Abstract
Bakgrunn
epitelcelledifferensiering reaksjon på stress innebærer overføring av signaler mellom tilstøtende celler som kan visualiseres som et kalsium-bølge. I noen celletyper, er denne bølgen avhengig av frigivelse av ekstracellulært trinucleotides fra skadede celler. Spesielt har ekstracellulært ATP blitt rapportert å være kritisk for epitelceller reaksjon på stress og har nylig blitt vist å være oppregulert i tumorer
in vivo
.
metodikk /hovedfunnene
Her identifiserer vi stanniocalcin-en (STC1), en utskilt pleiotropiske protein, som en kritisk formidler av kalsium bølgeutbredelse i monolag av lunge (A549) og prostata (PC3) epitelceller. Tilsetning av STC1 forbedret og blokkerer STC1 reduseres avstanden som en ekstracellulær ATP-avhengige kalsium bølge. De samme effekter ble observert når kalsium ble stimulert ved tilsetning av eksogen ATP. Vi avdekker en positiv feedback loop der STC1 fremmer frigjøring av ATP fra celler
in vitro Hotell og
in vivo
.
Konklusjon /Betydning
resultatene indikerte at STC1 spiller en viktig rolle i den tidlige respons på mekanisk skade av epitelceller ved å modulere signalisering av ekstracellulært ATP. Dette er den første rapporten til å beskrive STC1 som en modulator eller purinergiske reseptor signalisering
Citation. Block GJ, DiMattia GD, Prockop DJ (2010) Stanniocalcin-en Regulerer ekstracellulær ATP-indusert kalsium Waves i Human epithelial kreft celler ved å stimulere ATP versjonen fra tilskuer Cells. PLoS ONE 5 (4): e10237. doi: 10,1371 /journal.pone.0010237
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 16 desember 2009; Godkjent: 16 mars 2010; Publisert: 20 april 2010
Copyright: © 2010 Block et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av NIH tilskudd P40 RR 17 447 og P01 HL 075161. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Stanniocalcin-en (STC1) er et 247 aminosyre protein som utskilles fra celler som et glykosylert homodimer. STC1 ble opprinnelig beskrevet som en endokrin regulator av kalsium og fosfat homeostase hos fisk [1], [2]. Hos virveldyr kan STC1 regulere mineralmetabolismen [3] gjennom modulering av fosfat resorprtion i nyre [4] og tarmen [5]. STC1 ble også implisert i frakopling av oksidativ fosforylering [6], inhibering av makrofag migrerings
in vitro product: [7] og
in vivo product: [8], forhindring av vaskulær permeablization [9], og begge pro- og anti-apoptotiske virkninger [10], [11], [12]. Til dags dato ikke har blitt etablert en mekanisme som STC1 utøver sin pleiotrope effekter. Mer nylig har det blitt klart at STC1 er en spenning som reagerer faktor (Chang et al., 2003), i samsvar med nylige observasjoner at STC1 transkriptet er hurtig oppregulert følgende skadelige signaler [10], [13], [14] .
rollen STC1 i kalsiumhomøostase og vevsskader antyder det kan være involvert i kalsium bevegelse og signalering som er utløst av en rekke mekaniske og andre påkjenninger til cellene. For eksempel reparasjon av epitel-monolag følgende mekanisk ødeleggelse er avhengig av et intercellulært kalsium bølge forplantes fra området av avbrudd i tilstøtende celler [15], [16], [17], [18], [19]. Utbredelsen av kalsium bølgen har blitt tilskrevet enten til gap-junction mediert overføring av kalsium- eller lav-molekylvekt andre budbringere, eller til frigjøring av intracellulære nukleotider fra de skadede cellene som deretter binder seg til reseptorer på naboceller [20], [ ,,,0],21], [22]. Flere rapporter har vist at ekstracellulær adenosin trifosfat (ATP) fremmet reparasjon i de opprevne kulturene ved å stimulere migrasjon og proliferasjon av epitelcellene [15], [18]. Nylig ble det økte nivåer av ekstracellulært ATP anskueliggjort på utviklingen av tumorer
in vivo
, og kan bidra til kreftcelleoverlevelse [23].
ekstracellulære nukleotider modulerer intracellulært kalsium ved å binde seg til en familie av reseptorer kalt P2 purinergiske reseptorer, som hver har en forskjellig affinitet for spesifikke nukleotider. Det er to underklasser av P2 reseptoren: den P2X trimere ionekanaler og P2Y G-protein koblede reseptorer (GPCR). Binding til et P2X-reseptor fører til en konformasjonsendring i den kanal som tillater innstrømning av kalsium og andre ioner, mens P2Y er en G-proteinkoblet reseptor som bruker energien av GTP-hydrolyse for å fosforylere phospolipase C (PLC) etter ligandbinding . PLS kan deretter spalte lipid, phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2), inn inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacyl glyserol (DAG). IP3 binder spesifikke kalsium ionekanaler på det endoplasmatiske retikulum for å frigjøre kalsium inn i cytosol. Av de 12 P2Y-reseptorer, bare P2Y
2 er blitt vist å binde både ATP og par med G
q G-protein underenhet for å initiere frigjøring av kalsium fra intracellulære lagre [24].
her viser vi at forbehandling av epitel-celler i monolagskultur med STC1 dramatisk forbedret kalsiumbølgeforplantning følgende mekanisk ødeleggelse av kulturer. Den samme forbedring ble observert når cellene ble forbehandlet med STC1 og utsatt for eksogen ATP. Vi gir bevis for at STC1 lysfølsomt cellene til ATP oppstrøms PLC, og at blokkering endogen STC1 ved hjelp av en nøytraliserende antistoff hemmet utviklingen av kalsium bølgen. Dette arbeidet gir det første bevis på at STC1 kan modulere en tidlig signal reaksjon etter en mekanisk skade, og impliserer STC1 som en regulator av purinergiske reseptor signalisering.
Resultater
STC1 Forbedret Calcium wave forplantning Etter Mekanisk stimulering av A549-celler
for å undersøke effekten av STC1 på skade-indusert kalsium modulasjon, sammenflytende monolag av lunge epitelceller (A549) var mekanisk stimulert til å sette i gang en kalsium bølge. Bølgeutbredelse ble visualisert ved pre-inkubering av monolaget med en membran som er gjennomtrengelig fargestoff som fluorescerte ved binding av kalsium (Fluo-4).
Figur 1A (Video S1 og S2) viser representative bilder av forplantningen av en bølge kalsium stammer fra skrape området til tilstøtende celler i løpet av 30 sekunder. Avstanden ble kvantifisert ved å måle avstanden mellom den snitt området og den øvre kanten av kalsium bølgen ved hvert tidspunkt. Forbehandling av monolag med STC1 resulterte i en fire gangers økning av kalsiumbølgeutbredelse på 40 sekunder post-skrape (figur 1B) som fortsatte å forplante seg forbi den 40 s tidspunkt (film S2). For å teste om effekten var celletype bestemt, vi gjentok disse studiene i en prostatakreft cellelinje (PC3, Movie S3, S4). STC1 også forbedret kalsium bølgeutbredelse i PC3-celler.
A) Sammenflytende monolag A549 ble merket med Fluo-4 og pre-inkubert med eller uten 500 ng /ml STC1 i 10 minutter forut for mekanisk ødeleggelse. Vist er bilder hentet -1, 0, 10, 20 og 30 s etter avbrudd. Bilder i hver gruppe ble manipulert like hjelp av terskel-funksjonen i Adobe Photoshop for å falske farger bølgen for klarhet (rød). Pilen peker forkant av bølgen. B) Mean avstanden som kalsium bølge over tid i kontroll og STC1 behandlingsgruppene fra A. feilfelt = SD. * = P 0,05. n = 5 filmer. C) Gjennomsnittlig maksimal avstand nås med kalsium bølge med eller uten forbehandling med 500 ng /ml STC2. NS = ikke signifikant. n = 3.
Vi neste undersøkt om STC2, den eneste andre medlem av stanniocalcin familie av proteiner [25], kan påvirke kalsium bølge progresjon under de samme betingelsene. STC2 ikke påvirker kalsium bølge (figur 1C).
Kalsium bølgeforplantning var uavhengig av gap junctions men Avhengig av ekstracellulær ATP
Kalsium bølgeforplantning mellom tilstøtende celler er tidligere blitt tilskrevet lite molekyl overføring av gap junction intercellulær kommunikasjon (GJIC) [20], [26]. For å undersøke hvorvidt GJIC var ansvarlig for kalsium bølgeforplantning, ble A549 monolag forbehandlet med 10, 25, eller 50 uM glycyrrhetinsyre (GA), en kjent inhibitor av connexin-mediert GJIC [27]. Utbredelsen av kalsium bølgen var ikke påvirket, noe som indikerer at kalsiumrespons var uavhengig av GJIC (figur S1).
Andre har rapportert at kalsium bølgeforplantning var avhengig av frigivelse av ATP fra skadede celler i det ekstracellulære miljø [18], [28]. For å bekrefte at skadde celler utgitt ATP, ble monolag skrapt med en pipette tips og aircondition media ble målt for ATP innhold. Det kondisjonerte medium inneholdt 400-ganger mer ATP enn kondisjonert medium fra celler som ikke hadde blitt skadet (figur 2A). For å bekrefte at A549 cellene var i stand til å svare på ATP ved å starte en kalsium-respons, ble Fluo-4 merket monolag behandlet med ATP og analysert av levende celle fluorescerende mikroskopi. ATP behandling hurtig økte gjennomsnittlig pikselintensiteten av det målte område av interesse (figur 2B). For å undersøke om ATP frigjøres fra skrapt celler var ansvarlig for kalsium respons i levende celler, media ble fjernet fra A549 monolag og erstattet med PBS. Den mono ble igjen uforstyrret å generere «No Injury» kondisjonert medium, eller skadet ved å skrape til å generere «skade» kondisjonert medium. Ingen skade skade og kondisjonert medium ble deretter plassert på friske Fluo-4-merket A549 celler og kalsium-responsen ble målt ved fluorescens mikroskopi. Skade kondisjonert medium induced en mer robust kalsium respons enn Ingen skade kontroll (figur 3A; to første radene). Forbehandling av Injury kondisjonert medium med et enzym som hydrolyserer trinucleotides til mononukleotider (250 mU /ml apyrase) fullstendig avskaffet kalsiumrespons. De samme data ble oppnådd ved måling av kalsium-respons i individuelle celler. Igjen, forbehandling av Injury kondisjonert medium med apyrase avskaffet kalsiumresponsen (figur 3B). Skade kondisjonert medium også økt maksimalt kalsium respons i forhold til Ingen skade kontroll i individuelle måleceller, som ble avskaffet ved forbehandling med apyrase (figur 3C).
A) Mean ATP-innholdet av kondisjonert medium fra kontroll eller mekanisk stimulert A549 monolag. RLU, relative luciferase enheter. Feilfelt = SD. * = P 0,05. n = 3. B) ATP (50 mm) alene ble lagt til konfluente Fluo-4 merket A549 celler (vertikal linje). Kalsium-respons ble målt ved fluorescens mikroskopi. n = 4 filmer.
A) Kondisjonert medium fra levedyktig (ingen skade), mekanisk forstyrret (skade) eller mekanisk forstyrret lysat ble behandlet med 250 mU /ml apyrase for 10 min. (Injury + apyrase) ble plassert på et sammenflytende lag av Fluo-4 merket A549-celler. Venstre kolonne: Før tilsetting av kondisjonert medium. Høyre kolonne: 10 s etter behandling med kondisjonert medium. Forstørrelse = 4 ×. Innfelt for hver: Pixel intensitet profil for hele synsfeltet. Innfelte bilder for hver behandlingsgruppe ble manipulert like hjelp av terskel-funksjonen i Adobe Photoshop for å falske farger toppene for klarhet (rød). n = 3 filmer. B) Kalsium respons av 10 individuelle celler følgende tillegg til personskader eller skade + apyrase (250 mU /ml i 10 min) behandlet kondisjonert medium. Arrow Black: Tilsetting av kondisjonert medium. Red Arrow: Bakgrunn Intensitet måling. C) Gjennomsnittlig maksimal intensitet for individuelle celler etter tilsetning av Ingen Skader, Skader, eller skade + apyrase kondisjonert medium. * = P 0,05; n = 30.
STC1 Forbedret ATP-Induced Kalsium Response
For å undersøke om STC1 påvirket ATP-indusert kalsium respons, Fluo-4 merket A549 monolagene ble forbehandlet med 500 ng /ml STC1 i 10 minutter og deretter stimulert med 50 uM ATP. Kalsium-responsen ble deretter målt ved fluorescens mikroskopi. STC1 forbedret midlere fluorescens av et definert område av interesse ved mer enn 2 ganger (figur 4A). For å underbygge våre mikros resultater, vi kvantifisert kalsium-respons ved hjelp av fluorescerende spektroskopi, som tillater oss å teste et bredere spekter av konsentrasjoner av ATP og STC1. A549-celler ble pre-inkubert med 0, 50, 250, eller 500 ng STC1 i 10 minutter. Etter en 4-annet referanse lesning ble ATP injisert automatisk inn i brønner ved en sluttkonsentrasjon på 0,5, 2, 10, og 50 uM. STC1 økte kalsium-respons på en doseavhengig måte; imidlertid, ved høyere doser av ATP, ble STC1 nødvendig ved høyere konsentrasjoner for å ha en forsterkende effekt. Dataene er vist som gjennomsnitt endepunkt kalsium-respons (figur 4B), så vel som en kontinuerlig analyse som strekker seg over 30 s (figur 4C).
A) Midlere kalsium-responsen til Fluo-4-merkede konfluente monolag av A549 celler ble analysert ved hjelp levende celle mikroskopi etter tilsetningen av 50 uM ATP til å få tak (ATP) eller monolag forbehandlet med 500 ng /mL STC1 i 10 minutter (ATP + STC1). Feilfelt = SD. * = P 0,05. n = 3 filmer. B) Midlere kalsium-responsen til Fluo-4-merket A549 monolag analysert ved fluorescens-spektroskopi etter tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av ATP og STC1. Dataene er vist som gjennomsnitt signalintensitet på 25 s etter tilsetning av ATP. Feilfelt = SD. * = P 0,05. n = 4 for hver tilstand. C) Kontinuerlig essay fra B). n = 3 for B, C. D) Måling av enkeltceller fra A avslørte lengre kalsium svingninger i STC1 forbehandlet prøver.
Vi har merket at ATP indusert kalsium svingninger i en liten del (~ 20%) av cellene i hver tilstand. Når cellene ble behandlet med STC1, disse svingninger fortsatte forbi tre minutter, mens kontrollcellene ikke svinge ut over 1,5 minutter. Det var ingen observerbar forskjell i frekvensen for oscillasjonene (figur 4D).
STC1 Forbedret kalsiumrespons Oppstrøms av PLC aktiverings
nukleotid-signalering som fører til intracellulær kalsium frigivelse kan induseres ved binding av ATP enten til P2X familien av ionekanaler, eller P2Y G-protein-koblede reseptorer [24]. For å undersøke hvilke av disse banene var ansvarlige for kalsium induksjon i vår modell, ble Fluo-4 merket A549 monolag behandlet med en P2X antagonist (NF023), eller P2Y pathway antagonister (phosphatidylinositol-spesifikke (PI) PLC-hemmer, D609, og PLC-hemmer , U73122). D609 og U73122 reduserte avstanden og intensiteten av kalsiumbølge følgende mekanisk stimulering ved 20 s stolpe skrape (figur 5A, B); imidlertid, måling av den maksimale avstand som bølgen viste at bare U73122 fullstendig inhibert kalsium bølge (figur 5C). D609 og U73122 også inhiberte aktiveringen av kalsium etter tilsetning av eksogen ATP, mens tilsetningen av NF023 ikke hadde noen effekt (data ikke vist). Selv D609 reduserte avstanden og intensiteten av kalsium bølge, pre-inkubering av cellene med STC1 gjen avstanden av bølgen. STC1 var ikke i stand til å øke kalsium bølge etter inkubasjon med U73122 som indikerer at STC1 var avhengig av kanonisk PLC aktivering (figur 5D).
A) Fluo-4-merkede A549-celler ble stimulert mekanisk i fravær (kontroll) eller tilstedeværelsen av enten en P2X inhibitor (50 mikrometer NF023), PI-PLC pathway inhibitor (50 M D609), eller PLC-hemmer (12,5 mikrometer U73122) t = 20 s etter skade. n = 5. B) Kvantifisering av avstanden som kalsium bølge fra A ved t = 20 s. Feilfelt = SD. * = P 0,05. n = 5. C) Fluo-4-merkede A549-celler forbehandlet i 30 minutter med NF023, D609, ble eller U73122 inkubert med 500 ng /mL STC1 i 10 minutter før skrape. Maksimal avstand av kalsium bølge blir vist. Feilfelt = SD. * = P 0,05. n = 3.
STC1 var nødvendig for forplantning av mekanisk og ATP-Induced Kalsium Wave
observasjon at STC1 handlet oppstrøms PLC bedt oss om å undersøke effekten av endogent STC1 på kalsiumbølgeutbredelse følgende mekaniske stimulering. A549-celler ble pre-inkubert med 1 mg /ml polyklonalt anti-STC1 antistoff som vi tidligere hadde vist seg å være effektiv til å blokkere STC1 [10]. Cellene ble deretter stimulert mekanisk og avstanden av kalsiumbølge ble målt. Forbehandling av cellene med anti-antistoff STC1 reduserte avstanden tilbakelagt av kalsium bølgen sammenlignet med celler forbehandlet med et isotype kontroll-antistoff. Tilsvarende forbehandling av cellene med apyrase reduserte avstanden tilbakelagt av kalsium bølge (figur 6A, B). Videre viste det anti-STC1 behandlede gruppen en hurtig tilbaketrekning av kalsiumbølge (figur 6B), samt redusert kalsiumrespons i tilknytning til skrape område, som målt ved fluorescens mikroskopi (figur 6C; Film S5).
A) Fluo-4-merket A549-monolagene ble mekanisk stimulert i nærvær av isotype antistoff (kontroll), en STC1 blokkerende antistoff (anti-STC1, 1 ug /ml) eller apyrase (250 mU /ml) og analysert ved levende celle mikroskopi. B) Avstand kalsium bølgeutbredelse fra A. Feilfelt = SD. * = P 0,05. C) Kvantifisering av signalintensitet ved å skrape nettstedet etter mekanisk stimulering. Feilfelt = SD. * = P. 0,05
STC1 Forbedret utgivelsen av ATP fra Cells
in vitro Hotell og
in vivo
Vi neste testet om STC1 påvirket utgivelsen av ATP fra ustimulerte epitelceller. Medium fra A549-celler ble erstattet med serumfritt medium med eller uten 500 ng /ml STC1 i 10 minutter og en ATP-testen ble utført. Medium fra STC1 behandlede celler inneholdt to ganger mer ATP (figur 7A). Ingen signifikant forskjell ble observert i lysater fra disse cellene. ATP-nivåer ble normalisert til DNA-innholdet i hver brønn. Lignende resultater ble oppnådd fra mus embryonale fibroblaster fra vill-type og STC1 transgene mus (figur 7B).
A) A549-celler ble stimulert med 500 ng /mL STC1 i 10 minutter. Kondisjonert medium ble samlet og analysert for ATP. Adherente celler ble lysert og målt med hensyn til ATP og DNA-innhold. ATP-verdier ble normalisert til DNA fluorescens. * = P 0,05; n = 3. B) A549-celler ble stimulert med 10 pM ATP i 2, 5 og 10 minutter. Analyse av kondisjonert medium og cellelysater av villtype og STC1 over-uttrykker MEFs. * = P 0,05; n = 3. C) Serum ble isolert fra villtype og STC1 transgene mus og analysert for ATP-innhold. * = P 0,05; n . 17
Resultatene antydet muligheten for at systemisk nivå av ATP kan være forhøyet i STC1 transgene mus. For å undersøke denne hypotesen, plasma fra villtype og transgene mus over-uttrykker STC1 ble samlet og en ATP-testen ble utført. Mus som uttrykker menneskets STC1 transgenet viste økte nivåer av blod ATP sammenlignet med villtype-kontroller (figur 7C).
Diskusjon
Tidligere observasjoner antydet at STC1 er stressrespons protein. Den STC1 protein er 80% identisk mellom fisk og menneske, og 98% identisk mellom mus, rotter, mennesker og andre pattedyr [29]. STC1 knockout mus ikke viser noen åpenlys fenotype [30]; kan imidlertid økte nivåer av STC1 endre muskelfunksjon og bein utvikling og reduksjon reproduksjon [31], [32]. De STC1 mRNA-nivåer ble hurtig oppregulert under hypoksi og etter eksponering for forskjellige cytokiner inkludert tumornekrosefaktor alfa, transformerende vekstfaktor beta, og fibroblast vekstfaktor-2 (G. Block, upubliserte data). Samlet utgjør disse observasjonene støtte videre konklusjonen om at STC1 modulerer signale løpet av de tidlige hendelsene i cellulær respons på stress.
For å undersøke hvilken rolle STC1 i stress, vi ansatt en modell for skade som epitelial monolag ble avbrutt med en mekanisk stimulus å rekapitulere de tidlige hendelsene i såret reparasjon [15], [28], [33]. Vi fant ut at STC1 forbedret hastighet og maksimal avstand på utbredelsen av en ATP-avhengig kalsium bølge. STC2 ikke påvirker kalsium bølge progresjon siden forbehandling av celler med STC2 endret ikke den maksimale avstanden utbredt av bølgen. Vi utledet også at STC1 var avhengig av PLC aktivering i en P2Y G-proteinkoblet reseptor bane, da PLC-inhibitor, U73122, var i stand til å blokkere kalsiumbølgeforplantning i nærvær eller fravær av STC1. Videre er funksjonelt blokkere endogen STC1 ved hjelp av et antistoff inhiberte forplantning av kalsium bølge.
allestedsnærværelsen av nukleotid-signalisering er reflektert av den brede fordeling av P2-reseptorer i forskjellige celletyper [24]. Vår observasjon at STC1 kan megle kalsium aktivering nedstrøms av ATP i lunge epitelceller kan også være aktuelt for andre celletyper og vev. For eksempel, de observasjoner som STC1 fungerte som en selektiv L-kanal hemmer [34] parallelt de tidlige observasjoner som ekstracellulært ATP kan bremse pulsen etter traumatisk sjokk [35], [36]. Videre er involvering av ekstracellulært ATP i regulerings makrofag kjemotakse [16], [18], [37], [38], [39] har på lignende måte blitt definert for STC1 [7]. Videre er våre resultater tyder på at STC1 modulering av purinergiske signalering kan bidra til den åpenbare fenotyper som fremvises av transgene mus som konstitutivt uttrykker STC1.
Selv STC1 forsterker kalsium-respons på nedstrømssiden av ekstracellulære nukleotider i epitelceller, det samme kan ikke bli sant i andre celletyper. For eksempel har STC1 blitt vist å aktivere kalsiumsignalisering i endotelceller [9], men inhiberer kalsiumsignalisering i respons MCP-1 i makrofager [7]. I vår analyse STC1 hadde ingen effekt på kalsium dynamikk når de tilsettes alene til A549-celler (Film S6). Videre ATP kan ikke indusere kalsium utgivelse i alle celletyper, gitt at ATP er en potent suppressor av kalsium aktivering i hippocampus nevroner [40], [41]. De variable effekter av ATP er også reflektert i følsomheten av celler til ATP, som forskjellige celletyper krever ulike konsentrasjoner av ekstracellulært ATP å lokke fram en effekt. Mens A549 celler reagerer på så lite som 0,5 uM ATP, makrofager må vanligvis 100 uM for å svare [42]. STC1 kan spille en rolle i sensibiliserende eller desensibiliserende celler til forskjellige konsentrasjoner av ATP.
Nedstrøms Konsekvensene av STC1-mediert aktivering av en ATP-indusert kalsiumrespons kan ha viktige konsekvenser for microenvironmental signaler som fører til normale stress-respons mekaniske og potensielt giftige fornærmelser. For eksempel kan rollen til STC1 ved reparasjon av en epitelial sår være basert på dens evne til å fremme eller forhindre apoptose av ATP stimulerte celler [43]. Rollen STC1 på purinergiske signale fra celle eller organelle membraner kan ha viktige implikasjoner for nedstrøms kalsium bevegelse i og mellom skadde celler. Dette har vært utfordrende delvis på grunn av mangel på tilgjengelige bioassay for STC1. Arbeidet vi har presentert her etablerer et bioassay for STC1 aktivitet for å legge til rette for en dypere forståelse av sin struktur og funksjon i en rekke celletyper og fysiologiske situasjoner.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Mus ble plassert og brukes i henhold til protokoller godkjent av Universitetet Council on Animal Care ved University of Western Ontario.
Cell Kultur og reagenser
Menneskelig A549 lungekreft epitel celler og PC3 prostatakreftceller ble oppnådd fra American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA, www.atcc.org). Mus embryonale fibroblaster og plasma ble oppnådd fra villtype og human STC1 transgene mus som tidligere beskrevet [44]. Alle celler ble opprettholdt i Dulbeccos minimal essensielt medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, www.invitrogen.com) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Norcross, GA, www.atlantabio.com) og 100 U penicillin /100 ug streptomycin (Invitrogen). Reagenser var kjøp fra følgende kilder: ATP fra Teknova (Hollister, CA, www.teknova.com); apyrase fra New England Biolabs (Ipswich, MA, www.neb.com); glycyrrhetinic syre fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, www.sigmaaldrich.com); rekombinant humant STC1 og STC2 som en FLAG-Tagged fusjonsprotein preparert fra humane celler fra BioVendor (Modrice Tsjekkia, www.biovendor.com); geit polyklonale antistoffer og mus monoklonalt (klone 380715) anti-STC1 antistoff fra R Melville, NY, www.nikoninstruments.com). Celler og mikroskop ble innkapslet i en 37 ° C miljøkammeret (In Vivo Scientific, St Louis, MO, www.invivoscientific.com). Bilder ble tatt på 2 bilder /sek i minst ett minutt med NIS Elements programvare. En 4X objektiv ble brukt (CFI Plan Fluor 4X /0,13 17,1 mm; Nikon Instruments). Fluo-4 var spent ved hjelp av en 488 nm eksitasjon filter, og oppdaget ved 520 nm emisjon
Mekanisk stimulering av A549 celler ble utført manuelt ved å opprette en lineær scratch med en bøyd P200 pipette (epTIP;. Eppendorf, Hamburg Tyskland, www.eppendorf.com). For å vise kalsium bølger i hver figur mer tydelig, ble alle bildene i hver tilstand justeres samtidig bruk av Adobe Photoshop terskelen funksjon slik at piksler over en vilkårlig satt terskelen ble rød.
flourescensspektroskopi
Fluo-4-merkede celler dyrket på 48 eller 96-brønners plater ble inkubert ved 37 ° C i et fluorescens-spektrofotometer utstyrt med to reagens- injektorer (FluoStar Omega, BMG LABTECH, Offenburg, Tyskland; www.bmglabtech.com). Den første injektor ble programmert til å gi økende doser av ATP etter 4 sekunder baseline lesing. Den andre injektor ble programmert til å gi reagens buffer før ATP slik at volumet for hver avlesning holdt seg konstant. Brønnene ble analysert ved 480 exitation /520-utslipp. Data fra hver tilstand grunnlinje trekkes. Fluorescent intensitetsmålinger ble tatt hver 0,5 sek på 480 aktivitet og analysert ved hjelp av dataanalyse programvare BMG Omega programvare og Microsoft Excel.
In Vitro
ATP Analyser
ATP ble analysert ved hjelp av et luciferase-basert protokoll i henhold til produsentens instruksjoner (CellTitre-Glo, Promega; www.promega.com). For å kvantifisere indirekte cellenummer, ble 20 ml av luciferase-reagens tilsatt 50 mL av en DNA-interkalerende fargestoff (CyQuant; Invitrogen). En enkelt volum av reagens ble tilsatt til et likt volum av kondisjonert medium. Halvparten av prøven ble deretter undersøkt for luciferase og resten for fluorescens (480/520 exitation /emmision) ved anvendelse av en plateleser stand til å påvise både fluorescens og luminescens (FluoStar Omega, BMG Labtech).
ATP-analysen i mus Plasma
blod ble oppsamlet fra human STC1 transgene hannmus (linje 2) [32] og villtype-hanner (2-4 måneders alder) av samme genetisk bakgrunn (C57BL /6 x CBA) ved hjelp av heparin til forhindre koagulasjon. Typisk ble oppsamlet 300-400 ul per mus og straks blandet med stopp-løsning ved romtemperatur for å minimalisere utslipp av ATP fra blodplater og ATP nedbrytning av ATPase [45]. Den stopp løsning var 3 mM EDTA, 118 mM NaCl, 5 mM KCl, 40 mM tricin buffer, 5 nM nitrobenzyl thioinosine, 10 mm forskolin, 100 mikrometer isobutylmethylxanthine. Blodet ble umiddelbart sentrifugert ved 13 000 x g i 3 minutter ved romtemperatur og 50 pl av plasma ble anvendt i duplikat for å utføre indirekte ATP-målinger ved hjelp av CellTiter-Glo Assay (Promega) i henhold til fabrikantens instruksjoner. Den selvlysende signal ble målt ved hjelp av en Berthold Lumat LB9507 luminometer og relative lysenheter ble omdannet til ATP konsentrasjoner ved hjelp av en standardkurve.
Bilde- og filmanalyse
Bildeanalyse ble utført ved hjelp av Nikon NIS Elements programvare (Nikon) eller ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij). For å kvantifisere den avstand av kalsium bølge, ble bildene ervervet 10, 20, 30 og 40 s etter skrape. For hvert bilde, ble 5 linjer trukket vinkelrett i forhold til kanten av skrape til tuppen av kalsium bølge. Avstandene på linjene ble registrert og i gjennomsnitt i over fem filmer per tilstand.
Statistiske analyser
Hvor to midler ble sammenlignet, ble en to-tailed T-test utført ved hjelp av Microsoft Excel. Under omstendigheter hvor mer enn to midler ble sammenlignet, ble null-hypotesen forkastet ved hjelp av en analyse av varians. Teller ble analysert ved hjelp av en multi-variable beredskap bord og chi-squared test med INSTAT statistisk programvare.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Calcium wave forplantning var uavhengig av Gap Junction inter Communication. A549 monolag ble mekanisk stimulert etter preinkubering med med 10, 25 eller 50 mikrometer glycyrrhetinic syre og analysert av levende celle mikroskopi. . Forstørrelse = 40 ×
doi: 10,1371 /journal.pone.0010237.s001 plakater (0,30 MB TIF)
Movie S1.
