Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er funnet med unormal uttrykk eller mutasjon i Ras-proteiner. Onkogen Ras-aktivering utnytter deres omfattende signale rekkevidden for å påvirke flere cellulære prosesser, hvori mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signale utøver en viktig rolle i tumorgenese. Terapi målrettede Ras er derfor av stor nytte for kreft i bukspyttkjertelen. Selv små molekyl APY606 har blitt plukket ut av virtuell narkotika screening basert på Ras mål reseptor, forblir sin inngående mekanisme for å bli belyst. Vi vurderte heri antitumoraktivitet av APY606 mot humane kreft i bukspyttkjertelen CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer og undersøkt effekten av Ras-MAPK og apoptose-relaterte signalveien på aktiviteten av APY606. APY606 behandling resulterte i en dose- og tidsavhengig inhibering av kreftcellelevedyktighet. I tillegg APY606 oppviste sterk antitumoraktivitet, som dokumentert ikke bare ved reduksjon i tumorcelle invasjon, migrering og mitokondriemembranpotensialet, men også ved forandring i flere apoptotiske indekser. Videre APY606 behandling direkte inhiberes Ras-GTP og nedstrøms aktiveringen av MAPK, noe som resulterte i nedregulering av anti-apoptotiske protein Bcl-2, fører til oppregulering av mitokondriell apoptose sti-relaterte proteiner (Bax, cytosoliske cytokrom
c
og Caspase 3) og av cyklin-avhengig kinase 2 og syklin A, E. Disse data tyder på at svekke Ras-MAPK-signalering er en ny virkningsmekanisme for APY606 i løpet av terapeutisk intervensjon i bukspyttkjertelkreft.
Citation: Guo N, Liu Z, Zhao W, Wang E, Wang J (2016) Små Molecule APY606 Viser Omfattende antitumoraktivitet i bukspyttkjertelkreft via svekke Ras-MAPK signalnettverk. PLoS ONE 11 (5): e0155874. doi: 10,1371 /journal.pone.0155874
Redaktør: Hiroyasu Nakano, Toho University School of Medicine, JAPAN
mottatt: 29 mars 2016; Godkjent: 05.05.2016; Publisert: 25. mai 2016
Copyright: © 2016 Guo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
finansiering:. forfatterne ønsker å erkjenne følgende finansieringskilder som støttet denne forskningen: National Natural Science Foundation of China (81573448, 11174105, 91227114 og 91430217), National Science Foundation (MCB- 0947767) og Science Foundation i Jilin-provinsen Natural (20150101009JC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en dødelig sykdom på grunn av bukspyttkjertel ductal adenokarsinom rangeres som nummer fire blant kreftrelaterte dødsfall [1]. Arten av denne svulsten er preget av et dårlig resultat for alle stadier av sykdommen, og bare 1-4% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er fortsatt i live etter 5 år fra diagnose [2]. Ulike behandlingsregimer mislyktes i å forbedre overlevelse av pasienter [3,4]. Svikt i kjemoterapi ved kreft i bukspyttkjertelen er hovedsakelig på grunn av multimedikamentresistens og dosebegrensende bivirkninger. Til dags dato er det fortsatt uklart hvordan intracellulære signalveier føre til avvikende biologiske egenskaper i bukspyttkjertelkreft. Videre er det fortsatt lite kjent om hvordan farmakologiske hemninger av spesifikke signalveier forbedre responsen av kreft i bukspyttkjertelen celler til konvensjonell kjemoterapi [5]. Derfor bør det videre arbeidet mot utvikling av ny terapi for å bedre overlevelse og livskvalitet for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen inkluderer ny strategi for å utforske effektive kreft narkotika [6].
Ras-proteiner er viktige reguleringskomponenter som involverer i normal cellevekst, differensiering og ondartet transformasjon [7]. Det ble anslått at nesten 90% av pankreas kreft har blitt funnet med unormal ekspresjon eller mutasjon i Ras-proteiner [8]. Onkogen Ras aktivering utnytter deres omfattende signale rekkevidde å påvirke flere cellulære prosesser, inkludert undertrykkelse av apoptose og fremme spredning [9]. Programmert celledød eller apoptose, er en normal fysiologisk prosess som enkelt celle dør og blir fjernet fra en gitt populasjon. Apoptotisk celledød initiert egentlig gjennom mitokondrie-mediert sti fungerer som en viktig forsvarsmekanisme mot kreft, og korrupsjon av apoptotiske maskineriet er et avgjørende underskrift av kreftceller [10]. Onkogene Ras-drevet erosjon av apoptotiske sti og dens bidrag til kreft har blitt godt dokumentert [11]. Blant de nedstrøms signal kaskader av Ras, har mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) kaskade blitt rapportert å spille en viktig rolle i utviklingen av kreft [12-14]. En av nøkkelroller, Ras-reaksjonsveien MAPK i en rekke forskjellige pattedyrceller, er regulering av cellesyklusen overgang [15]. De proliferative signaler som genereres av onkogene Ras kulminerer med oppregulering av flere transkripsjonsfaktorer som utløser ekspresjon av cykliner som attributt til aktivering av Ras-MAPK-reaksjonsveien. Onkogen Ras kan fremme cellesyklusutvikling ved inhibering av cyclin-avhengige kinaser (CDK). Den undertrykkende virkning er mediert av flere Ras-effektor-reaksjonsveier, inkludert den Ras-MAPK-reaksjonsveien [16,17]. Med vår forståelse, vil bidraget av onkogene Ras til disse prosessene utvilsomt være en spennende avenue for kreftforskning i kommende fremtid.
Det er vel kjent at små molekyler har viktige roller i kreft kjemoterapi. Et lite molekyl hemmer, APY606, ble plukket ut av virtuell narkotika screening basert på Ras målrette reseptor i vår siste arbeid [18]. Imidlertid er dens underliggende mekanisme for anti-kreft egenskaper dårlig forstått. Her ble de grundige undersøkelser utført for å vurdere sin kreft-bekjempelse natur mot bukspyttkjertelkreft CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer. Disse resultater viser at APY606-indusert apoptose er knyttet til aktivering av den indre mitokondrie apoptotiske reaksjonsvei og forebygging av Ras-MAPK-reaksjonsveien kaskade. Parallelt ble APY606 videre funnet å indusere S-fasen arrest og tregere metastaser i de to cellelinjene ved å svekke Ras aktivering. Følgelig vil vår forskning legger grunnlaget for målrettet Ras medisiner og for APY606 terapeutisk anvendelse i bukspyttkjertelkreft.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), L-15 cellekulturmedium og føtalt bovint serum (FBS) ble oppnådd fra Gibco (Grand Island, NY). Alle andre reagenser ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). APY606 ble vennligst gi av NCI /DTP Åpne Kjemisk Repository (https://dtp.cancer.gov) og deretter bekreftet ved HPLC og ESI-MS. Primære antistoffer mot humant caspase-3, caspase-9, cytokrom
c
, BCL-2, Bax, c-Raf, ERK, Perk, MEK, pMEK, cyclin A, cyclin E og CDK2 ble kjøpt fra Santa Cruz og BD Bioscience, henholdsvis. Antistoffer mot human GAPDH og β-aktin ble oppnådd fra Santa Cruz.
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelige pankreatisk kreft CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer ble erholdt fra Cell Bank of Type Culture Collection Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og dyrket i DMEM og L-15 medium som inneholder 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin, henholdsvis. Cellene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 inkubator. I prosessen med cellekultur, det var ikke noen virkning av mykoplasma på de to cellelinjer, noe som ble bekreftet av en fluorokrom DNA-farging test. APY606 ble oppløst i DMSO (dimetylsulfoksyd), og friskt fortynnet til den ønskede konsentrasjon med dobbelt destillert vann umiddelbart før bruk. Sluttkonsentrasjonen av DMSO i kulturmediet er 0,1% (v /v). Kontrollcellene mottok bæreren bestående av dobbelt-destillert vann inneholdende 0,1% DMSO bare, som ikke i betydelig grad påvirker cellene.
veksthemmende analyse
Celletelling leder-8 (CCK-8 ) (Dojindo, Japan) analyse ble utført for å undersøke effekten av APY606 på cytotoksisitet. Kort sagt ble CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i et volum på 100 ul. Etter inkubering over natten, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av APY606 for henholdsvis 24 timer og 48 timer,. Cellene ble deretter eksponert for 10 ul CCK-8-reagens i 3 timer; den optiske tettheten ved 450 nm ble avlest med en M200 PRO NanoQuant autoleser (TECAN, Sveits). I denne analysen har CCK-8 forstyrrer ikke APY606 og forårsake en positiv respons. Målingene ble utført minst fem ganger.
Colony forming analyse
For å teste overlevelse av celler behandlet med APY606, CAPAN-en og SW1990 cellelinjer ble sådd inn i 24-brønners plater ( 200-300 celler per brønn) og lov til å følge i 24 timer. Cellene ble inkubert i kulturmedium innehold APY606 med konsentrasjoner på 2, 4, 6, 8 og 10 ug /ml i 6 dager. Deretter ble cellene fiksert med metanol og farget med 5% Giemsa og kolonier (mer enn 50 celler) ble tellet under et invertert mikroskop (AMG EVOS, Life).
Nuclear fargingsanalyse
APY606-indusert kjerne kondensasjon og morfologisk forandring ble påvist ved anvendelse av DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol). CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer (5 x 10
6 celler per plate) ble dyrket på glassbunn plater til 50% konfluens og deretter dyrket i mediet i nærvær av 6,25, 12,5 og 25,0 pg /ml APY606 for henholdsvis 24 timer,. Cellene ble fiksert med 3,5% paraformaldehyd og deretter inkubert i en væske inneholdende 2 mg /ml DAPI i 20 min. Atom morfologi av celler ble observert av fluorescens mikroskopi (AMG EVOS, Life).
Kvantifisering av celle apoptose
Tidlig i apoptose, er fosfatidylserin (PTS) translocated til den ytre cellemembranen og kan bli identifisert ved binding av Annexin V, en ligand for PTS. Apoptotisk CAPAN-1 og SW1990 celler ble kvantifisert ved hjelp av Annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) apoptose deteksjon kit (Abcam, UK) etter at cellene ble behandlet med APY606 ved forskjellige konsentrasjoner (6,25 og 12,5 ug /ml) i 24 timer. I korthet ble cellene trypsinert og vasket to ganger med kald PBS, og deretter ble cellene resuspendert i en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml i bindingsbuffer (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl
2). Deretter ble cellene inkubert med 5 ul annexin V-FITC og 5 ul PI i mørke i 15 minutter ved romtemperatur og utsatt for flowcytometrisk analyse (FACSAria, BD Biosciences). I alt ble 10.000 hendelser analyseres i hver prøve. Dataanalyse ble utført med Diva 6.0-programvare (BD Biosciences).
Måling av mitokondriell membranpotensiale
Forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial (ΔΨm) er et karakteristisk signatur av apoptose i en mitokondrie-relaterte veien . ΔΨm kan måles ved hjelp av fluorescerende probe JC-1. Kort sagt ble CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer sådd ut i 6-brønns plater (5 x 10
5 celler per brønn) og behandlet med APY606 i en konsentrasjon på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer. Cellene ble vasket med PBS og inkubert i 500 ul JC-1 arbeidsoppløsningen ved 37 ° C i 5% CO
2 i 20 min. Deretter ble cellene resuspendert i 500 ul inkuberingsbuffer, etterfulgt av visualisering ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskop (CLSM, Leica TCS Sp2). JC-1 ble opphisset av 488 nm laserlys og utslipp ble tatt ved 530 nm [19]. Nedgangen på rød /grønn fluorescens intensitet ratio indikerer tap av ΔΨm i kreftceller.
Fastsettelse av Ras-GTP
CAPAN-en og SW1990 cellelinjer ble dyrket i fullstendig medium for natten, sultet i 8 timer i medium inneholdende 1% FBS og deretter behandlet i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av APY606. Ved slutten av behandlingen, ble celler stimulert med EGF (10 ng) i 10 minutter. Deretter ble cellene lysert, og cellelysatet ble behandlet ved en Ras-aktivering analysesett (Upstate, Millipore). Den totale Ras og de aktive Ras-proteiner ble påvist ved anvendelse av Western blotting-analyse som beskrevet nedenfor.
Strømningscytometrisk kvantifisering av ekstra fordel
ekspresjon mengden av fosforylert ekstracellulære signalregulerte kinase (ekstra fordel) var en avlesning av Ras-MAPK veien kaskade. For å måle inhibering grad ERK-aktivering eksperimentelt, flowcytometrisk analyse ble benyttet for å oppnå kvantitativ encellet måling av mengden av Perk. I korthet CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer ble behandlet med APY606 i en konsentrasjon på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer, deretter fiksert og permeabilisert ved hjelp Cytofix /Cytoperm kit (Becton Dickinson, Mountain View). Etter sentrifugering ble 0,05 ug antistoff per brønn i 100 pl antistoffblanding for en Alexa Fluor 488 konjugert ERK1 /2-antistoff (anti-fosfo-P44 /42 MAP-kinase, Thr202 /Tyr204, BD Bioscience) tilsatt og inkubert i 1 time på is . Etter vasking, ble prøvene analysert ved bruk av fluorescens aktivert celle sorter FACSAria (BD Biovitenskap) og andelen av fargede celler i hver kvadrant ble kvantifisert ved hjelp av Diva 6.0-programvare (BD Biovitenskap). I alt ble 10.000 hendelser analyseres i hver prøve. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
Cell syklus analyse
For å teste potent mekanisme for APY606-indusert hemming av cellevekst, ble effekten av APY606 behandling på cellesyklus distribusjon utforsket av flyt cytometri. Kort sagt ble CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer kimsatt (1 x 10
6-celler per brønn i 6-brønn plate) og behandlet med APY606 i en konsentrasjon på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer, henholdsvis. Cellene ble suspendert, fiksert i 70% (v /v) etanol ved 4 ° C over natten. Deretter ble cellene vasket og resuspendert i 1 ml PBS inneholdende 50 ug /ml PI og 1 mg /ml RNaseA ved romtemperatur i mørket i 30 minutter. I alt ble 10.000 hendelser analyseres umiddelbart i hver prøve ved flowcytometeret (FACSCalibur, BD Biosciences). Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
Sårtilheling analysen
For å utforske innflytelsen av APY606 på motilitet evnen til kreftceller, sårheling Analysen ble utført for å evaluere cellemotilitet av APY606 behandlede celler. CAPAN-en og SW1990 cellelinjer ble sådd ut på 24-brønners kulturskåler og deretter scoret ved hjelp av en mikropipette tips. Mediet ble erstattet med 12,5 mikrogram /ml APY606 i det komplette medium, og cellemigrering ble overvåket ved hjelp av CLSM i 24 timer. Bilder ble tatt til fange, og sårheling avstand (sammenlignet med kontrollen ved 0 h) ble målt i tre uavhengige såret sider per gruppe. Relativ cellemotilitet sammenlignes som såret bredde forskjellen mellom ved 0 timer og ved 24 h.
Trans-brønn kammer analysen
For ytterligere å undersøke effekten av APY606 på invasjonen evnen til kreftceller , Matrigel trans-brønn kammer analysen ble utført. CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer ble sådd ut på 6-brønners plater i en tetthet på 2 x 10
5-celler /brønn og dyrket i 24 timer. Etter at cellene ble sultet i 24 timer ble cellene behandlet med 12,5 mikrogram /ml APY606. Deretter ble cellene samlet og 1 x 10
5 celler fortynnet med serumfritt medium ble sådd til trans-brønns enheter med polykarbonatfiltre (Cambridge, MA) som inneholder 8-mikrometer porer. Den polykarbonat membran ble pre-belagt med 250 mikrogram /ml Matrigel (BD Biosciences). De nederste kamre ble fylt med 600 mL medium som inneholder 5% FBS. Etter 24 timer ble cellene fiksert i metanol og farget med akridinoransje (AO, Dingguo, Kina). Den øverste overflaten av membranen ble forsiktig skrubbet med en bomullspinne, og cellene invaderer gjennom filtre membranen ble regnet med glassbunn kultur plater, og bilder, som gjelder hele membranoverflaten ble tatt til fange av CLSM.
Western blotting analyse
for å klargjøre de underliggende mekanismene for APY606-indusert celle apoptose og cellesyklus arrest på molekylært nivå, ble Western blotting analyser undersøkt. CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer ble vasket med kald PBS etter 24 timers behandling med APY606 i en konsentrasjon på 6,25 og 12,5 ug /ml. Etter cellulære proteiner ble ekstrahert og kvantifisert, er lik mengden av protein elektroforese på 10% SDS-PAGE-gel og deretter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). Deretter ble PVDF-membranen probet med den angitte primære antistoff over natten ved 4 ° C og ytterligere blottet med passende pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Visualisering ble utført ved hjelp chemiluminescence detektor (DNR, Kiryat Anavim, Israel). Proteinnivået ble normalisert ved hjelp av GAPDH eller β-aktin som en intern kontroll.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD av triplikat eksperimenter. Statistisk analyse ble utført med SPSS 11.5 statistisk programvare.
Resultater
1. APY606 hemmer spredning av CAPAN-en og SW1990 cellelinjer
For å undersøke mulighetene veksthemming av APY606 i de to kreftcellelinjer, konsentrasjonsavhengig hemmende effekter av APY606 på veksten av CAPAN-en og SW1990 celle linjer ble evaluert som vist i figur 1A. Når CAPAN-1-cellene ble behandlet med APY606 ved konsentrasjon på 12,5, 25,0 og 50,0 pg /ml i 24 timer, den prosentvise vekst-inhibering i løpet av kontrollcellene (100%) var nesten 21,0 ± 2,6%, 81,3 ± 0,5% og 93,3 ± 0,6%, henholdsvis. Følgelig er prosentandelen av inhiberte SW1990 celler i løpet av kontrollcellene (100%) var 52,3 ± 1,5%, 82,3 ± 0,6% og 90,0 ± 1,0%, henholdsvis. Når CAPAN-1-cellene ble behandlet med APY606 ved de samme betingelsene i 48 timer, den prosentvise vekstinhibering av de kontrollcellene (100%) var omtrent 50,0 ± 1,7%, 90,0% og 93,0%, respektivt. I mellomtiden, prosentandelen av inhiberte SW1990 celler i løpet av kontrollcellene (100%) var 71,7 ± 3,2%, 75,3 ± 1,5% og 87,3 ± 2,3%, henholdsvis. IC
50 verdi for APY606 var 14,3 ± 1,3 mg /ml (24 timer) og 9,5 ± 0,6 mg /ml (48 timer) i CAPAN-1-celler, så vel som 10,3 ± 1,1 pg /ml (24 timer) og 6,8 ± 2,3 mg /ml (48 timer) i SW1990 celler, respektivt. I tillegg har vi også studert effekten av APY606 på overlevelsen av CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer etter kolonidannende analyse. APY606 behandling resulterte i en signifikant inhibering av kolonidannelse i de to cellelinjene på en doseavhengig måte (figur 1B). Kollektivt, våre resultater indikerte at APY606 induserte konsentrasjonsavhengige inhiberende virkninger på vekst og overlevelse av både CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer.
Cellene ble behandlet med den angitte konsentrasjon av APY606 for 24 og 48 timer, og deretter vurderes av CCK-8 (A) og kolonidannende analysen (B), respektivt. Presenterte data er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Nuclear fargebilder (C) ble tatt av fluorescerende mikroskop med 10 × objektiv. Målestokken var 20 um.
Videre ble den kjernefysiske morfologien av celler påvises ved DAPI som er en blå fluorescens fargestoff spesielt binding A-T-rike regioner i DNA. DAPI kan passere gjennom en intakt cellemembran derfor den kan brukes til å farge både levende og fikserte celler, skjønt det passerer gjennom membranen mindre effektivt i levende celler, og derfor effektiviteten av flekken er lavere. Den blå fluorescens intensitet i CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer behandlet med APY606 i en konsentrasjon på 6,25, 12,5 og 25,0 ug /ml i 24 timer var sterkere enn den i kontrollgrupper som ble behandlet med vehikkel som vist i fig 1C. Videre er det klart at de kondenserte og fragmenterte kjerner øket med APY606 behandling på en konsentrasjonsavhengig måte.
2. APY606 induserer apoptose av CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer
For å evaluere apoptose-induserende effekten av APY606 på CAPAN-en og SW1990 cellelinjer, ble antall apoptotiske celler kvantifisert ved hjelp av flowcytometrisk analyse. Celler farget positivt for annexin V-FITC og negative for PI gjennomgår apoptose; celler farget positivt for både annexin V-FITC og PI er enten i sluttfasen av apoptose gjennomgår nekrose eller allerede død; celler farget negativt for både annexin V-FITC og PI er i live uten gjennomgår apoptose [20]. Som vist i figur 2A, antallet apoptotiske celler var neglisjerbar (0,4-1,0%) i kontrollcellene til de to cellelinjene som ble behandlet med bærer. Mens andelen av tidlige apoptotiske celler ble øket til 21,3 ± 3,5% og 50,4 ± 5,5% etter CAPAN-1-cellene ble behandlet med APY606 på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer, henholdsvis. I 48 timer behandling, ble verdiene økt til 22,0 ± 2,3% og 54,4 ± 6,2%, henholdsvis. På tilsvarende måte, ved de samme betingelser, var verdiene 23,4 ± 2,4% og 63,9 ± 7,2%, så vel som 49,9 ± 3,5% og 75,1 ± 6,3% etter SW1990 celler ble eksponert for APY606 i 24 timer og 48 timer, henholdsvis. Resultatene viste klart at APY606 induserte en tids- og konsentrasjonsavhengig apoptose i CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer.
Prosentvise apoptotiske cellepopulasjoner i de to cellelinjene som ble behandlet med 6,25 og 12,5 ug /ml av APY606 i 24 og 48 timer ble bestemt ved hjelp av strømningscytometer (A). Presenterte data er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Effekt av behandling på APY606 proteinene relatert til apoptotisk reaksjonsvei ble målt ved anvendelse av Western blotting-analyse. Representative blot av respektive proteiner ble vist (B). GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (C). Relativ tetthet av målet protein ble kvantifisert og plottet
For å undersøke mekanismen ansvarlig for APY606-indusert apoptose, vi evaluert nivåene av Bax, BCL-2, cytosolic cytokrom
c
, og aktivering av kaspase-3 og kaspase-9 i CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer behandlet med APY606 i en konsentrasjon på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 t ved hjelp av Western blotting-analyse. Effektene av APY606 behandling på de ekspresjonsnivåene av de pro-apoptotiske protein Bax og anti-apoptotiske protein Bcl-2 ble eksperimentelt undersøkt. Behandling av celler signifikant økt ekspresjon nivå av Bax men reduserte det av Bcl-2 i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2B). Cytokrom
c
er en av de sentrale mediatorer av mitokondrie eller iboende apoptotiske sti. Utgivelsen av cytokrom
c
fra mitokondrie intermembrane plass er tidlig hendelse i løpet apoptotisk celledød [21]. Som sådan, effekten av APY606 behandling for frigjøring av cytokrom
c
i de to cellelinjer ble evaluert. Eksponering av celler til APY606 ble observert å øke frigivelsen av cytokrom
c
fra mitokondrier inn i cytosol på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2C). Ved apoptotisk stimulering, cytokrom
c
utgitt forbinder med procaspase-9 for å danne et kompleks behandling caspase-9 fra inaktive proenzym til sin aktive form, eventuelt utløser caspase-3-aktivering og apoptose [21]. Som vist i figur 2B og 2C, APY606 indusert bemerkelsesverdig konsentrasjonsavhengig aktivering av kaspase-3 og kaspase-9 og til slutt førte til apoptotisk død i CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer.
3. APY606 induserer ΔΨm
uttømming av ΔΨm er en tidlig og hovedsak apoptotisk respons på anti-kreft terapi. Mitokondriell avbrudd initierer prosessen med apoptose, som senere fører til veksthemming. For ytterligere å undersøke mekanismen for APY606-indusert celle apoptose, bestemt vi effekten av APY606 på ΔΨm i CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer. Det kationiske fargestoff JC-1 er nyttig for å oppdage ΔΨm som forekommer på et tidlig stadium av apoptose [22]. I levende celler, JC-1 utstillinger potensial avhengig akkumulering i mitokondria fører til konsentrasjonsavhengig dannelse av rød fluorescens-J-aggregater [23] som er en indikasjon på tilstedeværelsen av polariserte mitokondrier. På depolarisering, JC-1 monomeren binding med mitokondrie membran resultater i grønn fluorescens og en reduksjon i orange-rød farging. Således er mitokondriell depolarisering indikert ved en reduksjon i den rød /grønn fluorescens intensitet forhold. Forholdet mellom rød til grønn fluorescens er avhengig bare av transmembranpotensialet, og ikke på andre faktorer som mitokondrie størrelse, form og tetthet som kan påvirke en-komponent fluorescenssignaler.
Her styre og APY606 behandlede CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer farget med JC-1 ble overvåket ved CLSM. Som vist i figur 3, ble dannelsen av røde fluorescerende J-aggregater betydelig redusert i de to cellelinjene som ble behandlet med 6,25 og 12,5 mg /ml APY606 sammenlignet med kontrollceller. I motsetning til dette ble den grønn fluorescens spesielt bemerket i APY606-behandlede celler på grunn JC-1-monomer-binding. Forholdet mellom grønn til rød fluorescens ble øket i APY606-behandlede celler på en konsentrasjonsavhengig måte, noe som tyder på at fluorescensen endringen var indikativ for ΔΨm. Tap av ΔΨm ble observert etter APY606 behandling, noe som tyder på at mitokondriene påvirkes særlig tidlig i apoptotiske prosessen.
kontroll og APY606-behandlede celler farget med JC-1 ble overvåket av CLSM. J-aggregert form (rød fluorescens) og J-monomer alene (grønn fluorescens) var spente på 568 og 480 nm, henholdsvis. Målestokken var 20 mikrometer.
4. APY606 inhiberer Ras-MAPK-reaksjonsveien indusere apoptotisk respons
Sikte for å vurdere mulig målrettet Ras terapeutisk strategi, vi først undersøkt ved inhibering av Ras-GTP-aktivitet i cellebasert assay. I teorien vil APY606 virke til å redusere den Ras-GTP aktivitetsnivå. For å veie opp for denne spådommen ble effekten av APY606 på kreft i bukspyttkjertelen celler evaluert ved hjelp av Raf1RBD pull-down analysen. Som forutsagt, er omfang av Ras-aktivering i serum-sultet CAPAN-1 og SW1990 ble betydelig redusert i nærvær av APY606 på en doseavhengig måte uten en betydelig reduksjon i total Ras nivå (figur 4).
serum-sultet cellene behandlet med bærer eller indikerte konsentrasjoner av APY606 i 24 timer og deretter stimulert med EGF i 10 min. APY606 demper cellulær Ras-aktivering i CAPAN-1 (A) og SW1990 (b) cellelinjer. GTP-bundet Ras ble isolert ved RBD pull-down analysen og oppdaget av Ras-GTP aktivering kit. Total mengde av Ras ble påvist ved hjelp av anti-Ras-spesifikt antistoff. Relativ tetthet av målet protein ble kvantifisert og plottet.
Raf kinaser er best kjent som viktige regulatorer av Ras-MAPK kaskade, og blokken av Ras-MAPK signalveien har en viktig rolle i induksjon av kreftcelle apoptose [24]. For å sjekke den underliggende mekanismen av apoptose induksjon, vurderte vi effekten av APY606 på Ras-MAPK veien i begge CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer. Behandling av de to cellelinjer med APY606 på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer signifikant redusert fosforyleringen av MEK og ERK sammenlignet med kontrollceller (figur 5A og 5B). Men eksponering av de to cellelinjene til APY606 ikke påvirke den totale nivåer av MEK og ERK. Spesielt, ekspresjonsnivået av c-Raf ble signifikant redusert med økende konsentrasjon av APY606 når sammenlignet med kontrollceller. Dette resultat viste at APY606 indusert apoptose ved å blokkere Ras-MAPK-signalreaksjonsveien.
Cellulære lysater ble analysert i immunblotting med respektive primært antistoff, etterfulgt av det andre antistoff, og de representative Blottene ble målt. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Relativ densitet av målproteinet ble kvantifisert og plottet. Strømningscytometrisk deteksjon av fosfo-ERK ble utført i begge CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer (C). Presenterte data er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Generelt, ble graden av ekstra fordel betraktes som en indikator på Ras-aktivering [25]. Basert på dette, vi samtidig utført en flowcytometrisk analyse for å oppnå kvantitativ encellede måling. Som vist i figur 5C, APY606 som skyldes produksjon av mindre ekstra fordel i CAPAN-en (76,7 ± 1,2%) og SW1990 (46,3 ± 2,6%) cellelinjer ved 12,5 pg /ml dose enn gjorde i vehikkelbehandlede kontrollcellene, henholdsvis i avtalen med tendensen av Western blotting-analyse.
5. APY606 arrestasjoner cellesyklus i S-fasen
Mange cytostatika arrestere cellesyklus i G1, S eller G2-M fasen [26]. For å vurdere mekanisme for APY606-indusert hemming av cellevekst, ble effekten av APY606 på cellesyklusfordelingen først undersøkt kvantitativt i CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer ved bruk av strømningscytometrisk analyse. Behandling av de to cellelinjer med APY606 på 6,25 og 12,5 ug /ml i 24 timer markert gjorde påvirker antallet celler i G1 og S-faser ved en konsentrasjonsavhengig måte, men antall celler i G2-fasen ble ikke signally endret i forhold til kontrollcellene (figur 6A). Etter behandling av CAPAN-1-celler med APY606 på 12,5 ug /ml, antall celler arrestert i G1 fase var 62,83% sammenlignet med kontrollceller; Dette resulterte i en nedgang på 18,78% (p = 0,027). Samtidig er andelen av celler arrestert i S-fasen var 35,59%; Dette ga en økning på 18,09% (p = 0,043) sammenlignet med kontrollceller som ble behandlet med bærer bare. For fordeling av SW1990 celler i G1 og S-faser, eksponering av celler til APY606 ga opphav til en mer bemerkelsesverdig effekt. Behandling av celler med SW1990 APY606 på 12,5 ug /ml reduserte signifikant antall celler arrestert i G1 fase med 32,84% (p = 0,002) og økt antall celler i S-fasen av 33,57% (p = 0,042), respektivt. Disse data indikerte at APY606 resulterte i vekstinhibering som fremkalte en fremstående, forlenget akkumulering av celler i S-fasen, og en reduksjon av celler i G1 fase i begge CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer.
CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av APY606 i 24 timer. Representative prosenter av cellepopulasjoner i G1, S og G2-fasene av cellesyklusen i de to cellelinjer ble analysert ved flow-cytometri (A). G1-S overgangsrelaterte proteiner ble analysert ved hjelp av Western blotting-analyse (B). Tilsvarende forsøk ble gjentatt minst tre ganger med lignende resultater, og de representative Blottene ble presentert. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. Relativ densitet av målproteinet ble kvantifisert og plottet (C).
cellesyklusprogresjon er strengt regulert av cykliner og CDK’er. De reduserte uttrykk for cyclin A, cyclin E og CDK2 er kjennemerkene til cellesyklus arrest i S-fasen. For å kvalitativt undersøke mekanismen for APY606-indusert cellesyklus arrest, diskuterte vi effekten av APY606 behandling på uttrykket nivåer av cyclin A, cyclin E og CDK2 i CAPAN-1 og SW1990 cellelinjer ved hjelp av Western blotting-analyse.
