Abstract
konstitutiv aktivering av transkripsjonsfaktoren nukleær faktor-kB (NF-kB) er involvert i tumorigenesis og chemo-motstand. Som nøkkelen regulator av NF-kB, er IKKβ en stor terapeutisk mål for ulike kreftformer. Trichothecin (TCN) er en metabolitt isolert fra en endophytic sopp i urte plante
maytenus hookeri Loes.
I denne studien, vurderte vi anti-tumor aktivitet av TCN og fant at TCN markert hemmer veksten av kreftceller med konstitutivt aktivert NF-kB. TCN induserer G0 /G1 cellesyklus og apoptose i kreftceller, aktivering av pro-apoptotiske proteiner, inkludert caspase-3, -8 og PARP-1, og redusere ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner Bcl-2, Bcl-XL, og survivin. Reporter aktivitetsanalysen og målgener uttrykk analyse viste at TCN virker som en potent inhibitor av NF-kB signalveien. TCN hemmer fosforylering og nedbrytning av IκBα og blokkerer kjernefysisk translokasjon av p65, og dermed hemmer uttrykk for NF-kB målgener XIAP, cyclin D1, og BCL-XL. Selv TCN ikke direkte forstyrre IKKβ kinase, undertrykker det fosforylering av IKKβ. Overekspresjon av konstitutivt aktivert IKKβ avbrutt TCN indusert kreft celle apoptose, mens knockdown av endogen IKKβ med siRNA sensibiliserte kreftceller mot apoptose indusert av TCN. Videre viste TCN en vesentlig svakere virkning på normale celler. Disse funnene tyder på at TCN kan være en potensiell terapeutisk kandidat for kreftbehandling, målretting NF-kB signale
Citation. Su J, Zhao P, Kong L, Li X, Yan J, Zeng Y, et al. (2013) Trichothecin induserer celledød i NF-kB konstitutivt Aktivert humane kreftceller via Hemming av IKKβ Fosforylering. PLoS ONE åtte (8): e71333. doi: 10,1371 /journal.pone.0071333
Redaktør: Linda Bendall, Westmead Millennium Institute, University of Sydney, Australia
mottatt: 11 april 2013; Godkjent: 27 juni 2013; Publisert: 01.08.2013
Copyright: © 2013 Su et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av de 100 Talenter Program av den kinesiske Academy of Sciences (Y. Li), Major State Basic Research Development Program of China (No. 2009CB522300), Foundation Natural Science of China (No.81173076), og Rekruttert Top talent av realfag og teknologi i Yunnan-provinsen (2009CI120). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
NF-kB transkripsjonsfaktorer består av fem homologe subenheter: rela (p65), relB, Crel (Rel), NF-κB1 (p50 og dens forløper P105) og NF-κB2 (P52 og dens forløper P100) , som virker som forskjellige homodimerer og heterodimerer [1], [2]. I den kanoniske NF-kB vei, kan celler stimulert med forskjellige stimuli, deriblant reaktive oksygenforbindelser, tumornekrosefaktor alfa, interleukin-1 beta, bakterielle lipopolysakkarider, etc. Ved aktivering, den hemmende subenheten IκBα fosforyleres med IKB-kinase ( IKK) kompleks, som deretter ubiquitinmolekyler og degradert gjennom proteasom-reaksjonsveien, fremmer translokasjon av p65 /p50-komplekset inn i kjernen og aktivere ekspresjon av gener nedstrøms [3], [4].
NF-kB signalisering spiller en viktig rolle i regulering av inflammasjon, tumordannelse og utvikling av kreft [5] – [7]. I et bredt spekter av cancere inkludert hematogene-ondartede sykdommer (så som leukemi, lymfom, og multippelt myelom), og faste tumorer (for eksempel lunge, bryst og bukspyttkjertel) -NF-kB er vedvarende aktivert [8], [9]. Aktivering av NF-kB opp-regulerer ekspresjon av anti-apoptotiske gener som koder for Bcl-xL, XIAP, cIAP1 og cIAP2, så vel som proliferativ gener som cyklin D1 og IL-6 [10] – [13]. NF-kB aktivitet er også nært knyttet til metastase og kreft kjemoterapi-motstand. NF-kB-aktivering induserer transkripsjon av gener som er involvert i angiogenese, en kritisk prosess i tumordannelse og metastase [14]. Dessuten, NF-kB-inhibitorer øke følsomheten av cancer til kjemoterapeutiske midler, så som paclitaxol, TNF-α og TRIAL [15] – [17]. Gitt sammenhengen mellom NF-kB og kreft, utvikling av NF-kB inhibitor har et stort potensiale i å undertrykke visse typer kreft spredning samt forbedre eksisterende kreft terapi [18], [19].
maytenus hookeri Loes.
har vært brukt som folkemedisin i lang tid i sørvest Kina på grunn av sin kreft og anti-inflammatorisk aktivitet. Tidligere maytansine ble identifisert for sine anticancer virkning av forstyrrende mikrotubuli [20], [21]. Den deriverte av maytansine, DM1, har vært brukt i trastuzumab emtansine (T-DM1), en ny medikament utviklet for behandling av HER2-positiv brystkreft [22]. Men de kjemiske bestanddeler som er ansvarlige for de anticancer aktiviteter av denne planten fortjener videre leting.
Trichothecin (TCN) er isolert fra endophytic sopp i
maytenus hookeri Loes
. Tidligere rapporter av oss og andre har vist at TCN er involvert med noen anti-tumor aktivitet, men den anti-tumor profilering eller de underliggende mekanismer for disse handlingene mangler [23] – [25]. I foreliggende studie har vi funnet at TCN hemmer veksten av humane kreftceller ved å inhibere NF-kB signalering. Våre data viser at TCN undertrykker aktivering av IKKβ ved å undertrykke dets fosforylering, inhiberer ekspresjonen av NF-kB målgener, og induserer cellesyklus-stans og kreftcelle apoptose. Som en roman hemmer av NF-kB vei, kan TCN vise seg å være et potensielt lovende medikament kandidat i å utvikle nye kreftbehandling.
Materialer og metoder
Cellelinjer
humane kreftcellelinjer, HepG2, A549, PANC-1 og HL-60, humane embryonale nyrecellelinje HEK 293T, human bronkial epitelcellelinje BEAS-2B og human nyre proksimale tubuli epitelcellelinje HK-2 ble kjøpt fra ATCC. Menneskelig colonic epitelial cellelinje (CCD-841-con) var vennlig Gitt av Dr Lin, Li ved Institutt for biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) [26]. Celler ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI-1640, MEM eller DMEM medium inneholdende 10% (v /v) føtalt bovint serum (HyClone, Logan, UT).
Reagenser
Monoklonale antistoffer mot NF-kB P65, PARP-1, caspase-8, BCL-XL, caspase-3, cyclin D1, BCL-2, survivin, fosfor-IKKβ (Ser177), og β-actin samt polyklonale antistoffer mot IκBα, fosfor-IκBα (pS32 /pS36) ble kjøpt fra Santa-Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Den XIAP polyklonale antistoff ble hentet fra Proteintech (Chicago, IL). Monoklonalt antistoff mot fosfor-NF-kB p65 og polyklonale antistoff til totalt IKKβ ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Boston, MA). NF-kB p65 luciferase reporter plasmid (PNF-kB-Luc) ble kjøpt fra Beyotime Institutt for Bioteknologi (Kina). Plasmid pCMV-SPORT6 innsatt med menneskelig RELA sekvens kjører uttrykket av p65 ble hentet fra Thermo Scientific (Rockford, IL). Alexa Fluor 546 konjugert sekundært antistoff, Lipofectamine 2000 ble Z»-Lyte ™ kinase assay kit og IKKβ rekombinant humant protein hentet fra Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, California). Dual-luciferaserapportørplasmid analysesett ble oppnådd fra Promega (Madison, WI). Duplex sirnas med to thymidinrestene (dTdT) ved 3′-enden av sekvensen ble syntetisert på GenePharma (Shanghai, Kina). Rekombinant human TNF-α ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Med mindre annet er angitt, ble alle andre reagenser hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Forbindelser
TCN og andre testede forbindelser ble hentet fra
Trichothecium Roseum
LZ93, en endophytic sopp isolert fra
maytenus hookeri Loes.
, som tidligere beskrevet [24] (strukturer som er angitt i figur 1A og fig S1A).
(A) Kjemisk struktur av trichothecin. (b) Celle cytotoksiske effekter av trichothecin ved suksessive konsentrasjoner. Etter 48 timers behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved anvendelse av MTT-analyser. (C) Annexin V-FITC /PI analyse av apoptose i celler behandlet med TCN i 24 timer. (D) HL-60, ble HepG2, A549 og PANC-1-celler behandlet med TCN i 24 timer og cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse med antistoffer indikert. p-aktin ble brukt som laste kontroller. Hver kolonne representerer gjennomsnitt ± SD av tre paralleller i tre uavhengige eksperimenter.
Cvtotoksisitetsmålinq og IC
50 Fastsettelse
Celleviabilitet ble evaluert av MTT-analyse. Celler ble behandlet med de angitte forbindelser i konsentrasjoner på 0,064, 0,32, 1,6, 8 og 40 pM i 96-brønners plater. Etter 48 timer ble 0,1 mg MTT tilsatt til hver brønn, til en sluttkonsentrasjon på 20%. Celler ble deretter inkubert ved 37 ° C i 4 timer, og absorbansen ble målt ved 595 nm ved hjelp av spektrofotometri. IC
50 verdier ble bestemt ved ikke-lineær regresjonsanalyse ved hjelp GraphPad Prism programvare (GraphPad, Inc., San Diego, California).
luciferaserapportørplasmid analysen
HEK 293T celler transient transfektert med PNF-kB-Luc og PRL-TK (Promega, Madison, WI) plasmider ved hjelp av Lipofectamine 2000 i 4 timer i en 96-brønns plate. Cellene ble så pre-inkubert med forskjellige konsentrasjoner av forbindelsene i 1 time, og deretter aktivert med 25 ng /ml TNF-α i 18 timer. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid Assay kit.
Western blotting
Totalt cellelysater ble utarbeidet ved direkte lysering i 2 × Laemmli buffer (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% β-merkaptoetanol, og 0,004% bromfenolblått). Prøvene ble så fraksjonert i 12% akrylamid-gel, overført til en PVDF-membran (Bio-Rad), og inkubert med spesifikke primære antistoffer, etterfulgt av de tilsvarende peroksydase-konjugerte sekundære antistoffer. Proteiner av interesse ble visualisert ved kjemiluminescens deteksjon på en Imagequant LAS mini4000 (GE Healthcare).
immunfluorescens Farging
For p65 trans eksperiment, ble HepG2 celler dyrket på kammer lysbilder i 24 timer og pre- inkubert med TCN ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av TNF-α stimulering i 20 minutter. For IKKβ fosforylering deteksjon, cellene ble pre-inkubert med TCN ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av TNF-α stimulering i 10 minutter. Celler ble deretter fiksert i fosfatbufret saltvann med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, og deretter permeabilisert i fosfatbufret saltvann med 0,1% Triton X-100. For å observere lokalisering av p65-subenheten, ble celler inkubert med anti-p65-antistoff og tilhørende FITC-konjugert sekundært antistoff før farging av kjerner med DAPI. For IKKβ fosforylering deteksjon ble cellene inkubert med anti-fosfor-IKKβ antistoff og tilsvarende Alexa Fluor 546 sekundært antistoff. Bilder ble senere observert ved bruk av en fluorescens mikroskop (Eclipse Ti, Nikon).
Cell apoptose analysen
Cell apoptose ble analysert ved hjelp av Annexin V-FITC /PI Apoptose kit (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ) ifølge produsentens protokoller. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater ved en densitet på 1,2 x 10
6 celler /brønn. Etter 24 h behandling av forbindelse ved de angitte konsentrasjoner, ble cellene oppsamlet og deretter vasket to ganger med kald PBS, og deretter resuspendert i en bindingsbuffer inneholdende Annexin V-FITC og propidium jod (PI). Etter inkubering i 15 minutter ved romtemperatur i mørke, ble den fluorescerende intensitet måles ved hjelp av et FACSCalibur strømningscytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
Cell Cycle Analysis
HepG2-celler ( 5 x 10
5cells /brønn i 12-brønners plater) ble inkubert med TCN for angitte tidspunkter (8, 16 og 24 h) og konsentrasjoner (1,25, 2,5 og 5 um). Celler ble samlet opp og vasket to ganger med PBS og ble fiksert med 70% etanol over natten. Fikserte celler ble vasket med PBS, og deretter inkubert med 20 ul RNase A (1 mg /ml) i 30 minutter og farget med propidiumjodid (PI) løsning (50 ug /ml endelig konsentrasjon) i mørke i 1 time. Fluorescens intensitet ble analysert ved FACSCalibur strømningscytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Prosentene i cellene fordelt i ulike faser av cellesyklusen ble bestemt ved hjelp av FlowJo 7.6.1.
Overuttrykte IKKβ CA
Konstruksjonen driver uttrykk for en konstitutivt aktiv IKKβ (S177E, S181E) (IKKβ CA) ble hentet fra Addgene (Catalog No.11105) [27]. HepG2 celler ble transfektert med plasmidene hjelp Lipofectamine 2000. Noen 12 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med TCN for ytterligere 24 timer.
RNA interferens
HepG2 celler ble transient transfektert med en egge kontroll siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 «) og IKKβ-siRNA (5′-GGUGGAAGAGGUGGUGAGCTT -3») [28], henholdsvis, ved en konsentrasjon på 150 pmol /60 mm skål ved hjelp av Lipofectamine 2000. Den resulterende testede forbindelse ble senere lagt til de transfekterte cellene 48 timer etter transfeksjon.
IKKβ kinase aktivitet analyse
IKKβ kinase analysen ble utført med Z»-Lyte ™ kinase assay kit følge produsentens protokoller. I korte trekk ble det rekombinante humane proteiner IKKβ inkubert med kinase reaksjonsblandingen med økende mengder TCN eller staurosporin, en kinase-inhibitor, i 1 time. Reaksjonen ble deretter stanset med stopp reagens og fluorescens ble påvist med eksitasjon ved 400 nm og utslipp ved 445 nm og 520 nm ved hjelp av EnVision multimodus Plate Reader.
Resultatene
TCN inhiberer celle vekst og induserer apoptose i NF-kB konstitutivt aktivert kreftceller
Vi undersøkte anticancer aktivitet av TCN ved MTT-cellelevedyktighet analyse i fire kreftcellelinjer som konstitutivt aktivert NF-kB [29] – [32]. I alle testede cellelinjer, TCN viste åpenbar vekstinhibering (figur 1B). IC
50-verdier i HL-60, HepG2, A549 og PANC-1-celler ble 0,18, 0,82, 0,39, og 0,28 uM, respektivt. Annexin V-FITC /PI farging ble ytterligere analysert med hensyn til celle apoptose med flowcytometri. Etter behandling med 5 uM TCN i 24 timer celle apoptose i HL-60, HepG2, A549 og PANC-1 celler bemerkelsesverdig forhøyet til 61,13%, 44,03%, 34,93% og 24,47%, henholdsvis. I mellomtiden, apoptose i normale humane cellelinjer BEAS-2B, HK-2 og CCD-841-CoN var ikke påvirket av behandling TCN, selv ved den høyeste konsentrasjon 5 uM, noe som tyder på TCN besitter selektivitet mot kreftceller (figur 1C). Western blot-analyse viste også at TCN signifikant induserte aktiveringen av caspase-8 og caspase-3, så vel som spalting av PARP-1 i de fire kreftcellelinjer. Proteininnholdet av Bcl-2, en sentral regulator av den indre apoptotiske reaksjonsvei, også ble nedregulert ved TCN behandling. Videre er nivået av Survivin, et anti-apoptotisk protein, dramatisk redusert i TCN behandlede celler, spesielt i HL-60 og HepG2-celler (figur 1D).
TCN inhiberer NF-kB Signalering og induserer cellesyklus-stans på G0 /G1
effekten av TCN på NF-kB signale ble testet i HEK 293T celler transient transfektert med en NF-kB reporter (PNF-kB-Luc) sikret reporter genekspresjon var tydelig aktivert av TNF -α, som ble effektivt inhibert av TCN (figur 2A). For å kontrollere om TCN hemmer den indre NF-kB i kreftceller, studerte vi ekspresjonen av NF-kB målgener i fire NF-kB aktivert cancercellelinjer behandlet med TCN. Protein nivåer av p65, XIAP, cyclin D1, og BCL-xL var tydelig nedregulert i TCN behandlede celler (figur 2B). Siden Cyclin D1 er nødvendig for G1 /S cellesyklusprogresjon, undersøkte vi effekten av TCN på cellesyklus-stans. HepG2-celler ble behandlet med 2,5 uM TCN. Åpen G0 /G1 cellesyklus arrest ble oppdaget så tidlig som 8 timer. Men med forlenge av behandlingen, ble det observert vekst av celler av under G1 fase, noe som indikerer celle apoptose indusert ved TCN (figur 2C).
(A) HEK 293T-celler ble transient transfektert med PNF-κB- Luc plasmider fulgt av behandling med TCN i 1 time før de ble stimulert med 25 ng /ml TNF-α i 18 timer. (B) Lysater fromcells behandlet med TCN i 24 timer ble utsatt for Western blot-analyse med p65, XIAP, cyklin D1 og Bcl-XL antistoffer. (C) HepG2-celler ble behandlet med 2,5 uM TCN til 8, 16 og 24 timer. Celler ble høstet og underkastet cellesyklusanalyse. Prosentandelen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen ble analysert ved FlowJo. Forsøk ble gjort uavhengig av hverandre i tre eksemplarer, er resultatene angitt som gjennomsnitt og standardavvik. Statistisk signifikans ble analysert ved Enveis ANOVA, ** p. 0,01
Vi undersøkte videre effekten av trichothecolone, et derivat av TCN, på cellevekst og NF-kB aktivitet. Trichothecolone er en annen metabolitt isolert fra endophytic sopp i
maytenus hookeri Loes.
, Som deler samme overordnede kjernen med TCN, med unntak av en annen substituent ved 4-OH [24]. Som TCN, trichothecolone også hemmet cellevekst og NF-kB reporter aktivitet (figur S1), men begge aktiviteter er mye svakere, noe som antyder at substituenten ved 4-OH for denne klasse av forbindelser som er avgjørende for deres biologiske aktiviteter.
TCN Hemmer fosforylering og Nedbrytning av IκBα og blokker p65 Nuclear trans~~POS=TRUNC
Vi sjekket effekten av TCN på kjernefysisk translokasjon av p65, en kjennetegnet for aktivering av NF-kB signalering. TNF-α behandling indusert translokasjon av NF-kB fra cytoplasma til kjernen, og TCN vesentlig blokkeres transprosessen i HepG2-celler (figur 3A). Overekspresjon av p65 vesentlig rever den inhiberende effekt av TCN på transkripsjonen av NF-kB reporter (figur 3B). Vi testet deretter effekten av TCN på IκBα fosforylering og degradering. TCN hemmet TNF-α indusert IκBα fosforylering på en doseavhengig måte og vesentlig blokkeres nedbrytningen av IκBα. Mer gripende, har vi funnet at TCN hemmet p65 fosforylering ved Ser536 (figur 3C), som bidrar til nedbrytning av IκBα og aktivering av NF-kB signalering [33], [34].
(A) HepG2 -celler forbehandlet med 2,5 uM TCN ble stimulert med 25 ng /ml TNF-α i 20 minutter og behandles for farging med anti-p65-antistoff. Kjerner av celler ble merket med DAPI (blå) og p65 ble visualisert ved grønn fluorescens. (B) HEK293T celler ble transient transfektert med PNF-kB-Luc og P65 ekspresjonsplasmider fulgt av forbehandling av 0,3 mikrometer TCN og stimulering med 25 ng /ml TNF-α. Rapportøraktivitet, ble deretter målt. (C) HepG2-celler forbehandlet med TCN ble oppsamlet etter stimulering med 25 ng /ml TNF-α i 10 min. Cellelysater ble deretter analysert ved western blot hjelp antistoffer mot fosfor-IκBα, fosfor-p65 og IκBα. Forsøk ble gjort uavhengig i tre eksemplarer, og resultatene er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik. Statistisk analyse ble utføre med t-test, * p. 0,05
TCN Hemmer Fosforylering av IKKβ indusert av TNF-α
Som IκBα og p65 er begge substrater for IKKβ kinase, som aktiveres ved å gjennomgå fosforylering (Ser 177 og Ser 181) og deretter fosforylerer IκBα [35], [36], sjekket fosforyleringen av IKKβ i TNF-a-behandlede HepG2 celler ved immunofluorescens og western blot analyse. Vi har funnet at nivået av fosforylert IKKβ dramatisk redusert etter behandling TCN, med det totale proteinnivå IKKβ uforandret (figur 4A og B). For å bestemme hvorvidt TCN griper med IKKβ kinaseaktiviteten direkte, ble en kinase aktivitetsanalyse utført ved anvendelse av renset human IKKβ rekombinant protein ved hjelp av staurosporin, er en potent kinase inhibitor, som positiv kontroll. Resultatet viste at TCN ikke påvirket kinase aktivitet av rekombinant IKKβ (figur 4C). Disse dataene viste at TCN hemmer NF-kB signalering ved å undertrykke aktivering av IKKβ via blokkere fosforylering.
(A) IKKβ fosforylering ble oppdaget av fosfor-IKKβ antistoff i HepG2 celler stimulert med 25 ng /ml TNF a i 10 min. Celler ble fiksert, permeabilisert, og undersøkt ved fluorescens mikroskop. (B) Western blot-analyse som viser inhiberingen av IKKβ fosforylering i celler behandlet med 2,5 uM TCN. Celler ble samlet opp etter stimulert med 25 ng /ml TNF-α i 10 min. (C) IKKβ kinase-aktivitet ble analysert med rekombinant IKKβ ved hjelp av Z»-lytt ™ kinase assay kit. Fluorescens ble påvist ved 400 nm for eksitasjonsbølgelengdene og 445 nm og 520 nm for de emisjonsbølgelengder. Forsøk ble gjort uavhengig i tre eksemplarer, og resultatene er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik.
TCN indusert kreft celleapoptose medieres ved inhibering av IKKβ Fosforylering
TCN-indusert celledød ble undersøkt i celler overekspresjon konstitutivt aktiv (CA) form av IKKβ [27], [28]. Som vist i figur 5A, overekspresjon av IKKβ CA i HepG2 celler tilstrekkelig aktivert NF-kB signalering i luciferase-aktivitetsanalyse. TCN behandling antagoniserte med TNF-α i aktivering av NF-kB-signalering, mens IKKβ CA transfeksjon effektivt reverseres den inhiberende effekt av TCN. Konsekvent, overekspresjon av IKKβ CA avbrutt TCN indusert celle apoptose i HepG2 celler (figur 5B). I mellomtiden, western blot analyse viste deaktivering av caspase-3, PARP-1 og oppregulering av survivin av IKKβ CA (figur 5C).
(A) HEK 293T celler ble transient transfektert med IKKβ CA eller tom vektor for 12 timer, deretter forbehandlet med 2,5 uM TCN og stimulert med 25 ng /ml TNF-α i 18 timer. Celler utsatt for analyse av luciferase-aktivitet. (B) HepG2 celler ble transient transfektert med IKKβ CA eller tom vektor i 12 timer, og deretter behandlet med 2,5 uM TCN i 24 timer. Celler utsatt for apoptose analyse. (C) HepG2-celler ble transfektert med IKKβ CA eller tom vektor i 12 timer, og deretter behandlet med 2,5 uM TCN i 24 timer. Celler utsatt for Western blot-analyse for ekspresjon av angitte proteiner. (D) HepG2 celler ble transient transfektert med en kodet siRNA eller IKKβ-siRNA i 48 timer, behandlet med 2,5 uM TCN i 24 timer og underkastet analyse apoptose. (E) HepG2-celler transient transfektert med egge siRNA eller IKKβ-siRNA ble behandlet med 2,5 uM TCN i 24 timer. Cellelysater ble oppsamlet og utsatt for Western blot-analyse med de angitte antistoffer. Forsøk ble gjort uavhengig i tre eksemplarer, og resultatene er rapportert som gjennomsnitt og standardavvik. Statistisk analyse ble utføre med t-test, * p. 0,05
Deretter sjekket vi effekten av IKKβ knockdown på apoptotiske aktivitet av TCN. Sammenlignet med behandling med TCN alene, knockdown av IKKβ med siRNA sensibiliserte HepG2-celler til TCN-indusert apoptose, med den apoptotiske forholdet økte til 43,11% (18,17% i TCN behandling alene) (figur 5D). Som vist på figur 5E, ble ekspresjonen av IKKβ i HepG2 delvis redusert ved behandling av IKKβ siRNA. I samsvar med den økte celle apoptose-induksjon, nedregulering av anti-apoptotiske proteiner (Survivin, XIAP og Bcl-2) ved TCN ble forbedret i IKKβ knockdown-celler, og spaltingen av caspase-3 ble øket i tillegg (figur 5E) . I mellomtiden, transfeksjon med en styreegge siRNA hadde ingen effekt på responsen av HepG2-celler til TCN behandling (figur 5D, 5E).
diskusjon
På grunn av forbindelsen mellom NF-kB og kreft, utvikling av NF-kB inhibitor har et stort potensiale i å undertrykke visse typer kreft spredning samt forbedring av eksisterende kreftbehandlingen. I løpet av de siste tiårene, har et variert utvalg av naturlige og syntetiske forbindelser ble funnet i stand til å undertrykke NF-kB signalering, men gjennom en rekke ulike mekanismer. PS-341, en proteasominhibitor, har vært en første-linje legemiddel som brukes i behandling av myelomatose i over et tiår, som virker ved å hemme indre NF-kB aktivitet ved å blokkere IκBα degradering [37]. I mellomtiden, Eriocalyxin B, en ent-Kauranoid isolert fra
Isodon eriocalyx
hemmer NF-kB aktivering ved å forstyrre bindingen av både p65 og p50 til responselementet [38].
IKKβ spiller sentral rolle i aktiveringen av både kanonisk og ikke-kanonisk NF-kB signalveien. Ved aktivering, fører NF-kB signalering til auto polyubiquitination av tumor nekrose faktor reseptor-assosiert faktor 6 (TRAF6). Den ubiquitinmolekyler TRAF6 rekrutterer da den transformerende vekstfaktor-β-aktivert kinase 1 (TAK1) og IKB-kinase (IKK) kompleks, som består av to katalytiske subenheter, IKK1 (IKKα) og IKK2 (IKKβ), og en regulatorisk subenhet, NEMO (NF-kB vesentlig modulator, IKKγ), slik at TAK1 kan fosforylere og aktivere IKKβ. Den auto-fosforylering ble også rapportert å være involvert i aktiveringen av IKKβ [39], [40]. På grunn av hyppig observert rolle at aktiveringen av IKKβ spiller i kreftutvikling, proliferasjon og metastase, er IKKβ vært betraktet som et lovende legemiddel mål for kreftbehandling [41], [42]. En FDA godkjent foreldreløs stoffet til å behandle kreft i bukspyttkjertelen, CDDO-Me, også kjent som RTA 402, blokkerer NF-kB sti gjennom direkte hemming av IKKβ på Cys-179 [43].
I denne studien, vi beskrev TCN, en potent NF-kB inhibitor, blokkerte IKKβ aktivering ved å undertrykke sin fosforylering og senere hemmet uttrykket av målgener av NF-kB signalveien, inkludert XIAP, cyclin D1 og BCL-XL, som regulerer celleoverlevelse og celle spredning. Som et resultat, TCN indusert celle apoptose og cellesyklusarrest i NF-kB konstitutivt aktiverte humane kreftceller uten å påvirke normale celler med lav basal NF-kB aktivitet (figur S2). Tatt i betraktning de komplekse hendelser assosiere med aktivering av IKKβ, presise mekanismene hvordan TCN svekker fosforylering av IKKβ er verdig videre etterforskning.
Metabolitter av endophytic sopp kolonisering i urtemedisin har vist seg å ha ulike bioaktivitet [44 ], [45]. Cytostatika til mange vertsplanter er funnet i metabolitter av de endophytic sopp, som Taxol, som ble isolert fra endophytic sopp
Taxomyces andreanae
i
stillehavsbarlind product: [46]. I denne studien, TCN, sammen med 6β-hydroxyrosenonolactone, trichothecolone, roseocardin og roseotoxin B ble isolert fra endophytic sopp LZ93 av
maytenus hookeri Loes.
Og ble testet for sine kreft aktiviteter (Figur S1). Blant forbindelsene vi isolert, TCN viste seg å være det mest potente. Disse funnene tyder på at egenskapene til TCN kan være en av de potensielle mekanismene bak effekten og anti-kreft aktiviteter
maytenus hookeri Loes.
Tatt på hele, våre funn tyder på at TCN, som en potent hemmer av NF-kB signalering, har lovende terapeutisk verdi for kreftbehandling og fortjener videre leting.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. Bio-aktiviteter forbindelser isolert fra endophytic sopp LZ93 av
maytenus hookeri Loes. Product: (A) Kjemiske strukturer av 6β-hydroxyrosenonolactone (6β-HRL), trichothecolone, roseocardin og roseotoxin B. (B) Cytotoksisk effekter indusert av trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin og roseotoxin B 40 mikrometer i HL-60, HepG2, A549 og PANC-1 celler etter 48 timers behandling. (C) Virkning av trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin og roseotoxin B på TNF-α-indusert NF-kB-aktivering. HEK 293T-celler ble transient transfektert med PNF-kB-Luc og PRL-TK plasmider fulgt av forbehandling med DMSO, eller 0,3, 0,6, 1,25 uM TCN, eller suksessive konsentrasjoner på 2,5, 5, 10 uM av trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin eller roseotoxin B i 1 time før 25 ng /ml TNF-α stimulering i 18 timer. Gradvis mørkere skyggelegging av hver søyle viser høyere konsentrasjoner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071333.s001 plakater (JPG)
Figur S2. Skjematisk diagram av TCN hemming av IKKβ og NF-kB veien.
Ved stimulert av TNF-α, vil et panel av kinaser gjennomgå ubiquitinering og fosforylering, noe som resulterer i aktivering av NF-kB via IKKβ medisinert degradering av IκBα og translokasjon av p65. TCN hemmer fosforyleringen av IKKβ, som igjen resulterer i apoptose og veksthemming i kreftceller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071333.s002 plakater (TIF)
