Abstract
Radioresistance er en viktig hindring for effektiv strålebehandling for ikke-småcellet lungekreft ( NSCLC). Til tross for flere eksperimentelle og kliniske studier av motstand mot stråling, fortsatt den nøyaktige mekanismen for radioresistance hos NSCLC celler og vev uklart. Dette resultat kan forklares ved begrensningen av tidligere forskere som en delvis forståelse av den cellulære radioresistance mekanismen ved et enkelt molekyl nivå. I denne studien ønsket vi å undersøke omfattende stråling responser i radioresistant NSCLC celler og for å identifisere radioresistance-assosiere faktorer. For første gang, ved hjelp av RNA-seq, en massiv sekvensebasert tilnærming, undersøkte vi hel-transkriptomet endring i radioresistant NSCLC-A549-celler ved bestråling, og verifisert betydelige strålings forandret gener og deres kromosom fordelingsmønster. Dessuten ble bioinformatiske metoder (GO analyse og IPA) utført for å karakterisere strålings responser i radioresistant A549 celler. Vi fant ut at epitelial-mesenchymale overgang (EMT), migrasjon og inflammatoriske prosesser kan være meningsfullt relatert til regulering av stråle responser i radioresistant A549 celler. Basert på resultatene av bioinformatiske analyse for stråleindusert transkriptomet endring, valgte vi sju betydelige stråle forandret gener (
SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2 Hotell og
FDXR
) og deretter sammenlignet strålingseffekter i to typer av NSCLC-celler med forskjellig Radiosensitivity (radioresistant A549-celler og radiosensitive NCI-H460-celler). Interessant, ved bestråling,
COX-2
viste den viktigste forskjellen i mRNA og protein uttrykk mellom A549 og NCI-H460-celler. IR-indusert økning av COX-2 uttrykk ble dukket opp bare i radioresistant A549 celler. Samlet foreslår vi at COX-2 (også kjent som prostaglandin-endoperoxide syntase 2 (PTGS2)) kunne ha muligheten som en antatt biomarkør for radioresistance hos NSCLC celler
Citation. Yang HJ, Kim N, Seong KM , Youn H, Youn B (2013) Undersøkelse av stråling-indusert transkriptomet Profilen til Radioresistant ikke-småcellet lungekreft A549-celler ved hjelp av RNA-seq. PLoS ONE 8 (3): e59319. doi: 10,1371 /journal.pone.0059319
Redaktør: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan
mottatt: 15 november 2012; Godkjent: 13 februar 2013; Publisert: 22 mars 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Nuclear Research Development Program (2012-0006383) og ved Basic Science Research Program (2012-0003201) gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. KMS er for tiden ansatt i Stråling Health Research Institute, Korea Hydro Nuclear Power Co., Ltd Andre forfattere erklære at det ikke er noen interessekonflikter. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Strålebehandling, alene eller i kombinasjon med kirurgi eller kjemoterapi, spiller en avgjørende rolle i behandling NSCLC. Men de terapeutiske resultatene er ikke fullt ut tilfredsstillende i mange tilfeller. Med uventede strålings reaksjoner under strålebehandling, (intrinsic /ervervet) radioresistance er ansett som en viktig faktor som begrenser effekten av strålebehandling mot NSCLC [1].
Radiosensitivity av celler og vev har vært knyttet direkte til spredning priser , og stråleinduserte modifikasjoner av genekspresjon er hovedsakelig involvert i cellesyklusprogresjon, DNA-reparasjon og apoptose [2]. Radioresistance i NSCLC er blitt forbundet med tap av p53-funksjon, endret ekspresjon av overlevelses proteiner, slik som X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) og Survivin, aktivering av fosfoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt signale [3], eller overekspresjon av Pim-en kinase [4]. Også, samler bevis antyder at radioresistance er ofte korrelert med epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), og overekspresjon av anti-oksiderende enzymer så som Mn-superoksyddismutase (Mn-SOD) [5], [6]. Selv om disse studiene har bidratt til forståelse av mekanismene for celle radioresistance, kan de forklare bare en delvis aspekt av radioresistant svar, og de omfattende funksjonelle mekanismer fortsatt i stor grad unnvikende. Dette resultat er ikke overraskende, tatt i betraktning arten av radioresistance regulert av komplekse interaksjoner mellom flere gener og /eller proteiner. Dessuten er det flere rapporter som Radiosensitivity ikke utelukkende er knyttet til stråle-indusert apoptose, og kan avhenge av flere molekyler og prosesser som har ennå ikke blitt identifisert [7]. Derfor har det vært vanskelig å belyse den nøyaktige mekanisme for radioresistance og for å forstå hele endring av stråle responser i NSCLC.
Omfattende gene expression profilering analyse kan øke forståelsen av den molekylære mekanismen for radioresistance modulert av komplisert genetisk og biokjemisk nettverk. Microarray er den mest omfattende tilnærming for å måle genuttrykk og har ført til fremragende fremskritt i kunnskapen om radioresistance [8], [9]. Imidlertid har microarray flere begrensninger som probe hybridisering kinetikk, probe utvalg (trenger å vite genomisk loci og funksjoner), bakgrunns hybridisering og cross-platform sammenlignbarhet [10]. Sekvensering-baserte uttrykk analyse har blitt utviklet for å overvinne disse begrensninger i hybridiserings-baserte analysen. I løpet av de siste 10 årene har innføring av high-throughput neste generasjons sekvensering (NGS) teknologier revolusjon transcriptomics ved å gi muligheter for flerdimensjonale studier av cellulære transcriptomes. Det blir mulig fordi store ekspresjonsdata er kjøpt til en enkelt-basen oppløsning. Som hoved kvantitativ transkriptomet profilering plattform, har RNA-seq blitt betraktet som en ny eksperimentell metode for å erstatte microarray. I RNA-seq, (total eller messenger) RNA-populasjon blir omformet til et bibliotek av cDNA-fragmenter med adaptere festet til en eller begge ender. Hvert bibliotek, med eller uten forsterkning, er deretter sekvensert for å oppnå kort sekvens leses fra den ene enden (enkelt-ende sekvensering) eller begge ender (parvise ende sekvensering). Lese sekvenser er vanligvis 30-400 bp i lengde, avhengig av sekvense plattformer: Illumina, Roche 454 eller solid system. Etter sekvensering, leser den resulterende er enten justert til referansegenom eller karakterutskrifter, eller sammen
de novo
uten genomisk sekvens [11]. På grunn av høy dybde på lese dekning, produserer RNA-seq en mer nøyaktig måling for nivåer av vitnemål og deres isoformer enn andre verktøy. Videre kan det brukes til å undersøke transkripsjons konstruksjoner i sammenheng av transkripsjonsstartsider, alternativ spleising mønstre og andre post-transkripsjonelle modifikasjoner. RNA-seq har blitt brukt til å identifisere lange ikke-kodende RNA som spiller en viktig rolle i transkripsjonen og post-translasjonell genregulering [11].
Til nå har det ikke vært noen studier for å vurdere de globale strålings svar på hele transkriptomet nivå i NSCLC celler. Vi har fokusert på RNA-seq å overvinne begrensninger av tidligere undersøkelser som indikerer noe fragmentariske bevisene på radioresponses, og deretter foreslått at RNA-seq kan være en ideell måte å få innsikt i de komplekse stråling respons. I denne studien ønsket vi å karakter transkriptomet av radioresistant NSCLC A549 celler og for å undersøke funksjonelle regulatoriske nettverk på genetisk nivå. For å oppnå disse målene, vi gjorde full bruk av en strategisk kombinasjon av RNA-seq-avledet genuttrykk data og resultatene av bioinformatiske og biologiske analyser. Det er den første studien å bruke denne nye teknologien, RNA-seq å profilere stråling-indusert genekspresjon i radioresistant NSCLC celler. Vi foreslår at våre resultater kan gi nyttig informasjon for identifikasjon av potensielle biomarkører for radioresponses som radioresistance, og til slutt bidra til å forstå stråling effekter i NSCLC celler.
Materialer og metoder
Reagenser
Cell kulturmedier (RPMI 1640), ble FBS og antibiotika (penicillin og streptomycin) kjøpt fra Hyclone (Logan, UT). Antistoffer mot EGFR, p53, Sestrin2, COX-2, TRAF4 og β-aktin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer for fosfor-EGFR (Tyr1068), fosfor-EGFR (Tyr845), fosfor-Akt (Ser473), fosfor-Akt (Tyr308), Akt, fosfor-p53 (Ser15), p21 og fosfatase og tensin homolog (PTEN) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoff mot γ-H2A.X (Ser139) ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA). Antistoff for FDXR ble kjøpt fra Abcam (Austin, TX).
Cell Kultur og Bestråling
Menneskelig NSCLC cellelinjer (A549 og NCI-H460) ble kjøpt fra koreanske cellelinje Bank (Seoul, Republikken, Korea). Begge celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplementert med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 U /ml) og 10% FBS. Celler ble utsatt for ioniserende stråling (IR) ved hjelp av
137Cs γ-stråle (IBL 437C, CIS bio International) i en dose hastighet på 0,8 Gy /min. Bestrålte celler ble inkubert i ytterligere fire timer.
RNA-seq Bibliotek Forberedelse og sekvense
Total RNA ble isolert fra bestrålte og ikke-bestrålte A549 celler ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA kvalitet ble vurdert ved agarose gelelektroforese (visuell fravær av vesentlig 28S og 18S rRNA degradering) og ved hjelp av spektrofotometri. Deretter total RNA integritet ble kontrollert ved hjelp av en Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer med et RNA integritet nummer (RIN) verdi større enn 8. mRNA var renset og fragmentert fra total RNA (2 mikrogram) med poly-T oligo-festet magnetiske kuler med to runder med rensing. Kløyvet RNA fragmenter primet med tilfeldige heksamer ble revers transkribert til første-cDNA ved hjelp av revers transkriptase og tilfeldige primere. RNA-templat ble fjernet og syntetisert en erstatning tråd for å generere dobbeltstreng-cDNA. Slutt reparasjon, A-tailing, adapter ligering, cDNA mal rensing og berikelse av de rensede cDNA maler ved hjelp av PCR ble deretter utført. Konstruerte bibliotekene var 100 bp parvise end sekvensert ved en Illumina GAIIx sequencer på to baner av strømningscellen, etter produsentens anvisninger.
Gene ontologi (GO) Analyse
GO analyse er et vanlig brukt fremgangsmåte for funksjonelle studier i stor skala genomisk eller transcriptomic data [12]. Den Gene ontologi Enrichment Analysis Software Toolkit (GoEast, https://omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/php/illumina.php) ble brukt til å identifisere betydelig beriket GO vilkår blant den gitte listen over gener som er forskjellig uttrykt i respons IR. Statistisk overrepresentert GO kategorier med p-verdi. 0,01 ble betraktet som signifikant
Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA)
IPA programvare (Oppfinnsomhet System, Redwood City, CA) ble benyttet for å analysere vår RNA -seq data i form av biologiske responser og kanoniske veier. Ranking og betydningen av biofunctions og de kanoniske trasé ble testet av p-verdien. I tillegg ble kanoniske trasé bestilt av forholdet (antall gener fra inngangsdatasettet som tilordnes til den veien dividert med det totale antall molekyler som eksisterer i kanonisk reaksjonsveien). IPA genereres også mobilnettverk der differensielt regulerte gener kan relateres henhold til tidligere kjente sammenhenger mellom gener eller proteiner, men uavhengig av etablerte kanoniske trasé. Mest nettverk representert assosiative nettverksfunksjoner basert på en score som vurderer -log (
p
-verdi), som samler sannsynligheten av genene i nettverket blir funnet sammen på grunn av tilfeldigheter. Resultat ≥2 ble betraktet som signifikant.
Sanntids Reverse Transcription (RT) -PCR
Total RNA ble utsatt for RT med tilfeldige heksamer ved hjelp av Super First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad , CA) for å oppnå cDNA-er. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Terskel sykluser (CT) ble automatisk beregnet av Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). PCR tilstand var som følger: polymerase aktivering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 1 min. Intensiteten av hvert gen ble normalisert mot GAPDH uttrykk. Differensial ekspresjon ble beregnet som et forhold av uttrykket nivåer av målgener i bestrålte og ikke-bestrålte celler, i henhold til ΔΔ C
t
metoden [13]. For alle primere parene, ble spesifikk amplifikasjon av PCR-produktene bekreftet ved smelting kurve analyse og agarosegel-elektroforese. -Primere ble utformet ved hjelp av Primer Express ® 4,0 (Applied Biosystems, Foster, CA) og sekvensene er presentert i tabell 1.
Western Blot analyse
Etter 4 timer bestråling totale celle lysater (5 x 10
6-celler) ble fremstilt under anvendelse av RIPA-lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM PMSF, 0,25% Na-deoksycholat, og 5 U /ml aprotinin). For western blot-analyse, denaturert protein lysatene (40 ug) ble underkastet SDS-PAGE. Separerte proteiner ble overført til en nitrocellulosemembran og blokkert med 5% skummet melk i TBST (10 mM Tris, 100 mM NaCl og 0,1% Tween 20) i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble deretter undersøkt med spesifikke primære antistoffer etterfulgt av peroksidase-konjugert sekundært antistoff, og visualisert ved hjelp av en ECL deteksjonssystem (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).
Resultater
Design av RNA-seq Study in Radioresistant NSCLC Cells
Hver cellelinje avledet fra NSCLCs har blitt rapportert for deres ulike Radiosensitivity. A549-celler, en velkarakterisert radioresistant NSCLC-cellelinje, viser signifikant toleranse for stråling og beskjedne tap av celle-levedyktighet etter eksponering for IR [4], [14]. I denne studien ønsker vi å undersøke stråling-indusert hele transkriptomet endring i radioresistant NSCLC celler ved hjelp av RNA-seq, og dessuten til å identifisere radioresistance-assosiere faktorer (potensielle biomarkører for radioresistance). For å verifisere de aktuelle eksperimentelle betingelser for RNA-seq analyse, undersøkte vi den tidsavhengige uttrykk for flere proteiner som kalles radioresponsive faktorer [15], [16], [17] i radioresistant NSCLC A549 cellene under bestråling. Dessuten vurderer kumulative effekten av stråling, ble bestråling dose satt til 2 Gy. Dette var innenfor doseområdet vanligvis administrert i stråling biologiske eksperimenter som involverer celler [18]. Som vist på fig. 1A, uttrykket nivåer av fosfor-EGFR (Tyr845), fosfor-Akt (Ser473) og p21 viste en maksimal økning på 4 timer etter bestråling. I tillegg IR-indusert PTEN uttrykk ble gradvis redusert, mens phosphoryaltion av Akt på Ser473 ble økt i en tidsavhengig måte.
(A) Fastsettelse av passende bestråling tilstand basert på uttrykk av representative radioresponsive proteiner. (B) En prinsippskisse for design og målene for vår studie. Hat justerer RNA-seq leser til genom referanse (hg19) og finner avskrift spleiseseter. Mansjettknapper montere leser generert fra TopHat justering inn transkripsjoner. Mansjettknapper Pakken består av følgende programvare – mansjettknapper, monterer transcrips; Cuffcompare, sammen transkripsjon forsamlinger til merknad; Cuffdiff finner differensielt uttrykte gener og transkripsjoner.
Ved hensikten med forsøket, sekvense plattformer, lese lengder og sekvense typer bør være riktig bestemt. Disse forsøksbetingelser er nært relatert til effektiviteten av RNA-seq analyse. Illumina sekvense plattformen ser ut til å være svært replikeres med relativt lite teknisk variant som for eksempel avskrift lengde skjevhet [19]. Det viser større transkriptom dekning og sekvense dybde [10]. Videre er parvise end sekvense egnet for å drive kvalitativ analyse som transkripsjon start stedet kartlegging, påvisning av genet fusion utskrifter og alternativ spleising, og kartlegging av genom strukturelle varianter, inkludert slettinger, innsettinger og rearrangements [20]. Basert på disse forskningsresultater, etter 4 timers bestråling ble totalt RNA isolert fra bestrålte og ikke-bestrålte radioresistant A549 celler, som brukes til å lage Illumina RNA-seq bibliotek, og deretter utsatt for 100 bp sammenkoblet ende sekvensering ved hjelp av Illumina GAIIx plattform. Et skjematisk diagram for design og målene for vår studie er presentert i fig. 1B
Identifikasjon av Radioresponsive Gener i Radioresistant NSCLC Cells gjennom transkriptomet Analyse
Totalt antall RNA-seq leser (resultat format: FASTQ). Ervervet fra bestrålte og ikke-bestrålte radioresistant NSCLC A549 celler, var 32.315.026 (6527635252 bp) og 31084922 (6279154244 bp), henholdsvis. Vi justert sekvensen leser til en menneskelige genom referanse (hg19) ved hjelp Hat versjon 1.2.0. Splice veikryss ble hentet fra RefSeq justering (ned fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Genome Browser). Totalt, i det minste én ende av 28372827 (87,8%) og 27514052 (88,5%) leser for de bestrålte og ikke-bestrålte A549-celler, henholdsvis, ble med hell kartlagt mot hg19. Neste, de resulterende lese justeringer (filformat: BAM) ble samlet gjennom mansjettknapper versjon 1.0.3, og det skapte en ny transkripsjon ved å bruke mansjettknapper henvisning merknad basert transkripsjon (rabt) algoritme. Transkripsjonene kombinert med Cuffcompare ble brukt til å beregne relative Forekomsten av hver transkripsjon gjennom Cuffdiff. Genuttrykk nivåer ble bestemt ved å måle summen av fragmenter per kilobase av exon modell per million kartlagt leser (FPKM) verdier til sine eksoner. Å tilegne seg mer nøyaktige resultater, vi filtrert ut hver data, hvis estimerte FPKM verdier i både bestrålt og ikke-bestrålt prøve var mindre enn 1,0 (jf FPKM verdi på 0,05 som nedre grense uttrykksnivå er ofte angitt). Til syvende og sist, identifiserte vi at 727 gener ble betydelig forskjellig uttrykt i radioresistant A549 celler etter bestråling. Blant disse genene, ble 367 gener oppregulert, og 360 gener ble nedregulert. Ifølge mobil funksjonell kategorisering, var signifikant oppregulert gener klassifisert som følger: cellesyklusen (
CDKN1A, MLL5, NEK11, TP53INP1
), reparasjon (
DDB2, REV3L, SESN1, SESN2, XPC
), celledød (
ACER2, BTG2, MDM2, MEF2A, OPA1, PLTP, TRIAP1
), lipid metabolisme (
COL4A3, COX-2
), cellevekst og spredning (
DOK1, EIF2AK2, FDXR, DFRK, GDF15, GSTM1, PDK1, PGF, PIK3IP1, PPM1D, RHOBTB2, SH3BP2, SHBG, SLC22A1
) og immunsystemet svar (
foxp3, TNFSF9
). Også var signifikant nedregulert gener klassifisert som følger: cellesyklusen (
CDC42, MT2A, SPC25, STAT5A
), reparasjon (
H2AFX, PDE11A, XRCC3
), cellulær utvikling (
GPER, ICAM2, OPHN1
), celledød (
CARD8, CEACAM1, PTPRG, ST6GAL1
), cellevekst og spredning (
BAI1, F3, KLF11, MNT, MORF4L1, MYC, ROMO1 , SMAD1, ST7L, TBXA2R
) og immunsystemet svar (
IL12A
). Detaljerte resultater er vist i Dataset S1, Tabell S1 og Tabell S2.
I tillegg til å bekrefte de karakteristiske kromosomale plasseringen av gener som kontrollerer stråling svar, undersøkte vi uttrykket landskapet over hele kromosomer ved å undersøke endring av genuttrykk i bestrålt radioresistant A549 celler. I 400 kb skyvevindu, antall differensielt uttrykte gener av A549-celler i respons på IR, er plottet sammen med hele kromosomer ved hjelp av tilpassede spor av UCSC Genome Browser (fig. 2). Vi fant ut at kromosom fordelingsmønstre varierte sterkt med hensyn til genet tetthet, og spesielt kromosom 19 viste den høyeste genet tetthet av kartlagt genene. I radioresistant NSCLC A549 celler, ble et stort antall gener som viser IR-forandret uttrykket ligger på kromosom 1, 2, 3 og 19. Men vi kunne ikke få meningsfull informasjon for direkte sammenheng mellom stråling svar og disse kromosom distribusjonsmønstre.
(x-aksen: kromosom koordinere, y-akse: antall differensielt uttrykte gener av A549 celler under bestråling i 400 kb skyve vindu).
Undersøkelse av stråling-indusert transkriptom Endring i Radioresistant NSCLC-Cells gjennom GO analyse
Innenfor gitte gensettene (microarray eller NGS eksperimentelle datasett), gir GO-basert funksjonell analyse statistisk beriket GO vilkår, som beskriver genprodukter og demonstrerer sine relasjoner etter tre ontologi kategorier: biologisk prosess, molekylær funksjon og cellulær komponent [12]. For å analysere våre RNA-seq data basert på grupper av funksjonelt relaterte gener i stedet for enkeltgener, brukte vi GoEast som en web-basert høy gjennomstrømming funksjonell genomikk analyseverktøy. Vi identifiserte betydelig beriket GO vilkår og preget stråling reaksjoner fra radioresistant NSCLC A549 celler. Totalt ble beriket GO vilkår funnet i 77 underkategorier i henhold biologisk prosess, 17 underkategorier i henhold cellekomponent, og 50 underkategorier i henhold molekylære funksjon. I biologisk prosess ontologi, indikerte resultatene at kjernefysisk lokalisering, TGF-β reseptor signalveien, cellesyklus arrest, cellemigrasjon, serin /treonin kinase signalveien, angiogenese, BMP signalveien, og regulering av celle morphogenesis er i hovedsak knyttet til radioresponses i radioresistant A549 celler. Fokal adhesjon var en av de viktigste cellulære komponenter modifisert ved IR. Betydelig GO berikelse profiler i den biologiske prosess og cellulære komponenter kategorier (bare p-verdi mindre enn 0,01) er oppsummert i tabell 2. Vi har også bestemt de overrepresentert GO betingelser i et grafisk format i henhold til deres forhold i det hierarkiske treet av molekylær funksjon ontology (fig. 3). Beriket GÅ molekylære funksjon vilkår i radioresistant A549 cellene under bestråling ble β-galaktosid α-2,6-sialyltransferase aktivitet, pyruvat dehydrogenase kinase aktivitet, TGF-β reseptor aktivitet, GTP bindende protein trans transporter aktivitet, filamin bindende og activin reseptor aktivitet. Gjennom GO analyse, fant vi at overrepresentert GO vilkår i våre radioresponsive gensettene, er nært knyttet til EMT, migrasjon og videre angiogenese. Med involvering av fokal adhesjon komponenter, TGFp /BMP-signalering, filamin binding og aktivin reseptor-aktivitet har blitt rapportert å regulere endring av celle-morfologi i løpet av EMT eller cellemigrering. Tatt sammen, foreslår vi at EMT og EMT-relaterte hendelser kan være avgjørende i å regulere stråling responser i radioresistant A549 cellene under bestråling.
Hver boks har GO vilkår merket med sin GO ID, term definisjon og detaljert informasjon som representerer « q /m | t /k (p-verdi) «.
q
er antall gener assosiert med det børsnoterte GO ID (direkte eller indirekte) i vårt datasett,
m
er antall gener assosiert med det børsnoterte GO ID (direkte eller indirekte ) på den valgte plattformen,
k
er det totale antall gener i vårt datasett,
t
er det totale antall gener på den valgte plattformen, og p
–
verdi representerer betydningen av berikelse i datasettet i det børsnoterte GO ID med hypergeometrisk fordeling. Grener av GO hierarkisk tre uten betydelig beriket GO vilkårene ikke er presentert. Graden av fargemetningen av hver boks er positivt forbundet med anrikning betydningen av det tilsvarende GO sikt. Betydelig beriket GO vilkår er angitt i gule bokser. Ubetydelige GO ord innenfor det hierarkiske treet vises som hvite bokser. Pilene viser sammenhenger mellom ulike GO vilkår. Røde piler viser relasjoner mellom to beriket GO vilkår, avslører sorte heltrukne piler relasjoner mellom beriket og ikke-anrikede vilkår, og svart stiplet pil avdekke sammenhenger mellom to ikke-anrikede GO vilkår.
Undersøkelse av stråling-indusert transkriptomet Endring i Radioresistant NSCLC cellene gjennom IPA analyse
IPA ble utført for funksjonell analyse av våre radioresponsive gensettene kjøpt fra RNA-seq. Som et resultat bekreftet vi 25 nettverk, topp biofunctions (22 sykdommer og lidelser og 27 molekylære og cellulære funksjoner) og 177 kanoniske trasé som er opptatt av den strålingsinduserte transkriptomet endring i radioresistant A549-celler. De mest signifikant relatert biofunctions og kanoniske baner (bare p-verdi mindre enn 0,01) er vist i tabell 3. På bakgrunn av resultatene i IPA biofunctions henhold sykdommer og lidelser kategori, først foreslo vi at immunologiske /betennelsesreaksjoner kan være en meningsfull måte forbundet med svar til IR i radioresistant A549 celler. I tillegg blant 25 nettverk, topp syv nettverk supplert med IPA-score, antall fokus gener, biofunctions og hub gener /hub-samspill partnere er presentert i tabell 4. høy-scoring funksjoner i nettverkene var celledød, binde vev utvikling og funksjon, cellesyklus, lipidmetabolismen, reparasjon DNA, celledød, celle morfologi og immuncelletrafikken. De tre øverste skåringsnett, som kan være vesentlig ansvarlig for radioresponses i radioreisistant A549-celler, er vist i fig. 4. Den detaljerte cellulære funksjoner for hvert nettverk var som følger: (i) celledød, post-translasjonell modifikasjon, og protein folding (IPA-score på 38), (ii) kreft, cellulær utvikling og utbygging bindevev og funksjon ( IPA-score på 37), og (iii) cellesyklus, celleutvikling, og hematologiske system utvikling og funksjon (IPA-score på 37). 20 hub gener som viktige regulatorer av stråle responser i radioresistant A549 celler, ble presentert i Tabell 4. De var som følger:
AR, BID, CAMK2D, CDC42, CDKN1A, DLG4, EIF2AK2, IFIT3, MEF2A, MDM2, MYC, myOCD, NFKB2, NOTCH1, COX-2, PTK2, SMAD1, SMAD5, TRAF1 Hotell og
XPC
. De fleste hub gener i nettverkene er i hovedsak knyttet til cellesyklus, celleproliferasjon og apoptose. Men med immunologiske /betennelsesresponser i biofunction kategorien tidligere nevnt, er det verdt å legge merke til at COX-2 spiller en viktig regulerende rolle i betennelse ble påvist som et knutepunkt gen som er involvert i strålings svarene av radioresistant NSCLC A549 celler.
(A) Nettverk for celledød, post-translasjonell modifikasjon, og protein folding (score: 38). (B) Nettverk for mobilnettet, utvikling bindevev og funksjon, og kreft (Poeng: 37). (C) Nettverk for cellesyklus, cellulær utvikling, og hematologiske system utvikling og funksjon (score: 37). Nettverk vises grafisk som noder (gener /genprodukter) og kanter (biologiske relasjoner mellom nodene). Intensitet av noden farge angir graden av regulering (red: oppregulering grønn: nedregulering, hvit: ikke uttrykt forskjellig men relatert til dette nettverket).
real-time RT-PCR Validering av RNA-seq resultater
Gjennom GO analyse og IPA, fant vi at EMT-tilknyttede hendelser, cellemigrasjon og betennelsesprosessen er nært knyttet til stråling responser i radioresistant NSCLC A549 celler. Vi videre undersøkt forholdet mellom disse radioresponses og navet gener /hub-samspill gener i IPA nettverksanalyse. Basert på resultatene, valgte vi syv mulige kandidat gener for betydelige stråle endret faktorer (
SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2 Hotell og
FDXR
). For å validere nøyaktigheten av våre RNA-seq data, ble real-time RT-PCR utføres på følgende utvalgte sju gener. Det ble utført under de samme betingelser som de som anvendes for RNA-seq analyse. En sammenligning av fold endringer mellom RNA-Seq og real-time RT-PCR for hvert gen (
SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2 Hotell og
FDXR
) blir vist i fig. 5A. Som et resultat, vi bekreftet at sanntids RT-PCR uttrykksprofiler var i nesten fullstendig avtale med RNA-seq data. Selv om det var små forskjeller i folden endre verdier mellom to målemetoder, ble disse resultatene generelt svært knyttet sterkt støtte påliteligheten av vår RNA-seq analyse.
(A) Korrelasjonen av differensial uttrykk mellom RNA- seq og real-time RT-PCR. Loggen
2 forhold ble generert ved å sammenligne uttrykk nivåer i bestrålt til ikke-bestrålte radioresistant A549 celler. (B) Forslag av genekspresjon-baserte antatte biomarkører av radioresistance i NSCLC celler. Amplifikasjon av GAPDH-fragmentet i PCR ble brukt som kontroll. Resultatene ble bekreftet ved tre uavhengige eksperimenter. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) og analysert ved anvendelse av en enveis ANOVA på rangert data, etterfulgt av en Tukey s ærlig signifikant forskjell test og den to-veis ANOVA på rangert data, etterfulgt av en Bonferroni post test ved anvendelse av Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, California). * P-verdi 0,05; bestrålte celler versus kontrollceller, ** p-verdi 0,01; bestrålte celler versus kontrollceller, *** p-value 0,001; bestrålte celler versus kontrollceller.
Identifikasjon av Kandidater til Radioresistance-assosiere faktorer hos NSCLC Cells
A549 og NCI-H460-celler kan brukes som modeller for radioresistant og radiosensitive NSCLC celler , henholdsvis, på grunn av deres betydelige forskjeller i Radiosensitivity [4], [14]. For å bekrefte hvorvidt
SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2 Hotell og
FDXR
kan være relatert til mobilnettet radioresistance hos NSCLC celler, mRNA uttrykk av disse genene ble sammenlignet mellom radioresistant A549 og radiosensitive NCI-H460-celler gjennom real-time RT-PCR (fig. 5B). Resultatene indikerte at
COX-2
og
CDKN1A
viser signifikant forskjellige uttrykk mønstre i begge cellelinjer som respons på IR. Under bestråling, den mest forskjellig uttrykt gen mellom A549 og NCI-H460-celler var
COX-2
. I radiosensitive NCI-H460-celler,
COX-2
ble ikke oppdaget selv etter bestråling. I 50 syklus real-time PCR tilstand, IR indusert bare beskjedne uttrykk for
COX-2
. Som vist på fig. Som vist på fig.
