Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) er små regulatoriske RNA som er involvert i kreft patogenesen og nylig har vist lovende som blodbaserte biomarkører for kreft gjenkjenning. Epitelial eggstokkreft er en dødelig sykdom som forbedret utfall kan oppnås ved vellykket tidlig deteksjon og økt forståelse av molekylære patogenesen som fører til bedre behandling. Et avgjørende skritt mot disse målene er å etablere et helhetlig syn på mirnas uttrykt i ovarialcancer vev samt i normale eggstokkene overflaten epitelceller.
Metodikk
Vi brukte massivt parallell pyrosekvensering (dvs. «454 sekvensering») for å oppdage og karakterisere romanen og kjente mirnas uttrykt i primærkulturer av normal menneskelig eggstokkreft overflaten epitel (slange) og i vev fra tre av de vanligste histotypes av eggstokkreft. Deep sekvensering av små RNA cDNA bibliotek avledet fra normal SLANGE og eggstokkreft prøvene ga totalt 738 710 høykvalitets sekvens leser, genererer omfattende digitale profiler av miRNA uttrykk. Expression profiler for 498 tidligere kommenterte mirnas ble avgrenset, og vi oppdaget seks nye mirnas og 39 kandidat miRNAs. Et sett av 124 miRNAs ble uttrykt forskjellig i normal versus kreftprøver og 38 mirnas ble uttrykt forskjellig på tvers av histologiske subtyper av eggstokkreft. Taqman QRT-PCR utføres på en undergruppe av miRNAs bekreftet resultatene fra sekvensebasert studie.
Konklusjoner
Denne rapporten utvider kroppen av miRNAs kjent for å være uttrykt i epitelial eggstokkreft og gir en nyttig ressurs for fremtidige studier av rollen miRNAs i patogenesen og tidlig oppdagelse av kreft i eggstokkene
Citation. Wyman SK, Parkin RK, Mitchell PS, Fritz BR, O’Briant K, Godwin AK, et al . (2009) repertoar av microRNAs i ovarialcancer som bestemmes av Next Generation Sequencing av små RNA cDNA biblioteker. PLoS ONE 4 (4): e5311. doi: 10,1371 /journal.pone.0005311
Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children forskningsfond, USA
mottatt: 23 november 2008; Godkjent: 07.02.2009; Publisert: 23 april 2009
Copyright: © 2009 Wyman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kostnadene av sekvensering ble delvis defrayed av Roche. Studien ble støttet delvis av eggstokkreft SPORE på Fox Chase Cancer Center (P50 CA083638), Stillehavet Ovarian Cancer Research Consortium Ovarian SPORE (P50 CA83636 til NU og MT), kromosom Metabolism Trening Grant fem T32 CA09657-16 (til SKW ), et fellesskap fra Merck Research Laboratories (SKW) og ved Fred Hutchinson Cancer Research Center og Canary Foundation finansiering (ny utvikling midler til MT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. M. Tewari er betalt medlem av Scientific Advisory Board of Combimatrix, Inc.
Innledning
ovarialcancer er den ledende årsak til gynekologiske kreftrelaterte dødsfall i USA [1], med sent stadium diagnoser ha en 30% fem års overlevelse [2]. Overlevelse kan forbedres ved en bedre forståelse av patogenesen molekyl, noe som kan føre til utvikling av overlegne målrettet terapi, så vel som ved tidligere påvisning av sykdommen på en kirurgisk herdbar fase. Når oppdaget på et stadium der sykdommen er begrenset til eggstokk, for eksempel fem-års overlevelse øker til 80%. Klinisk effektive biomarkører for tidlig deteksjon av kreft i eggstokkene kan betydelig bedre overlevelse og eggstokkreft biomarkører er et viktig område for pågående forskning [3].
microRNAs (mirnas) er en klasse av små (~22 nt) ikke-kodende RNA-molekyler som fungerer post-transkripsjonelt for å regulere genekspresjon [4]. MicroRNAs stammer fra hårnål RNA forløpere som er behandlet for å generere både den funksjonelle moden miRNA og en miRNA «stjerne formen» av tilsvarende lengde avledet fra motsatt tråd av hårnål. MikroRNA-mediert modulering av biologiske systemer har vist seg å bli gjennomtrengt på flere sykdommer, [5], inkludert kreft [6] – [8]. Ekspresjonsmønstre av mirnas korrelerer med vev utstedt [8], [9], prognose [10], [11] og med kliniske kreft oppførsel [12], noe som gjør mirnas verdifulle vev-baserte biomarkører. Videre har vi og andre har nylig vist at tumoravledet mirnas inn i blodbanen ved målbare nivåer, noe som indikerer at mirnas utgitt av tumorvev representere en kraftig ny klasse av blodbaserte, minimalt invasive biomarkører for diagnose av kreft [13] – [16] . Som sådan, det er en sterk drivkraft for en omfattende analyse av miRNA repertoar uttrykt i epitelial eggstokkreft.
Flere nyere rapporter har begynt å prege miRNA uttrykk i eggstokkreft ved hjelp av mikromatriser flekket med sonder for et varierende antall kjente mirnas [17] – [20]. Selv om disse er banebrytende studier, de har også begrensninger. Den fremste av disse er at alle arrays rapportert hittil ha ufullstendig dekning av kjente miRNAs. Av de 959 mirnas og stjerneformer som finnes i miRBase (slipper 12,0) [21], [22], de fleste microarray plattformer påført dato analysen bare noen få hundre mirnas, med den mest omfattende av arrays analysere 470 mirnas og stjerneformer. I tillegg nærmer mikromatriser eneste tiltaket tidligere identifisert mirnas og er ikke utstyrt for å oppdage og profilere nye miRNAs. Dette er en viktig forskjell gjøre gitt at flere rapporter tyder på at et betydelig antall mirnas, spesielt de som kan være celletype spesifikk ekspresjon, gjenstår å bli oppdaget [23], [24]. Til slutt, på grunn av den lille størrelsen på miRNAs og utfordringene for å oppnå ensartede hybridiseringsbetingelser over en hel miRNA microarray, det er potensial for tverr hybridisering av miRNAs som er sterkt relatert i rekkefølge, slik at det noen ganger umulig å definitivt skille mellom mirnas avviker fra hverandre med en eller to nukleotider.
for å overvinne begrensninger forbundet med microarray studier, brukte vi «neste generasjon» sekvenseringsteknologi (spesielt massivt parallell pyrosekvensering ved hjelp av 454 biovitenskap plattform) av små RNA cDNA-bibliotek til mer omfattende karakter miRNA ekspresjon i ovarialcancer, såvel som i primære kulturer av normale eggstokk-overflate epitelceller. Denne metoden, som er basert på 5 «og 3» universal linker ligering /RT-PCR og telling av sekvens lesninger oppnådd for forskjellige mirnas, kan i teorien fange alle mirnas tilstede i RNA prøver (inkludert de av ny sekvens) og tillater presis identifikasjon av mirnas, selv når avviker med kun et enkelt nukleotid. Vi ga en total på 738 710 sekvens leser fra fire små RNA cDNA bibliotek som representerer normal primære humane eggstokkene overflaten epitel (HOSE) kulturer og tre vanlige ovarialcancer undergrupper (serøs, klare celle og endometrioid). Her beskriver vi resultatene av dette arbeidet, inkludert identifisering og profilering av både tidligere kommentert og romanen mirnas uttrykt i eggstokkreft.
Metoder
Ytterligere detaljer vedrørende cellekultur, RNA isolering, små RNA cDNA-bibliotek konstruksjon, massivt parallell sekvensering, beregnings rørledning beskrivelse og miRNA TaqMan kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) er gitt i detalj i supplerende metoder S1 og i [23].
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og klinisk materialer
normale primære humane ovarie flate epitel (SLANGE) celler ble erholdt fra de normale eggstokkene til postmenopausale kvinner ved hjelp av en modifikasjon av den teknikk som tidligere er beskrevet i [25]. I alle tilfeller ble prøvene tatt fra normal-vises ovarie flate epitel, noe som ble bekreftet følgende histopatologisk gjennomgang. SLANGE prøvene ble oppnådd under en protokoll som ble godkjent av Forsknings Review Committee og intern Review Board på Fox Chase Cancer Center fra pasienter som gjennomgår klinisk indisert kirurgi (enten profylaktisk risikoreduksjon salpingo-ooforektomi eller total abdominal hysterektomi med bilateral salpingo-oopherectomy) og som ga skriftlig informert samtykke for vev ikke nødvendig for diagnose som skal brukes til forskning. Primære SLANGE celler ble dyrket ved hjelp av medier som er beskrevet i [26] ved 37 ° C i 5% CO
2.
Eggstokkreft snap-frosne eksemplarer som tilsvarer trinn III /IV ovarialcancer (19 serøs, fire klare celle og 10 endometrioid) inneholdt 70% ondartet epitel cellularity som vurderes av patolog gjennomgang av en tilstøtende farget vev delen. Eggstokkreft prøver ble innhentet fra Stillehavet Ovarian Cancer Research Consortium Repository. Prøvene ble samlet under en protokoll godkjent av Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board og ble innhentet fra pasienter som hadde gitt skriftlig informert samtykke for vev ikke nødvendig for kliniske formål skal brukes til forskning.
RNA ekstraksjon og miRNA bibliotek forberedelse
Normal primære SLANGE kulturer (passasje 4-7) ble lysert i 600 mL Mirvana Lysis /bindingsbuffer (Ambion, Inc., Austin, TX). Vevsprøver (~ 100 mg hver) ble homogenisert i en Qiagen Tissuelyser med 600 mL Mirvana Lysis /bindingsbuffer. Total RNA ble ekstrahert fra begge prøvetyper ved hjelp av Mirvana ™ miRNA isolasjon kit (Ambion) per produsentens protokoll. RNA fra snap-frosset svulster (19 serøs, fire klare celle og 10 endometrioid svulster, henholdsvis) ble slått sammen i henhold til histologisk subtype. MikroRNA kloning ble utført som tidligere beskrevet [27], (https://web.wi.mit.edu/bartel/pub/protocols/miRNACloningUpdate0705.pdf) med modifikasjoner ved forsterkning skritt for å forberede prøvene for massivt parallell sekvensering av 454 miljø- og biovitenskap.
Custom bioinformatiske analyse av data rørledning
Behandling og annotering av sekvenser basert på identiteten til kjente transkribert RNA eller som nye mirnas ble utført ved hjelp av en spesial bioinformatikk rørledning beskrevet i detalj i supplerende metoder S1 .
Måling av miRNA nivåer i RNA fra kliniske prøver ved hjelp TaqMan® QRT-PCR-analyser
Total RNA ble revers transkribert og forberedt for QRT-PCR bruker TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit og miRNA -spesifikke stem-loop-primere (Applied Biosystems, Inc.) som tidligere beskrevet [23]. Data ble analysert med SDS Relativ Kvantifisering Software versjon 2.2.2 (Applied Biosystems, Inc.), med automatisk Ct innstilling for tildeling baseline og terskelen for Ct besluttsomhet.
Resultater
Oversikt over små RNA cDNA biblioteker og 454 sekvense
Small RNA cDNA bibliotekene ble konstruert fra RNA prøve bassenger isolert fra primærkulturer av histologisk normal primærslangen (
n
= 4) og ovarialcancer eksemplarer av serøs ( OSC,
n
= 19), klar celle (OCC,
n
= 4) og endometrioid (OEC,
n
= 10) histologier. Tumorstykkene ble valgt til å inneholde minst 70% maligne epitelceller. Totalt RNA ble størrelsesfraksjonert via polyakrylamidgelelektroforese og små RNA tilsvarende molekylvekt til den modne miRNA populasjonen (18-24 nt fraksjon) ble gel ekstraheres og bearbeides for revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon for å lage cDNA-bibliotek (figur 1A). Massivt parallell pyrosekvensering ved hjelp av 454 Life Sciences «plattform generert 80501 normal SLANGE leser, 273739 OSC leser, 292942 OCC leser, og 91 528 OEC leser (figur 1B). Disse samsvarer 10544 SLANGE, 26849 OSC, 37792 OCC og 13,134 OEC ikke-redundante sekvenser. Jo større antall lyder som tilsvarer serøse og klare celleprøver var på grunn av større dybde av sekvensering (det vil si en større del av sekvenseringsplaten benyttes) snarere enn til noen spesielle variasjoner i løpet bibliotek preparat.
A
. Små RNA ble isolert fra normale primærSLANGE kulturer og fra serøs (OSC), klare celle (OCC) og endometrioid (OEC) eggstokkreft vev. Etter 5 «og 3» linker-ligering, ble RT-PCR utføres for å generere fire uavhengige cDNA-bibliotek av små RNA som deretter ble brukt som templater for massivt parallell pyrosekvensering (454 sekvensering).
B
. Beskrivelse av trinnene i dataanalyse rørledningen. Det første trinnet av dataanalyse var fjerning av sekvensene korresponderende til 18 nt, og 24 nt RNA-markører som var blitt tilsatt i den totale RNA før gelelektroforese. Andel av total leser fra HOSE, er OSC, OCC og OEC datasett klassifisert i egne kategorier og filtrert ut på hvert trinn oppført i tabellen til høyre. På bunnen av bordet, antall «unike sekvenser» representerer de ikke-redundante sekvenser avledet etter kollapset multiplum lesninger av identisk sekvens. Noen kanoniske sekvenser være tilordnet mer enn en locus i genomet. Ved gjennomføring av analysen, 199 sekvenser totalt 215 leser og kartlegging til 568 loci møtte våre kriterier for kanoniske hårnål-avledet sekvenser fra de kombinerte datasett.
Sekvens data ble behandlet ved hjelp av vårt egendefinerte beregnings rørledning (Tall 1B, S1 og tabell S1). De første trinnene i rørledningen identifisert sekvens kamper til databaser av tidligere kommenterte RNA (for eksempel kjent mirnas, andre ikke-kodende RNA, messenger RNA) og til svært repeterende sekvenselementer. Gjenværende sekvenser ble behandlet for å identifisere romanen mirnas (figur S1, detaljer om beregnings rørledning er gitt i supplerende metoder S1). I de neste avsnittene, diskuterer vi i detalj sekvensene matchende til kjente mirnas og identifisering av nye mirnas
mikroRNA profilering. Tidligere kommenterte mirnas
Treff kjente mirnas i miRBase (slipp 12,0. ) [21], [22] representerte 68-73% av lyder, avhengig av datasettet (figur 1B og tabell S1) og tilsvarte en total av 498 kjente mirnas (inkludert stjerneformer). , Uttrykt kloning frekvens av enkelt mirnas som en brøkdel av total lesninger oppnådd fra en gitt prøve, kan anvendes for å sammenligne relative ekspresjon av mirnas mellom prøvene [28] – [30]. Den globale oppsummering av våre 454 sekvense datasett er presentert i figur 2, som viser den relative uttrykk for miRNAs mellom normal primære SLANGE og kreft vev datasett (
A
), samt mellom de tre epitelovarialcancer undertyper (
B
). De mest forskjellig uttrykt mirnas (dvs. ≥4 fold-skifte) er vist som røde prikker. Det er bemerkelsesverdig, men ikke uventet, at eggstokkreft histologisk subtype miRNA profiler var mer forskjellig fra normal SLANGE (
A
) enn de var fra hverandre (
B
). Tabellarisk 454 sekvense data for miRNA overflod i alle datasett, samt miRNA navn og overflod forholdstall for alle parvise sammenligninger mellom prøvetyper, er gitt i sin helhet i tabell S2.
datasett sammenlignes parvis, plotte loggen av fraksjonen av total leser for en gitt miRNA i et gitt datasett mot den tilsvarende verdi i det andre datasettet. For hver tomt, er det bare mirnas som ble sekvensert i begge datasett plottet; mirnas som ble sekvensert bare i en av de to datasettene er ikke vist. Den øverste raden (
A
), sammen eggstokkreft datasett (OSC, OCC og OEC) til normale primære SLANGE kulturer; den nederste raden (
B
), sammeneggstokk tumor histologiske subtyper til hverandre. Røde prikker betegne mirnas som hadde en fold endring ≥4.
overlapping av forskjellig uttrykt mirnas mellom undergrupper er anskueliggjort på Venn-diagrammer i figur 3, som også innlemme mirnas utelatt fra Figur 2 på grunn av null leser i enten vanlig slange eller eggstokkreft prøver. Fra skjæringspunktet mellom de tre grupper i Venn-diagrammer, er det klart at i mange tilfeller mirnas forskjellig uttrykt i ovarian cancer i forhold til normal SLANGE vise det samme mønster av differensiell ekspresjon uavhengig av histologisk subtype. Tabell S3 gir en fullstendig liste over navnene på de enkelte mirnas og uttrykk forhold og
P
-verdier for sammenligninger oppsummert i figur 3.
Venn diagrammer viser antall mirnas forskjellig uttrykt i eggstokkreft histologisk subtyper i forhold til normale primære humane eggstokk overflaten epitel (SLANGE) kulturer. Kriterier for en miRNA som forskjellig uttrykt ble definert av en fold-endring ≥4 med Fishers eksakte test
P
-verdi 5,0 × 10
-6 for mirnas som hadde påvisbare uttrykk i både slangen og eggstokkreft kreftprøver, eller ved en Fishers eksakte test
P
-verdi 5,0 × 10
-6 alene i tilfeller der en fold-endringsverdien var udefinerbar grunn av null leser for en gitt miRNA i enten SLANGE eller eggstokkreft sammenligning prøven. Totalt 74 over-uttrykt mirnas (
Panel A
) og 49 under-uttrykt mirnas (
Panel B
) i eggstokkreft med hensyn til normal SLANGE ble identifisert. MicroRNAs som ble funnet å være konsekvent over-uttrykt eller konsekvent under uttrykt i alle tre eggstokkreft histologiske subtyper er oppført med navn.
Vi sammenlignes direkte miRNA uttrykket mellom eggstokkreft histologiske subtyper ved å utlede uttrykk forholdstall for hver miRNA basert på brøk overflod verdier. Betydning ble vurdert ved Fishers eksakte test. De ti beste mirnas forskjellig uttrykt i hver av de parvise sammenligninger av eggstokkreft histologiske subtyper er oppført i tabell S4 (resultater for alle mirnas er gitt i sin helhet i tabell S2). Blant de mest histologisk subtype-spesifikke miRNAs er MIR-449a (serøs spesifikk), MIR-499-5p /MIR-375 /miR196a /MIR-196b /MIR-182 (endometrioid spesifikke) og MIR-486-5p /MIR -144 /MIR-30A /MIR-199A-5p (klar celle-spesifikke).
Validering av 454 sekvense miRNA uttrykk resultatene etter QRT-PCR.
Vi brukte kommersielt tilgjengelig miRNA TaqMan QRT -PCR analyser som en uavhengig bekreftelse av miRNA differensial uttrykk identifisert av 454 sekvensering. MikroRNA TaqMan QRT-PCR-analyser ble utført for et utvalg av 38 kjente mirnas som ble valgt basert på over- eller under uttrykk med hensyn til primær normal SLANGE, eller basert på differensial uttrykk mellom ulike undergrupper av eggstokkreft (beregnet basert på 454 sekvense data). TaqMan analyser ble utført på prøver av de samme RNA-bassengene som brukes for sekvensering. Trettiseks av de 38 differensielt uttrykte mirnas undersøkt av TaqMan QRT-PCR viste konsistente resultater med dem som ble oppnådd ved sekvensering 454 (figurene 4 og 5, A, B, C). Av de åtte mirnas identifisert ved 454 sekvensering å være overuttrykt i ovarian cancer i forhold til den normale HOSE gruppen (figur 4A), alle åtte vist over-ekspresjon i serøse og klare cellekreft subtyper når målt ved anvendelse av TaqMan QRT-PCR, mens seks av de åtte viste konsistente resultater i endometrioid kreft subtype (Mirs-126 *, – 142-3p, 195, 200a, 200b, 200c, 338-3p, 378 *). Ni mirnas var under uttrykt i eggstokkreft i forhold til normal SLANGE (figur 4B), med alle undertyper som viser konsistente resultater målt ved TaqMan QRT-PCR. Det var seks mirnas som var umulig å oppdage (null leser) i normale SLANGE kulturer (figur 4C), men hadde påvisbare uttrykk i OEC, OSC og /eller OCC i 454 sekvense data, og de likeledes viste økt uttrykk i eggstokkene histologisk subtype prøver versus normal primære SLANGE når undersøkt av TaqMan QRT-PCR (figur 4C).
grafene viser miRNA Taqman QRT-PCR resultater for et utvalg av miRNAs identifisert ved 454-sekvensering for å være over-uttrykk (
Panel A
) eller under uttrykt (
Panel B
) i eggstokkreft i forhold til normal SLANGE. Relativ uttrykk verdier som stammer fra 454-sekvensering vises på venstre del av hver graf for sammenligning. Relative uttrykk verdier av mirnas i endometrioid (OEC, svarte striper), serøs (OSC, hvite søyler) og klar celle (OCC, grå søyler) kreft er avbildet. MicroRNAs som ikke ble oppdaget i normal SLANGE av 454 sekvensering, men ble oppdaget i eggstokkreft er presentert i
Panel C
, hvor mirnas er sortert etter synkende uttrykk (som tilsvarer stigende syklus terskel, Ct) i normal slange. 454 sekvense data er gitt i form av prosentandel av total leser i hver prøve. UD, oppdages av miRNA TaqMan QRT-PCR.
Grafene viser Taqman QRT-PCR resultater for mirnas forskjellig uttrykt mellom eggstokkreft undergrupper, med 454 sekvense-avledet data presenteres for sammenligning i venstre del av hver graf. Relative uttrykk verdier av mirnas spesielt over-uttrykt i endometrioid (
Panel A
, OEC, svarte striper), serøs (
Panel B
, OSC, hvite søyler) og klar celle (
Panel C
, OCC, er grå søyler) kreft avbildet. UD, oppdages av miRNA TaqMan QRT-PCR.
Fifteen mirnas identifisert av 454 sekvensering for å bli uttrykt forskjellig på tvers av eggstokkreft undertyper (figur 5A, B, C) viste lignende uttrykk mønstre når kvantifisert ved qRT- PCR. Åtte mirnas var over-uttrykkes spesifikt i endometrioid kreft i eggstokkene (figur 5A), fire i serøs kreft (figur 5B), og tre i klar celle lungekreft (figur 5C) i forhold til de andre subtypene.
Analyse av sekvense data for å identifisere nye hårnål-avledet små RNA.
Etter å ha validert 454 sekvense resultater tilsvarende forskjells uttrykk for tidligere kommenterte miRNAs, vi neste slått til identifisering av nye miRNA sekvenser. Etter å filtrere ut kamper til tidligere kommentert funksjoner, inkludert messenger RNA, tRNA og andre kjente ikke-kodende RNA, ble de resterende sekvensene justert til referanse menneskelige genom sekvens (NCBI Bygg 36.1) [31]. Sekvenser var nødvendig for å matche det menneskelige genom sekvens perfekt bæres videre for ytterligere matematisk analyse, med det eneste unntaket til dette blir sekvenser som demonstrerte tillegg av 1-3 ikke-malbasert nukleotider på 3 «endestasjonen. I disse tilfellene trimmet vi ikke-malbasert baser fra den opprinnelige sekvensen, og den ble deretter ført videre for analyse [32], [33].
databehandlingstrinnene som er beskrevet så langt, ga 841 normal HOSE, 2840 OSC , 11224 OCC, og 1,764 OEC unike sekvenser som tilsvarer nye små RNA. Disse unike sekvenser tilsvarte 1766 normal SLANGE, 5795 OSC, 19464 OCC og 3301 OEC genomisk loci som potensielt kan generere disse små RNA (figur 1B, Tabell S1). Dataanalysen rørledning neste screenet disse genomiske loci (i tillegg til 100 nukleotider av opp- og nedstrøms flankerende sekvens) for nærværet av en forutsagt hårnål sekundærstruktur ved å beregne fri energi, form sannsynlighet (som bestemt av programmet RNAshapes [34 ]) og Randfold beregnede [35]
P
-verdi av predikerte sekundære strukturer. En detaljert beskrivelse av hårnål folding kriteriene er gitt i supplerende metoder S1 og i [23]. Dette resulterte i 224 normal HOSE, 511 OSC, 500 OCC, og 247 OEC romanen små RNA funnet å være potensielt avledet fra en forløper hårnål struktur.
Sekvenser passerer ovenfor filtreringskriteriene fra de fire datasettene ble deretter kombinert og sortert med hensyn til kromosom koordinater inn i grupper som deler 5 «ender. Fra hver av disse gruppene vi valgte en «kanonisk» sekvens representerer at genomisk locus. De kanoniske sekvensene ble valgt ut fra en felles 5-ende, overflod, og sekvenslengden som beskrevet tidligere [23] (ytterligere detaljer er gitt i supplerende metoder S1). Denne prosessen ytterligere raffinert dataene til en samlet liste over 199 unike sekvenser (potensielt avledet fra 568 genomisk loci) som vi utpekt som «nye hårnål-avledet små RNA» som vi identifiserte nye og kandidat mirnas.
Identifisere nye og kandidat mirnas.
for å finne ut hvilke sekvenser utpeke som nye mirnas, skjermet vi sett nye hårnål-avledet små RNA etter kriterier som ligner de som brukes i andre nylige miRNA oppdagelse studier [23], [33], [36]:
i
. sammenkobling karakteristikker av hårnål,
ii
. tilstedeværelsen av flere leser deler den samme 5-enden,
iii
. Fraværet av merknad indikerer ikke-miRNA biogenesis,
iv
. delt frø region med et kjent dyr miRNA og
v
. Tilstedeværelsen av tilsvar miRNA stjerneskjemaet lest (e). Vi vurderte inkludert fylogenetisk sekvens bevaring som et kriterium; Men dette gjorde ikke legge betydelig til vår analyse som ingen av de nye hårnål-avledet mirnas ble bevart utover primater. Dette er ikke uventet, gitt at de fleste evolusjonært konserverte microRNAs har sannsynligvis allerede blitt oppdaget ved hjelp av beregningsorientert tilnærming følges opp av rettet valideringsforsøk.
Ved hjelp av kriteriene ovenfor, vi identifisert seks nye miRNAs. Alle de seks møtte kriteriene
i Z –
iii Hotell og tre av fem møtte kriteriet
iv Hotell og tre møtte kriteriet
v plakater (Figur 6; flere detaljer er gitt i tabell S5). I tillegg, kartlegge de nye miRNA sekvensene til referanse humane genome sekvensen viste at tre av de seks nye mirnas er til stede i intronene fra andre gener (og kodet på den samme tråd som de respektive vertsgener) (figur 6), mye i likhet med mange tidligere kommenterte mirnas [37], [38]. To av våre nye miRNAs er lokalisert i kommenterte gjentar, men har sterk nok støtte bevis på at de ble utpekt som roman. Sammenheng med den forutsagte forløper strukturen og sekvensen til miRNA stjerneformer svarende til nye mirnas er gitt i figur 6.
Antatte sekundære strukturer for de seks nye mirnas oppdaget i denne studien er vist. Novel miRNA sekvenser er vist i rødt og stjerneformer nye mirnas er vist i blått (hvis det er identifisert i vår sekvense data). Sekvenser er nye med hensyn til miRBase frigjøre 12,0 [21], [22]. Identifikatorer i parentes viser til miRNA stjerneformer hvor disse ble identifisert i de 454 sekvense data. Tilsvarende detaljer om nye mirnas er gitt i tabellen nedenfor hårnål strukturer.
De resterende sekvensene omfatter 181 hårnål-avledet små RNA (tilsvarende 550 genomisk loci). Vi søkte å velge fra denne listen de mest lovende sekvenser for å betegne som «kandidat mirnas» som kan bli bekreftet i fremtiden som
bona fide
mirnas som ytterligere bevis akkumuleres. Kandidat mirnas ble pålagt å møte kriteriene
i-iii Hotell og ha noen ekstra form for støtte bevis (dvs. delt frø region med en kjent miRNA). Dette tillot oss å avgrense en endelig liste over 39 kandidat mirnas (potensielt stammer fra 50 genomisk loci) (tabell S5).
Diskusjoner
Arbeidet rapporteres her var motivert av hypotesen om at hele repertoar av miRNAs uttrykt i eggstokkreft, inkludert potensielt vevs- og kreftspesifikke mirnas, hadde ennå ikke klarlagt. Den massivt parallelle sekvense tilnærming tillater oss å være fullstendig (dvs. identifisere ikke bare kjent, men også nye mirnas), og «digital» natur av dataene tillates en semi-kvantitativ bestemmelse av de relative ekspresjonsnivået i mange mirnas. Ved hjelp av denne tilnærmingen, oppdaget vi seks nye og 39 kandidat mirnas, og avgrenset uttrykk mønster av 498 tidligere kommenterte mirnas i normale primære SLANGE kulturer og ovarialcancer vev. Det er bemerkelsesverdig at av de fire publiserte miRNA microarray studier av eggstokkreft [17] – [20], selv de mest omfattende av tabellen plattformene var begrenset til 470 menneskelige mirnas og stjerneformer [17], mens dagens utgave av miRBase ( frigjøre 12,0) [21], [22] inneholder 969 mennesker mirnas og stjerneformer. Videre 223 av de kjente mirnas vi identifisert og karakterisert i våre sekvense datasett ble ikke representert på selv de mest omfattende microarray. Derfor de resultatene som presenteres her vesentlig utvide bredden i kunnskap om mirnas uttrykt i eggstokkreft.
identifisering av nye miRNAs i våre data er spesielt viktig. Gitt at disse nye mirnas ikke er påvist i flere store miRNA sekvense studier av andre vev, spekulerer vi at de kommer til uttrykk i en eggstokkreft-spesifikk måte, og kan være av spesiell interesse som kreft biomarkører. Fremtidige studier vil være nødvendig for å teste denne hypotesen, samt til å undersøke de biologiske rollene til disse nye mirnas i eggstokkreft patogenesen.
Til sammen har de kjente og nye mirnas identifisert i denne studien gir en pool av kandidat miRNA markører for fremtidig analyse som blodbaserte markører for påvisning av kreft i eggstokkene. Differensial uttrykk mellom normale og maligne tilstander kan gi en metode for prioritering av kandidater fremover. Vi ser også for seg at mirnas som vi har funnet å være forskjellig uttrykt mellom histologiske kreft subtyper kan tjene et dobbelt formål som blodbaserte markører for både kreft deteksjon og histologisk klassifisering.
En av de unike funksjonene i vår studie er bruken av primærkulturer av normale humane ovarie flate epitel som den normale sammenligningsgruppen. Selv om det eggstokk overflaten epitel (sammen med nærliggende distal egglederen epitel) regnes som opprinnelsen til epitelial eggstokkreft [39] de fleste andre miRNA profilering studier har vanligvis brukt hele eggstokken som vanlig sammenligning. Dette er problematisk for å identifisere mirnas som er differensielt uttrykt i ovarian cancer i forhold til det normale, fordi den enkelt celle tykt overflate epitelial lag omfatter langt mindre enn 1% av det cellulære innholdet av hele eggstokk. Utføre sammenligninger av eggstokkreft vev til en passende normal kontroll er en utfordrende problem i eggstokkreft forskning. Vår fremgangsmåte, selv om den unngår problemene forbundet med å bruke hel eggstokk som en vanlig prøve, har den begrensning at vi ikke vet hvorvidt og hvor endringer i mikroRNA ekspresjon kan tilskrives dyrkingsbetingelser som benyttes for primær SLANGE cellekultur. Fremtidige studier som omfatter parallelle analyser av primære cellekulturer avledet fra eggstokk-cancer vev kan ta opp dette spørsmålet.
Selv om bruken av forskjellige typer av «vanlige» eggstokkprøver gjør sammenligning av de data med andre studier vanskelige i de fleste tilfeller
