Abstract
Bakgrunn
ErbB2 er medlem av epidermal vekstfaktor familie av tyrosinkinaser som er sentralt involvert i patogenesen av prostatakreft og flere studier har rapportert at en høy ekspresjon av dette protein har prognostisk verdi. I denne studien har vi undersøkt om svulst ErbB2 immunoreaktivitets (ErbB2-IR) har klinisk nyttig prognostisk verdi, det vil si at det gir ekstra prognostisk informasjon til det som tilbys av rutinemessige kliniske tester (Gleason score, tumor stadium).
metodikk /Principal Funn
ErbB2-IR ble målt i en godt karakterisert vev microarray av svulsten og ikke-maligne prøver innhentet ved diagnose. I tillegg ble mRNA-nivåer av ErbB2-IR i prostata bestemt i rotte følgende manipuleringen av sirkulerende androgen-nivåer. Tumor ErbB2-IR var signifikant assosiert med den nedstrøms signalmolekyl fosforylert Akt-og med den celleproliferasjon markør Ki-67. Den betydelige sammenslutning av tumor ErbB2-IR med Gleason score på diagnosen ble tapt da kontrollert for foreningen av begge parametrene med Ki-67. I rotte prostata, ble mRNA for ErbB2 omvendt assosiert med sirkulerende androgen-nivåer. Det var ingen sammenheng mellom ErbB2-IR og androgen reseptor (AR) -IR i svulstene, men et samspill mellom de to parametrene ble sett i forhold til deres tilknytning til tumorstadium. Tumor ErbB2-IR ble bekreftet å være en prognostisk markør for sykdomsspesifikk overlevelse, men det gjorde ikke gi betydelig additiv informasjon til Gleason score eller å Ki-67.
Konklusjon /Betydning
det konkluderes med at svulsten ErbB2-IR er av begrenset klinisk verdi som en prognostisk markør for å hjelpe behandling beslutninger, men kan være av patofysiologisk betydning i prostatakreft
Citation. Hammarsten P, Winther J, Rudolfsson SH, Häggström J, Karalija A, Egevad L, et al. (2014) ErbB2 Receptor immunreaktivitet i Prostate Cancer: Forholdet til androgen Receptor, sykdommens alvorlighetsgrad ved diagnose og sykdom utfallet. PLoS ONE ni (9): e105063. doi: 10,1371 /journal.pone.0105063
Redaktør: Ramin Massoumi, Universitetet i Lund Sverige
mottatt: 16 februar 2014; Godkjent: 19 juli 2014; Publisert: 12. september 2014
Copyright: © 2014 Hammarsten et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Vetenskapsrådet (Grant ingen 12158, medisin, CJ Fowler.); den svenske Cancer Society (. Grant ingen CAN2010 /437, C.J. Fowler); Løve Cancer Research Foundation, Umeå universitet (P. Hammarsten og C.J. Fowler); Kreft Research Foundation i Nord-Sverige (P. Hammarsten), og forskningsmidlene av Det medisinske fakultet, Universitetet i Umeå (C.J. Fowler). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ErbB2 (Her-2 /neu) er et medlem av den epidermale vekstfaktor-familie av tyrosinkinaser som er involvert i en rekke cellulære responser, inkludert apoptose, migrering, vekst, differensiering og adhesjon [1]. ErbB2 danner heterodimerer med andre medlemmer av ErbB-familien, og initierer en kaskade av signalveier, inkludert aktivering av overlevelsesfaktor Akt [1], [2]. ErbB2 er også funnet i tumorceller, og trastuzumab, en ErbB2-monoklonalt antistoff, blir brukt for adjuvant behandling av ErbB2-positiv brystkreft. Andre ErbB2 monoklonale antistoffer er også under klinisk utvikling [3].
Betydningen av ErbB2 i patogenesen av prostatakreft (PCA) er mindre klart. PCA vekst er regulert av androgene reseptorer (AR), og en nøkkel behandling av androgen-avhengige PCA er en reduksjon av androgennivåer enten ved kirurgisk eller medisinsk kastrering. Imidlertid er effekten av behandlingen er forbigående, og kreft blir androgen-resistente. I 1999, Craft et al. [4] rapporterte at innføringen av ErbB2 inn i LNCaP androgen-avhengige PCA-celler utførte dem delvis resistente mot vekst-inhibering produsert av androgen deprivasjon. Videre, i en xenograft modell ved hjelp av kastrerte mus, ErbB2-uttrykkende celler produsert en hurtigere dannelse av tumorer enn de ikke-transfekterte LNCaP-celler [4]. Den prediktive validiteten av xenograft modeller er kontroversielt [5], men en økt forekomst av metastaser har blitt rapportert i en orthotopic modell av Pca etter injeksjon i ventral prostata av nakne mus ved NBE-1,4 rotte prostata celler overekspresjon rotte homolog av ErbB2 [ ,,,0],6]. Motsatt, behandling av BALB /c naken mus med en ErbB2 antistoff redusert tumorvekst etter injeksjon av 22Rv1 PCA celler [7]. Fjerning av androgener fra cellekulturmediet øker ErbB2-ekspresjon [8], og en liten økning i ErbB2-ekspresjon i syv dager etter kastrering er sett i en xenograft modell av tumorvekst med CWR22 celler [9].
Mens studier av cellelinjer og dyremodeller peker til en sentral rolle av ErbB2 i patogenesen av PCA studier hos mennesker er mindre klar. Ulike studier har rapportert svært store variasjoner i nivåene av ErbB2 uttrykk i prostata tumorvev (se [10] og referanser deri). Men en meta-analyse av litteratur mellom 1996 og 2009 fant en økt relativ risiko for død på grunn av Pca eller biokjemiske (prostataspesifikt antigen, PSA) tilbakefall av sykdommen hos pasienter med moderat til høye nivåer av tumor ErbB2 uttrykk [11 ]. Disse forfatterne konkluderte med at «videre kliniske forsøk bør teste hypotesen om at HER-2 /neu er en markør av en klinisk dårligere resultat for pasienter med prostatakreft og et potensielt mål for terapi». En slik etterfølgende etterforskning i en stor ( 1700) antall pasienter bekreftet at de prognostiske egenskaper ErbB2 overuttrykk med PSA tilbakefall som endepunkt, selv om det ikke gir additiv prognostisk informasjon til at gitt av Gleason score, svulsten scenen og preoperativ PSA nivå [10]. Selv om pasientene ble ikke behandlet under oppfølgingsperioden ble prøvene oppnådd ved radikal prostatektomi snarere enn ved diagnose. Det er derfor viktig å bestemme hvorvidt ErbB2 har en bedre prognostisk verdi (dvs. gir additiv informasjon til den som er angitt ved hjelp av Gleason ballen og andre prognostiske markører) i en kohort av pasienter hvor vevsprøver ble oppnådd ved diagnose og den naturlige progresjon av sykdommen kan studeres. Dette har blitt undersøkt i denne studien.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Den menneskelige materialet ble samlet i henhold til svensk lov i en tid da informert samtykke ble ikke nødvendig . Den forskningsetiske komité ved Umeå universitet sykehus (Regional Etisk Review Board i Umeå) godkjent av studien (nr. 02-283) og fravikes behovet for samtykke.
Etisk tillatelse (nr. A110-12) for dyreforsøk ble hentet fra den lokale dyre etisk komité (Umeå etiske komité for dyrestudier, Sverige).
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP
kohorten brukt er fra en rekke av 412 menn som ble diagnostisert med prostatakreft etter transuretral reseksjon for lavere urinveis symtoms [12]. Sakene ble samlet mellom 1975 og 1991 på Central Hospital, Västerås, Sverige, en periode da PSA-testing var ikke rutine. Siden pasientene ble diagnostisert etter operasjonen, hadde de ikke fått hormonell behandling eller strålebehandling før transurethral reseksjon. Prøvene ble deretter formalinfiksert og parafin-innleiret. Bruke kjerner (diameter 0,6 mm) vevet mikromatriser ble gjort ved hjelp av en Beecher instrument (Sun Prairie, WI, USA). For hver pasient, opptil åtte kjerner (vanligvis 5) av svulstvevet og opp til fire prøver av ikke-ondartet vev fra hver pasient ble plassert [12].
ErbB2 immunoreaktivitets (ErbB2-IR) i Pca mikromatriser
De 4 mikrometer parafininnstøpte vev mikromatrise seksjoner ble plassert på lysbilder, bakt ved 60 ° C, 1 time og deretter deparaffinised og vannes ut. Peroxide blokk med 3% H
2o
2 i metanol i 20 min ble foretatt. Antigen gjenfinning ble utført med deler som er plassert i en citratbuffer pH 6,0 og dampet i en mikrobølgeovn i 2 minutter. Oppløsningen fikk avkjøles i 5 min, vasket i destillert vann og deretter TBS-buffer. Proteinet-blokken (DAKO, Stockholm, Sverige) ble utført i 15 minutter, hvoretter delene ble utsatt for den primære monoklonale antistoff (mus c-erbB-2 Prediluted Cocktail antistoff (PM070AA), Biocare, CA, USA) i 2 timer i RT. Da det sekundære antistoff (heste anti-mus (BA-2000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ble inkubert ved 30 minutter ved romtemperatur, fulgt av avidin-biotin kompleks merking i 30 minutter ved romtemperatur ved hjelp av Elite ABC Kit (Vector Laboratories ) og til slutt DAB (DAKO) forbedring i 40 s ved RT.
tumor (n = 1822) og ikke-maligne (n = 1170) kjernene ble scoret for ErbB2 i prostata epitel-celler og tumorceller fra skannes digitalt bilder av en evaluator (JW) som ikke gjorde det på tidspunktet for evalueringen har tilgang til de kliniske data. De tumorprøver ble bedømt på basis av immunoreaktivt intensitet (som varierer fra 0 = ingen flekker til 4 = maksimal farging) og fordeling (0, 25, 50, 75, 100%). Merk at fordelingen skårer ikke inkluderte stroma, siden dette ikke uttrykke ErbB2-IR. Således kan en prøve med bare en liten andel av epitelceller, men med en stor mengde av stroma fremdeles resultat en fordeling på 100% og en intensitet på 4. Deretter, for hver kjerne en sammensatt verdi ble bestemt (mellom 1-4). For eksempel, en kjerne med hvor 25% av scorable prøven hadde intensitet 2 og 75% hadde intensitet 3 vil motta et sammensatt score på (0,25 x 2 + 0,75 x 3) = 2,75. Medianverdier ble deretter bestemt for hvert enkelt tilfelle. For å bestemme konsistens, ble 301 kreft kjerner scorte og deretter rescores. Interclass korrelasjonskoeffisient for konsistens (blandet modell) ga Cronbachs alfa på 0,90, 254 av 301 score var innenfor 0,5 rille enheter av hverandre. De ikke-maligne kjerner ble i tillegg scoret for basal og luminal celler separat, når det er mulig. Noen kjerner (n = 482) hadde klart identifiserbar basal og luminal celler og disse har blitt returnert som basal og luminal i databasen. En diffus basal lag (n = 436) ble sett i noen andre kjerner og i de resterende kjernene (n = 252) basal celler kunne ikke bli identifisert. Disse kjernene ble ikke brukt her, så det bør bli husket som en påminnelse at resultatet for basal og luminal ikke-ondartet ErbB2-IR representerer et begrenset datasett. Ki67 indeks, Pakt-IR, androgen reseptor (AR)-IR og kliniske karakteristika for hver pasient var tilgjengelige i databasen, og har blitt rapportert i helt eller delvis tidligere [12] -. [15]
dyr og behandlinger
Førti-to voksne Sprague-Dawley rotter (284-430 g) ble bedøvet med pentobarbitalnatrium (50 mg /kg) og kastrerte via pungen. Seks intakte dyr fungerte som kontroller. Etter 7 dager tjueen av dyrene mottok en subkutan injeksjon av langtidsvirkende testosteron (5 mg /kg, Sustanon, Organon, Oss, Nederland) gitt som en enkelt dose annenhver dag, som tidligere beskrevet [16]. Prostatavev ble fjernet på forskjellige tidspunkter etter kastrering (1, 3, 7 dager) og til forskjellige tider etter kastrering + testosteronbehandling (1 dag, 2 dager, 3 dager) og frosset i flytende nitrogen. Det var syv grupper, inkludert kontrollgruppa og hver gruppe besto av seks dyr.
eksperimentell design med denne studien gikk i henhold til retningslinjene for stell og håndtering av forsøksdyr og ble godkjent av den lokale dyreetisk komité ( Umeå etiske komité for dyrestudier, Sverige). Dyrene ble holdt under en kontrollert temperatur i en kunstig belyst rom (12-timers lys /12-h mørk). Mat og vann var fritt tilgjengelig.
RNA forberedelse og kvantitativ revers transkripsjon PCR
Total RNA fra vev ble isolert i henhold til TRIzol metode (Invitrogen, Stockholm, Sverige). RNA-konsentrasjonene ble kvantifisert spektrofotometrisk ved 260 nm (DU 640 spektrofotometer, Beckman Coulter, Bromma, Sverige) og RNA integritet ble bekreftet ved 28 S 18 og S-rRNA integritet etter agarose-gel-elektroforese (data ikke vist).
Fem hundre ng total RNA ble reversert transkribert ved hjelp av tilfeldige heksamer (Applied Biosystems, Sundbyberg, Sverige) og Hevet II revers transkriptase (Invitrogen, Stockholm, Sverige) i et 10 mL reaksjon i henhold til produsentens instruksjoner. Alle cDNA-reaksjonene ble utført i duplikater.
Kvantifisering av ErbB2 mRNA ble utført ved sanntids-kvantitativ PCR ved anvendelse av ABI PRISM 7900HT Instrument (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Reaksjonene ble kjørt i en 20 mL volumet med TaqMan genekspresjon analyser Rn00566561_m1 (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Stockholm, Sverige) med TaqMan genuttrykk Mastermix henhold til produsentens protokoll. Hver prøve ble analysert for Rpl13a (Rn00821946_gl, Applied Biosystems) og β-aktin (Rn00667869_ml, Applied Biosystems) uttrykk å bruke som en normaliserende referanse kontroller. For å bekrefte spesifisiteten amplifikasjon av PCR produktene ble utsatt for et smeltekurve analyse. Kvantifiseringsmidlene Dataene ble analysert med SDS 2.4 programvare (Applied Biosystems) og de relative verdier av ErbB2 mRNA i prøvene blir beregnet fra en standardkurve oppnådd ved amplifisering av fem-ganger seriefortynning av reverstranskribert total RNA fra en referanseprøve. Et problem i denne typen studier er riktig rengjøring å bruke, siden deres nivåer kan variere i kreft forskningsstudier [17], [18]. Vi har valgt å presentere data normalisert til to gener: SS-aktin og rpl13a, for å gi en vurdering av robustheten dataene
statistikker
Den intra korrelasjonskoeffisient, binær. logistikk og Cox proporsjonal farer regresjonsanalyser ble utført ved bruk av SPSS programvare (IBM). Ordens regresjonsanalyser benyttet programvare som er utviklet innenfor R prosjektet for statistisk databehandling (versjon 2.15.2) [19]. Alle andre statistiske beregninger brukte statistikkpakke innebygd i GraphPad Prism 6 dataprogram for Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). For tilfeller fulgt av forventning, ble Receiver Operating Characteristic (ROC) kurver med en 15-års oppfølging grense brukes til å definere cut-offs for ErbB2-IR. For disse kurvene og for Kaplan-Meier overlevelseskurver, var en hendelse definert som dødsfall tilskrives prostatakreft og registrert i databasen som «event = 1». Pasienter med død av andre årsaker og tilfeller der pasientene var i live på tidspunktet for oppfølging ble sensurert og lagt inn i databasen som event = 0.
Resultater
ErbB2-IR i Pca microarray: sammenligning av svulsten og ikke-maligne score
i alt 357 (tumor) og 222 (ikke-maligne basal og luminal) saker ble scoret for ErbB2-IR. Eksempler på forskjellige ErbB2-IR-intensiteter fra fire tumor kjerner er vist i fig. 1A-D. Et eksempel på ikke-ondartet vev som viser en klar forskjell mellom basal og luminal ErbB2-IR er vist i fig. 1E. For både tumor og ikke-maligne prøver, epitelcellene viste ErbB2-IR mens stroma ikke. De kumulative skår for tumoren epiteliale og den ikke-maligne basal og luminale celler er vist i fig. 2A. For matchet prøvene, resultatet var signifikant forskjellige fra hverandre (P 0,0001 for parvise tester, Wilcoxon en matchende par signert rank test). På nivået av individuelle kjerner, antall tilfeller med basal score ≥-en, -0,99 til -0,01, 0, 0,01 til 0,99, 1 til 1,99 og ≥ 2 enheter høyere enn matchet luminal score var 1, 1, 5, 86, 286 og 103, henholdsvis
De tildelte score var. Resultat 1 for Panel A; Resultat 2 for Panel B; Resultat 2,25 (75% Intensitet skår 2, 25% intensitet scorer 3) for Panel C; Score 4 for Panel D. Gleason poengsummene for de tilfeller hvor kjernene ble avledet var 5 for Panelene A og C, og 10 for paneler B og D. Panel E viser eksempel på ErbB2 immunreaktivitet i en ikke-ondartet kjerne, hvor basal og luminal farging kan lett bli identifisert.
i Panel A kumulative frekvensene av ErbB2-IR score er vist for tumorprøver (n = 357), og for basal og luminal ikke-ondartede prøver (n = 222 i begge tilfeller). Medianverdiene (med interkvartilt område i parentes) var: tumor, 3,0 (02.25 til 03.05); luminal-ondartet, 2,25 (2,0 til 2,625); basal ikke-ondartet 3,875 (3,5-4,0). Medianverdiene var signifikant forskjellige fra hverandre (p 0,001, Dunn multiple sammenligningstest følgende vesentlige Kruskal-Wallis test). Panel B viser et spredningsplott av de individuelle score for svulst ErbB2-IR og Pakt-IR (hentet fra [14]).
Association of ErbB2-IR med sykdommens alvorlighetsgrad ved diagnose
foreningen av ErbB2-IR med klinisk (alder, Gleason score,% av kjernen som ble tumorassosiert) og biokjemiske (Ki67 indeks, stroma AR-IR og Pakt-IR) tiltak innenfor samme region er vist i tabell 1. Først -Bestill Spearmans rho-verdiene i tabell 1, ble beregnet som beskrevet i [20]. I tumorprøver, signifikante assosiasjoner med Gleason score,% av kjernen som ble tumorassosiert, Ki67 indeks og Pakt-IR ble funnet. Et spredningsplott som viser sammenhengen mellom tumor ErbB2-IR og pakt-IR Stillingen er vist i fig. 2B. I samsvar med den betydelige Spearmans rho verdi, fordelingen av tilfellene med Gleason score 4-5, 6, 7 og 8-10, respektivt, var forskjellig for de med en tumor ErbB2-IR stillingen ≤2.75 (40 [26%], 46 [30%], 26 [17%] og 41 [27%]) enn de med en poengsum 2,75 (21 [10%], 57 [28%], 40 [20%] og 86 [42%]) (P 0,0005, Chi kvadrat test; verdier er angitt i antall [% for ErbB2-IR gruppe] med Gleason score området ved diagnose de tilsvarende verdier for kreft klassetrinn 1a-1b, 2, 3 og 4, henholdsvis. var: tumor ErbB2-IR poengsum ≤2.75, 92 [61%], 30 [20%], 25 [17%] og 3 [2%]); tumor ErbB2-IR poengsum 2,75, 83 [41%], 61 [30%], 49 [24%] og 8 [4%] (P 0.005, χ
2 test).
i teorien kan et betydelig sammenslutning av to parametre skyldes det faktum at begge parametere er forbundet med en tredje parameter. Derfor, for eksempel, hvis tilfeller med en høy grad av celleproliferasjon, sett med Ki67 indeksen, oftere har høye Gleason score og høyere ErbB2-IR score enn tilfeller med lave priser av celleproliferasjon, deretter en sammenheng mellom ErbB2- IR og Gleason score ville bli overtalt. I samsvar med denne situasjonen, de første ordens korrelasjoner mellom ErbB2-IR og enten Gleason score eller% av kjerne som var tumorassosiert kontrollerende for svulsten Ki67-indeksen var ikke signifikant. Men sammenhengen mellom tumor ErbB2-IR og Pakt-IR forble signifikant (tabell 1). Således, i tumorvevet, blir ErbB2-IR score forbundet med den nedstrøms signalmolekyl pakt og med markøren celleproliferasjon Ki67, men ikke robust med kliniske mål på sykdomsalvorligheten. Ingen signifikant sammenheng mellom ErbB2-IR og enten Gleason score, jo% av kjernen som ble tumor assosierte eller ikke-ondartet Ki67 indeksen ble sett for enten basal eller luminal ErbB2-IR. Signifikant sammenheng mellom basal ErbB2-IR og både ikke-maligne Pakt-IR og stroma AR ble sett.
Forholdet mellom svulst ErbB2 og androgen signale
Ricciardelli et al. [21] rapporterte at høye nivåer av både tumor ErbB2-IR og AR-IR var mer vanlig i PCA pasienter med stadium 3 tumorer (n = 31) enn i fase 2 tumorer (n = 22, prøver tatt ved radikal prostatektomi). Her undersøkte vi sammenhengen mellom disse to variablene i vår vev microarray. I samsvar med den studie av [21], var det ingen korrelasjon mellom de to variablene
per se
i tumorvevet (tabell 1). Men i vårt materiale tilfeller med nivåer av både tumor ErbB2-IR og AR-IR over medianen var mindre vanlig hos pasienter med stadium 3 tumorer (n = 58) enn for scene 2 tumorer (n = 82) (tabell 2) . Som vil bli forventet fra korrelasjonsanalysene er vist i tabell 1, er en forvirrende sak at Ki-67-indeksen varierer mellom gruppene (tabell 2).
For å ta høyde for dette, vi foretok ordens regresjonsanalyser med tumor ErbB2-IR, AR-IR og Ki67-indeksen som de uavhengige variablene og svulsten scenen som den avhengige ordens variabel. Som en påminnelse, bør det påpekes at Ki67-indeksen korrelerer både med ErbB2-IR (tabell 1) og AR-IR (Spearmans rho -0,17, n = 340, P 0,005) og så de tre variablene er ikke helt uavhengige . Imidlertid korrelasjonene, selv om betydelige, er forholdsvis lav, slik at risikoen for Multikolineæritet er liten. Videre, ordet «ordens» i ordens regresjonsanalyse refererer til den avhengige variable, og verdiene av de uavhengige variablene er definert som kontinuerlig, snarere enn ordinal, noe som faktisk er tilfellet for resultatet (derav, for eksempel, bruken av Spearmans rho i stedet for Pearsons r i tabell 1). Men dette er helt rimelig i ordens regresjonsmodeller når variabelen i spørsmålet har et stort antall kategorier (det finnes 22 forskjellige tumor ErbB2 score fra 1 til 4 i databasen). I hoved effekt-modell, verdiene tilbake fra ordens regresjonsanalyse for en variabel representerer den totale effekten når de andre variablene er inkludert. I dette tilfelle, både Ki67-indeks (positiv) og AR-IR (negativ) var signifikant, mens ErbB2 ikke var (tabell 3). I samspillet sikt modellen, er verdien for den individuelle variable er for en konstant verdi av de andre variablene. I dette tilfellet er resultatene for de tre variabler var de samme i form av betydning, men en signifikant interaksjon ErbB2-IR x AR-IR (positiv) ble returnert. Med andre ord, når variabler holdes konstant, er det en påvirkning av kombinasjonen av ErbB2-IR x AR-IR, slik at jo høyere score, jo høyere er tumorstadium nummer. De logaritmisk og odds-ratio-verdiene for de fire nivåer av reaksjon (nivå 1 er referansenivået) ved forskjellige ErbB2-IR og AR-IR Stillingen er vist i tabell S1 for å illustrere dette punkt for de leserne godt kjent med denne statistisk metode.
data fra Ricciardelli et al. [21], og den foreliggende undersøkelse er i samsvar med, men ikke bevis for, en interaksjon mellom androgen signalering og ErbB2-ekspresjon. Slike bevis krever bruk av eksperimentelle modeller. Androgen fjernelse påvirker ErbB2-ekspresjon i tumorcellelinjer [8] og i xenograft-modeller [9]. Det er ikke kjent, men om denne reguleringen er begrenset til tumorceller eller er også sett i intakte prostatavev følgende store variasjoner i sirkulerende testosteronnivåer. For å bestemme hvorvidt tilsvarende regulerende effekter ble sett i normal prostata, ble ErbB2-ekspresjon på mRNA-nivå i dette vev målt ved qPCR følgende kastrering i rotter og deretter gjenopprettelse av sirkulerende androgen-nivåer av testosteron injeksjon. De observerte resultater (Fig. 3) er i samsvar med tumor studier sitert ovenfor
Data er normalisert til A. ß-aktin.; B, Rpl13a. Forkortelser: d pc, antall dager etter kastrering; T, testosteron. Vist er de enkelte verdier (n = 6 per gruppe); de faste linjene viser medianverdier. I begge tilfeller, Kruskal-Wallis tester indikerte en betydelig variasjon mellom gruppene (P 0,0001).
prognostisk verdi av tumor ErbB2-IR
I alt 255 tilfeller scoret for tumor ErbB2-IR ble etterfulgt av forventet etter diagnose, idet dette er standardbehandling på den tiden. I slike tilfeller kan den naturlige progresjon av sykdommen skal følges, og påvirkning av en biomarkør ved utfall kan undersøkes. Generelt blir en cut-off verdi av biomarkør velges, og resultatet blir sammenlignet mellom saker under og over cut-off bestemmes i overlevelsesanalyser, slik som Cox regresjonsanalyse og Kaplan-Meier plot. Cut-off-verdier kan være vilkårlig, slik som en enkel median splitt av data, eller er definert på grunnlag av en statistisk analyse. En slik tilnærming er bruk av Receiver Operating Characteristic (ROC) analyser, som tomt for alt mulig cut-off verdier sann positiv rate (følsomhet) vs. falsk positiv rate (1-spesifisitet). For en ROC-kurve med et areal under kurven [AUC] signifikant større enn 0,5 (ingen prognostisk verdi), den optimale cut-off verdi (den Youden indeks, som representerer den cut-off som gir den høyeste verdien for sensitivitet + spesifisitet – 1 ) kan beregnes (se [22] for beskrivelse). En ROC kurve med en 15-års grense indikerte en signifikant prognostisk verdi av tumor ErbB2-IR (Areal under kurven [AUC] 0,60, P 0,05), og var på divisjon ≤2.75 og 2,75. Til sammenligning var ROC arealet under kurven for tumoren Ki67-indeks var 0,75 (P 0,0001), og slik at en verdi av 0,60, om enn vesentlig, er ikke det imponerende. Den ikke-ondartet basal og luminal ErbB2-IR score manglet prognostisk verdi (AUC≤0.55, P≥0.4).
I teorien er det mulig at selv om AUC for svulst ErbB2-IR er beskjeden, det kunne bidra til en kombinasjon av markører med nyttig prognostisk verdi. For å undersøke denne mulighet, har to metoder blitt tatt i, ved hjelp av tumor ErbB2-IR sammen med tre andre tumormarkører (Ki67-indeks, epitelial AR-IR og pakt). Dataene er blitt normalisert slik at den maksimale poengsum i hvert tilfelle er 100%, og i tilfelle av AR, har resultatet vært uttrykt som 100-normalisert resultatet, siden en lav, snarere enn en høy, AR-IR tilknyttet en dårlig prognose [15]. Ulike kombinasjoner ble testet, men ingen ga en forbedring som sett med Ki67 alene (tabell S2). ROC kurver ga lik vekting av de ulike biomarkører, og så i teorien en optimal vekting kan ha vært savnet. Følgelig ble en binær logistisk regresjonsanalyse med det kliniske resultatet som avhengig variabel undersøkt ved anvendelse av de samme parametrene. Den beste kombinasjonen av parametere når det gjelder å gjette riktig død på grunn av Pca var ~~23% og inkludering av ErbB2 ikke forbedre dette tallet (tabell S3). Til sammenligning Gleason score hadde en forutsigelse rate på 55,6% (Nagelkerke R
2 verdi 0,419) på egen hånd og 45,6% (Nagelkerke R
2 verdi 0,401) i kombinasjon med AR-IR + Ki67-IR ( data ikke vist).
en univariate Cox regresjonsanalyse med sykdomsspesifikk overlevelse som endepunkt viste at den relative risikoen for tilfeller med en svulst ErbB2-IR score over den optimale cut-off, som definert ved Youden indeksen var omtrent dobbelt så høy som for de under cut-off-verdien (Exp (B) verdi er vist i tabell 4). Den univariate analysen tar ikke hensyn til eventuelle konfunderende variabler. Fra de tidligere resultatene som presenteres i denne artikkelen, er Ki67 en åpenbar feilkilden, og en bivariat Cox regresjonsanalyser viste at svulsten ErbB2-IR ikke gi ytterligere prognostisk informasjon til det som tilbys av enten svulsten Ki67 indeks (tabell 3). I form av klinisk nytteverdi, vil en markør være av interesse hvis det gitt informasjon utover det som tilbys av Gleason score. Analyser en bivariate Cox regresjon styring for Gleason score (tre grupper: 4-6, 7 og 8-10) indikerte at den prognostiske verdi av tumor ErbB2-IR ikke lenger forble signifikant (tabell 4). I samsvar med dette, Kaplan-Meier plott for alle tilfeller etterfulgt av forventet viste en signifikant prognostisk effekt av svulsten ErbB2-IR (fig 4A), og for tilfeller med Gleason score 4-6 (Fig. 4B). Men en betydelig prognostisk effekt ble ikke sett for tilfeller med Gleason score seks alene (fig 4C), Gleason score 7 alene (figur 4D, riktignok på grensen til betydning) eller for tilfeller med Gleason score 8-10 (fig. 4E).
antall tilfeller der dødsfallet skyldes prostatakreft er angitt som
† Pca i figuren. Lukene på linjene viser sensurerte data (dvs. andre enn døden tilfeller på grunn av prostatakreft). Utvalget av Gleason score (GS) for pasientene er vist i hvert panel.
Diskusjoner
I denne studien har vi undersøkt assosiasjonen av ErbB2-IR med sykdommens alvorlighetsgrad ved diagnose og med sykdom utfall i en godt karakterisert vev microarray [12]. Det er en stor mengde arbeid vedrørende den prognostiske verdien av ErbB2 i Pca (evaluering, se [11]), men denne studien gir ny informasjon på to viktige punkter: For det første, er data innhentet i tilfeller som ikke hadde fått noen kreft behandling før prøvene ble tatt, siden de ble diagnostisert først etter transuretral reseksjon for nedre urinveissymptomer. I tillegg, siden den standard behandling på den tiden var forventet, den lange følge opp den brukte tillater undersøkelse av det naturlige forløp av sykdommen. Dette er svært verdifull for å vurdere biomarkører. Dernest har tilgjengeligheten av data ved AR i de samme prøvene tillot en undersøkelse av relasjonene mellom ErbB2 og AR uttrykk i svulstene. Generelt våre funn er i god overensstemmelse med litteraturen. Med hensyn til forskjeller i vev ekspresjon av ErbB2, Lyne et al. [23] rapporterte at andelen av prøver med moderat til sterk ErbB2 immunreaktivitet var 100 for benign prostatahyperplasi basale celler, 11 for godartet prostata luminal celler, 0 for godartet prostata stroma, 87 for prostata- intraepitelial neoplasi og 82 for prostatakreft. I denne studien har vi ikke observere ErbB2-IR i stroma, og tallet (med% i parentes) av tilfellene med ErbB2-IR score ≥3 var 196/222 (88%), 39/222 (18%) og 201/357 (56%) av ikke-maligne basal, luminal og tumorprøver, henholdsvis.
i tumorprøver, ErbB2-IR var signifikant assosiert med både celle-proliferasjon Ki67 og immunoreaktiviteten av pakt den fosforylerte form av overlevelsesfaktor Akt. Foreningen med Ki67 er konsistent med en stor studie ved hjelp av prøver tatt ved radikal prostectomy, hvor gjennomsnittlig Ki67 merking indeksen var høyere for de 388 ErbB2-positive tumorprøver enn for 1940 ErbB2-negative prøver (henholdsvis 6,1 kontra 4,3,, [21].
