff. Akt fosforylering ble redusert til en større grad i grp78 knockdown-celler sammenlignet med de omkastede kontrollcellene etter 24 og 48 timer av epirubicin behandlingen (figur 4A). Vi undersøkte også effekten av epirubicin på Akt kinase aktivitet ved hjelp immunoprecipitation og vestlige blotting teknikker. Epirubicin hemmet fosforylering nivået av GSK-3α /3β, (som ble sett med Akt kinase aktivitet) i begge de kodede kontrollcellene og grp78 knockdown-celler, og nedgangen i Akt-aktivitet syntes å være forbedret i GRP78 knockdown celler ved 48 timer (figur 4b). Fordi de siste resultatene har antydet at GSK-3β protein, som er en sentral aktør i stress-responsive apoptose, er en av de nedstrøms protein underlag for Akt kinase [22], kan epirubicin-indusert undertrykkelse av Akt fosforylering hemme Akt-avhengig fosforylering av GSK-3β. For å teste denne muligheten, ble totale proteinlysatene fremstilt av epirubicin behandlet eggekontrollceller og grp78 knockdown celler utsatt for immunblotting med en fosfor-GSK-3β antistoff som spesifikt gjenkjenner GSK-3β fosforylert på Ser-9. Eggekontrollceller og grp78 knockdown celler utstilt betydelig nedgang i GSK-3β fosforylering, og det høyeste nivået av hemning skjedde i grp78 knockdown celler inkubert med epirubicin i 48 timer (Figur 4C). Disse resultatene foreslår at inhibering av Akt signalkaskade ble forbedret av GRP78 knockdown i epirubicin-behandlede celler.
Kryptert kontroll og grp78 knockdown DLD-1-cellene ble behandlet med epirubicin (500 ng /ml) for angitte tider. Fosforylering av (A) Akt og (C) GSK 3β ble evaluert ved western blotting. (B) Akt aktivitet ble bestemt som beskrevet i
Materialer og metoder
. Proteinet på PVDF-membran farget med Coomassie brilliant blue er vist som en intern kontroll. Disse eksperimentene ble utført minst 3 ganger, og en representant eksperimentet er presentert.
GRP78 knockdown forbedret epirubicin-mediert nedregulering av nedstrøms målene i Akt pathway
Vi har undersøkt hvorvidt inhibering av Akt signalveien hatt en effekt på nedstrøms mål i eggekontrollcellene og grp78 knockdown celler behandlet med epirubicin. β-catenin er en GSK-3β mål som er innblandet i apoptotiske motstand og overlevelse signalering [23], og økt ekspresjon av β-catenin har blitt korrelert med øket overlevelse hos kreft [23]. En undersøkelse av β-catenin uttrykk avdekket at det ikke ble vesentlig endret i eggekontrollcellene etter 24 eller 48 timer med epirubicin behandling. En reduksjon i β-catenin ekspresjon, men ble observert etter 48 timer av epirubicin behandling i grp78 knockdown-celler (figur 5).
Kryptert kontroll og grp78 knockdown DLD-1-cellene ble behandlet med epirubicin (500 ng /ml) i de angitte tidsrom, og ekspresjonen av β-catenin ble evaluert ved western blotting. Disse eksperimentene ble utført minst 3 ganger, og en representant eksperimentet er presentert.
GRP78 knockdown forbedret protein fosfatase 2A aktivitet med epirubicin behandling
Ulike studier har vist sammenhenger mellom Akt veien og fosfataser. For eksempel har PP2A vist seg å være et nøkkel Akt fosfatase som kan dephosphorylate Akt på begge Thr og Ser 308 493 rester og blokkere reaksjonsveien Akt [21]. Vi videre undersøkt om uttrykk og aktivitet av PP2A var involvert i epirubicin-indusert apoptose i eggekontrollceller og GRP78 knockdown celler. Figur 6A viser at ekspresjonen av PP2A redusert i de epirubicin-behandlede eggekontrollceller etter 48 timers behandling. Omvendt, ble ekspresjonen av PP2A øket etter 24 timer og ikke reduseres i 48 timer i epirubicin-behandlede grp78 knockdown-celler. Aktiviteten av PP2A var svakt redusert ved 24 timer og signifikant redusert etter 48 timer i epirubicin-behandlede eggekontrollceller. I motsetning til dette, PP2A aktivitet økt betydelig omtrent 2 ganger ved 24 timer i epirubicin-behandlede GRP78 knockdown-celler (Figur 6B). PP2A aktivitet ikke signifikant reduksjon på 48 timer i epirubicin behandlet GRP78 knockdown celler. Disse eksperimentene demonstrerte en klar sammenheng mellom økt PP2A aktivitet og induksjon av apoptose via inhibering av Akt banen i grp78 knockdown cellene under epirubicin behandling. Dette understreket betydningen av GRP78 knockdown for inhibering av DLD-1-celler spredning.
Kryptert kontroll og grp78 knockdown DLD-1-cellene ble behandlet med epirubicin (500 ng /ml) i de angitte tidsrom. (A) Ekspresjon av PP2A ble vurdert ved Western blotting, og (B) aktiviteten av PP2A ble bestemt som beskrevet i
Materialer og metoder
. Disse eksperimentene ble utført minst 3 ganger, og en representant eksperimentet er presentert.
Diskusjoner
Et fellestrekk ved mange kreftformer er deres utvidet nivåer av ROS. Hovedkilden til disse ROS er økt metabolsk aktivitet [21]. Høye ROS nivåer og Nrf2 kjernetrans i grp78 knockdown celler indikerte at GRP78 spiller en redoks homeostatic rolle i DLD-1 celler. I nærvær av GRP78, epirubicin bare induserte et lavt nivå av ROS (mindre enn 2-ganger) i DLD-1-celler, og et lavt nivå av ROS kan resultere i aktivering av spesifikke antioksidanter systemer i kreftceller som kan indusere resistens overfor kjemoterapi. Interessant, antioksidanter DTT og PG både forbedret apoptotisk effekt av epirubicin i eggekontrollcellene. Reduksjonen av ROS av epirubicin i grp78 knockdown cellene fremhevet muligheten for at økt ROS-nivåer i DLD-1 celler kan ha en direkte effekt på celle overlevelse trasé.
GRP78 er en anstand som finnes på akuttmottaket. I trykksvake celler blir ER trans proteiner (perk og IRE1) holdt i en inaktiv tilstand via feste GRP78 på sine ER-lumenal domener [24]. Generelt er de lumenal domener av de inaktive former av PERK og IRE1 består av 1:1 komplekser med GRP78 [25]. Når ER stress oppstår, grp78 disjoins og binder seg med brettede eller misfoldede proteiner, som muliggjør den homo-oligomerisering av ekstra fordel, IRE1 eller begge deler og resulterer i autofosforylering av disse enzymene og aktivering av deres substrater [24]. Nrf2 er et direkte substrat over Perk og en effektor over Perk-avhengige celleoverlevelse [26], noe som forklarer hvorfor det GRP78 knockdown DLD-1-celler uttrykte en stor mengde av atom Nrf2.
Nrf2 virker som en sensor for oksidativt stress og regulerer aktiveringen av defensive gener, noe som fører til beskyttelse av celler mot skadelige virkninger av oksidativt stress og fremmer celleoverlevelse [27]. I mange kreftceller, viser Nrf2 pro-tumorale egenskaper som er lik de av identiske cytobeskyttende gener som kan øke kreftcellen resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter [8]. For eksempel stimulerer fluorouracil den Nrf2 vei, som modulerer kjemosensitivitet og induserer cellebeskyttende gener i HT-29 colon cancerceller [9]. Nrf2 er en avgjørende transkripsjonsfaktor som styrer en beskyttende respons mot giftige fornærmelser fra en omfattende spekter av kjemiske stoffer [25]. I de senere år har undersøkelser vist rolle Nrf2 i å beskytte mot både nye og eksisterende kjemoterapeutiske legemidler i blod kreft [8]. Nrf2 overekspresjon har også blitt observert i bukspyttkjertelkreft [7]. I tillegg er det en undersøkelse vist at overekspresjon av stabile Nrf2 i kreftceller induserer et forbedret nivå av resistens mot kjemoterapeutiske midler, inkludert doksorubicin, etoposid og cisplatin [25]. Andre rapporter har antydet at strategien med å bruke Nrf2 hemmere å forsterke effekten av kjemoterapi ikke er begrenset til kreft narkotika eller visse krefttyper. Faktisk kan Nrf2 hemmere brukes under kjemoterapi å behandle mange typer kreft [25]. Denne studien viste at apoptose ble forsterket av epirubicin behandling i Nrf2 siRNA-behandlede grp78 knockdown celler, noe som tyder på at Nrf2 spiller en avgjørende defensiv rolle i grp78 knockdown cellene.
En fersk studie viste at ved å stanse all Lin et al.
