Abstract
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall i USA og resten av verden. Ankomsten av molekylært rettet terapi holder løftet for forbedring i terapeutisk effekt. Cytosol fosfolipase A2 (CPLA
2) er assosiert med tumorprogresjon og radioresistance i musetumormodeller. Utnytte CPLA
2 spesifikk hemmer PLA-695, bestemt vi hvis cPLA2 hemming radiosensitizes ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler og svulster. Behandling med PLA-695 svekket stråling indusert økning av fosfor-ERK og fosfor-Akt i endotelceller. NSCLC celler (LLC og A549) co-kultivert med endotelceller (bEND3 og HUVEC) og forbehandlet med PLA-695 viste bestrålingssensibilisering. PLA-695 i kombinasjon med bestråling (IR) betydelig redusert migrering og proliferasjon i endotelceller (HUVEC A549). I en heterotopisk tumormodell, kombinasjonen av PLA-695 og stråling forsinket vekst i både LLC og A549-tumorer. LLC og A549-tumorer behandlet med en kombinasjon av PLA-695 og stråling som vises redusert tumorvaskulatur. I en dorsal hud fold modell av LLC tumorer, inhibering av CPLA
2 i kombinasjon med stråling førte til forbedret destruksjon av tumorblodkarene. Den anti-angiogene effekter av PLA-695 og dens forbedring av effektiviteten av strålebehandling i musemodeller av NSCLC foreslå at kliniske studier for sin evne til å forbedre strålebehandling utfall er garantert
Citation. Thotala D, Craft JM, Ferraro DJ, Kotipatruni RP, Bhave SR, Jaboin JJ et al. (2013) cytosolic PhospholipaseA2 Hemming med PLA-695 Radiosensitizes Svulster i Lung Cancer dyremodeller. PLoS ONE 8 (7): e69688. doi: 10,1371 /journal.pone.0069688
Redaktør: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Frankrike
mottatt: 31 oktober 2012; Godkjent: 14 juni 2013; Publisert: 19.07.2013
Copyright: © 2013 Thotala et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NIH tilskudd R01-CA12575706 og R01-CA14022002, Oppstarts midler til Thotala fra Department of Radiation Oncology, Siteman Cancer Research Fund fra Washington University i St. Louis og Grant fra Pfizer Inc. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. PLA-695 ble innhentet fra Pfizer Inc. under Pfizer-Washington University biomedisinsk avtalen. Per Pfizer-Washington University biomedisinsk avtalen manuskriptet ble sendt til Pfizer Inc. og ryddet for publisering. Verken forfatterne eller noen av deres familiemedlemmer har noen økonomiske eller ikke-økonomiske konkurrerende interesser med PLA-695 eller Pfizer Inc. Forfatterne bekrefter også at dette ikke endrer og fester seg til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er en ledende årsak til kreft dødsfall i USA. The American Cancer Society estimater i 2012 tyder på at det var over 225 000 nye tilfeller og over 160 000 dødsfall av lungekreft i USA [1]. Strålebehandling (RT) som en integrert del av lungekreft ledelse [2]. I det siste tiåret har det vært betydelige forbedringer i strålebehandling kan tilskrives utviklingen innen klinisk, fysikk og biologi forskning [3]. Til tross for disse forbedringer i terapeutiske regimer, lokalt tilbakefall av lungekreft forblir et vedvarende problem [4]. De fleste pasienter med inoperabel ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har en dårlig prognose med median overlevelse på ca 18 måneder, til tross for aggressiv behandling [5], [6]. Det er derfor et stort behov for å utvikle mer effektive metoder for behandling av NSCLC.
ioniserende stråling (IR) ikke bare skader kjerne-DNA, men også aktiverer en rekke signal kaskader av intracellulære [7], [8]. Fosfolipase A2 (PLA
2, katalyserer hydrolysen av membran-fosfolipider ved SN-2-stillingen for å frigjøre lipid andre budbringere [9]. Ioniserende stråling aktiverer cytosolisk fosfolipase A2 (CPLA
2) på endoteliale celler [10]. etter aktivering CPLA
2 spalter palmitinsyre å danne fosfatidylcholin (PC) [11], [12], [13], [14], som deretter fører til produksjon av lysofosfatidylcholin (LPC), lysofosfatidisk syre (LPA), prostaglandin E
2 (PGE2) og arakidonsyre [15], [16], [17], [18]. arachidonsyre og LPA spille viktig rolle i invasjon og signalering i løpet av kreft progresjon [14], [19], [ ,,,0],20], [21]. aktiveringen av CPLA
2 stimulerer proliferasjon av endotelceller og fremmer dannelsen av vaskulære nettverk [16], [17]. LPC utløser nedstrøms aktivering av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og mitogen-aktivert proteinkinase (MAP) /ekstracellulære signal reguleres kinase (ERK), som. fører til økt cellelevedyktighet av endotelet i svulsten mikromiljøet [16], [17], [22]. Aktivering av CPLA
2 i tumoren mikromiljøet fører til økt blodkar og forbedret tumorogenesis fører til radioresistance av tumoren og minsker effekten av stråleterapi [23], [24]. Kombinasjon av bestråling med inhibering av CPLA
2 i prekliniske lungekreft tumormodeller er blitt vist å undertrykket tumorvekst og redusert angiogenese [25], [26].
Tidligere undersøkelser har anvendt CPLA
2 inhibitorer uegnet for oversettelse til klinikken på grunn av deres toksisitet [17]. Vi studerte effekten av PLA-695, en CPLA
2-hemmer som allerede har blitt testet i kliniske studier. Den fase I studie (NCT00366262) evaluere sikkerheten av PLA-695 sammenlignet med placebo og naproksen er gjennomført (klinisk trials.gov). Senere, fase II klinisk studie (NCT00396955) sammenlignet 4 doseringer av PLA-695, naproxen, og placebo hos pasienter med slitasjegikt i kneet (klinisk trials.gov). Den foreliggende undersøkelse bestemmes effekten av PLA-695 i kombinasjon med bestråling for å behandle musemodeller av lungekreft.
Vi fant at PLA-695 hemmer stråling indusert fosforylering av ERK og Akt i dyrkede endotelceller. PLA-695 i kombinasjon med bestråling hindret endotelial cellemigrering. PLA-695 forbedret stråleindusert celledød og svekket invasjon av lunge kreftceller. PLA-695 hemmet dannelsen av nye blodkar og angiogenese [26]. I tillegg PLA-695 forbedret effekten av stråling i to musemodeller av lungekreft.
Metoder
Cell Culture and Treatment
Primær kultur of Human navleveneendotel Cells (HUVECs) samlet fra flere donorer ble hentet fra Cambrex (East Rutherford, NJ, USA) og vedlikeholdes i fullstendig EBM-2 medium (Cambrex). Celler fra passasjene 2-5 ble anvendt i denne studien. HUVECs ble sultet i 1 time før behandling i additiv-fri EBM-2 medium. 3B11 mikrovaskulære celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og opprettholdt i DMEM med 5% føtalt bovint serum (FBS). Celler fra passasjene 3-6 ble anvendt i denne studien. 3B11s ble sultet i DMEM + 1% FBS i 3 timer før alle studier. PLA-695 ble innhentet fra Pfizer Inc under Pfizer-WU biomedisinsk avtalen. For bestråling av celler, Therapax 250 X-ray maskin (Pantak Inc., East Haven, CT, USA) leverer 2,04 Gy /min ved 250 kVp ble brukt. På grunn av høy følsomhet av HUVECs til temperatur og pH, ble cellene holdt i en inkubator ved siden av stråle før og etter behandling. I forsøk med PLA-695, ble cellene behandlet i 45 minutter før IR (3 Gy) med enten dimetylsulfoksyd (DMSO, bærerkontroll) eller varierende konsentrasjon av legemiddel i DMSO (10-600 nM).
co -Kultur klonogene overlevelses Assay
HUVEC (1,0 x 10
6) og bEnd.3 celler (1,0 x 10
6) ble sådd ut i 100 mm plater og etter 24 timer, A549 (2 x 10
6) og LLC (2 x 10
6) celler ble platet ut på Transwell innsatser (Corning Inc., Corning, NY). Etter ko-dyrking i 24 timer ble cellene behandlet med 300 nM av PLA-695 eller bærerkontroll DMSO i 45 minutter før IR med 0, 2, 4, 6 eller 8 Gy. Etter behandlingene som co-kultur med enten PLA-695 eller DMSO beregnede antall LLC og A549 celler ble sådd for å aktivere normalisering for plating effektivitet. Klonogene analyser ble også utført med LLC og AF549 alene. Faste antall celler ble sådd for å aktivere normalisering for plating effektivitet. Cellene fikk feste i 5 timer og deretter behandlet med 300 nM av PLA-695 eller bærerkontroll DMSO i 45 minutter før IR med 0, 2, 4, 6 eller 8 Gy. Etter 7-10 dager ruge plater ble fiksert med 70% EtOH og farget med 1% metylenblått. Kolonier bestående av 50 celler ble talt ved å vise at platene under et mikroskop. Overlevelses fraksjoner ble beregnet som (antall kolonier /antall celler belagt) /(antall kolonier for tilsvarende kontroll /antall celler belagt).
Colorimetric Cell Proliferation Assay
Celleproliferering var bestemmes ved hjelp av celle titer 96 Aqueous ikke-radioaktive Cell Proliferation Assay Reagent (Promega). Analysen ble utført ved å følge produsentens protokoll. Kort oppsummering cellene ble behandlet med enten DMSO kontroll eller 300 nM PLA-695 i 45 minutter og bestrålt med 3 Gy. Mediet ble skiftet etter 1 time, og platene ble inkubert i 96 timer. Celleviabilitet ble målt kolorimetrisk etter 96 timer ved å måle absorbans ved 490 nm. Forsøk ble utført in triplo og standardfeil ble beregnet.
morfologisk analyse av celler farget med DAPI
LLC og A549-celler ble dyrket i kammers objektglass og behandlet med enten DMSO eller 300 nM PLA-695 i 45 minutter og deretter bestrålt med 3 Gy. Ved 96 timer etter bestråling ble cellene fiksert i 4 paraformaldehyd og deretter beiset med 2,5 μgml 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i fosfat-bufret saltløsning. Photomicrographs ble tatt med et Olympus BX60 fluorescerende mikroskop utstyrt med digitalt kamera. Multinucleated celler og celler som inneholder store kjerner ble telt i flere tilfeldig utvalgte felt. Den gjennomsnittlige andelen av slike celler i løpet av total celle nummer ble beregnet ut fra tre eksperimenter.
Tumor Transwell Invasion analysen
Svulsten Transwell Matrigel invasjonen analysen ble brukt til å overvåke tumor-endotel interaksjoner og cellemigrasjon. Denne analysen anvender et forenklet Boyden kammer lignende konstruksjon som består av to kammere adskilt av et filter belagt med Matrigel. A549 (1,0 × 10
6 celler /brønn) eller LLC (0,6 × 10
6 celler /brønn) ble suspendert i serumfritt medium og lagt til toppen av 24 brønners plater med 8 mikrometer basalmembran matrise belagt polykarbonat membran inserts (Bedford, MA, USA). 500 ul friskt medium ble tilsatt til den nederste kammer som kjemoterapi-lokkemiddel. For bestrålingssensibilisering studier ble begge kamre deretter behandlet med kjøretøy DMSO eller 300 nM PLA-695 i 45 minutter før IR med 4 Gy. Celler migrerte fra toppkammeret gjennom de belagte filterporene til bunnen av filteret. Etter 24 timer ble resterende celler i det øvre kammer av membran innsatsene fjernes ved hjelp av en våt bomullsdott. Cellene som holdes på den ytre overflate av innsatsen transwell membran som hadde invadert gjennom Matrigel ble fiksert med 100% metanol og farget. Celler som hadde invadert i 7-10 høy effekt felt (HPF) fra hver prøve ble tellet ved hjelp av Image Software J (NIH, Bethesda, MD), og det gjennomsnittlige antall celler som invaderte gjennom membranen pr HPF ble beregnet. Gjennomsnitt og standardavvik for hver behandlingsgruppe ble beregnet for hver gruppe.
signaltransduksjonsbane Analyse
Etter behandling ble HUVECs cellene høstet ved de angitte tider. Totalt protein ekstraksjon ble utført ved hjelp av M-PER reagens (Pierce, Rockford, IL, USA) som inneholder proteasehemmere og fosfatase hemmere II og III (Sigma, MO). Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved bruk av BCA-reagens (Pierce). Proteinekstrakter (40 ug) ble underkastet Western-Immunoblotanalyse ved anvendelse av antistoffer for påvisning av fosfo-Akt (Thr308 /Ser473), fosfo-ERK1 /2, (Thr202 /Tyr204), total Akt, og total ERK1 /2 (alle fra Cell Melde Technologies.
Danvers, MA, USA). Antistoff mot aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble anvendt for å evaluere protein lasting i hvert kjørefelt. Immunoblotter ble utviklet ved hjelp av Western Lightning Chemiluminescence Plus deteksjonssystem (PerkinElmer, Wellesley, MA, USA) i henhold til produsentens protokoll
Cell Migration
HUVEC og bEND3 celler ble dyrket til 70%. – 80% konfluens i 60 mm plater. Tre parallelle sår ble opprettet på hver plate ved å skrape cellen monolayer med en 200-mL pipette, og grensene for sårene var merket. Celler ble behandlet i en time med vehikkel (DMSO) eller 300 nM PLA-695, etterfulgt av 3 Gy IR. Etter 24 timer ble cellene fotografert, og cellene funnet på innsiden og utsiden av såret grensene ble talt fra seks HPFS per prøve. Celler som spredte grensene ble klassifisert som ikke-migrerte celler. Celletettheten i såret er presentert som en prosentandel av totalt celletetthet i platen. Resultatene er fra tredoble prøver i tre uavhengige skrape analyser.
tumorvekst Delay
Den institusjonelle Animal Care og bruk Committee of Washington University i St. Louis spesielt godkjent denne studien. LLC (10
6) eller A549 (10
6) celler ble implantert i den høyre fotpute C57 /BL6 mus. Når alle svulstene ble målt med plethysomography, som bestemt ved volumet av tumorbærende fotbladet minus volumet av fotputen kontralaterale, mus var serpentin sortert i grupper på seks til syv dyr, som representerer tilsvarende fordelinger av tumorstørrelser (område = 40-70 mm
3). Tumor-bærende mus ble injisert intraperitonealt med bærer (DMSO) eller PLA-695 ved 7,5 mg pr kg kroppsvekt en gang daglig i fem påfølgende dager. Tretti minutter etter medikament-injeksjon ble musene bedøvd med isofluran, og plassert i Pantak irradiator og bestråles med 2 Gy daglig i fem påfølgende dager, for en total av 10 Gy. Bly blokker (10 mm tykk) ble brukt for å skjerme hodet, thorax og buk. Tumorstørrelse ble overvåket på langs med plethysmography. Mus ble ofret av CO
2 kvelning gang svulster nådd et volum på ca 700 mm
3 eller når sårdannelse ble klart på fotbladet per Animal Care retningslinjer.
In vivo Angiogenese Assay Dorsal Skin-fold kammeret Model
implantering teknikk av den dorsale hud-fold kammer modellen har blitt tidligere beskrevet [27]. I korthet diffusjon kammere inneholdende LLC celler (1 x 10
6 celler pr kammer) ble satt inn i dorsal luftsekken gjort ved å lage et innsnitt overfladisk horisontalt langs kanten av dorsal luftsekken. Huden ble nøye sydd etter å plassere kamrene under mus huden. Musene behandlinger ble utført 5 til 7 dager etter kirurgisk innsetting av diffusjon kamrene. Huden fold som dekker kamrene ble forsiktig fjernet etter euthanizing musene og fotografert i henhold til synlig lys. Antallet tumorinduserte blodkar ble tellet i ti forskjellige felter inne i kammeret i området av luftsekken fascia.
Histologisk analyse av tumorvaskulatur
tumorbærende mus ble avlivet 24 timer etter siste behandling og svulstene ble resected, fast i formalin, innstøpt i parafin og seksjonert. Seksjoner (5 um tykke) ble behandlet med 20 ug /ml proteinase K i 30 minutter ved romtemperatur og deretter ble inkubert over natten med et kanin polyklonalt antistoff mot human von Willebrand-faktor (vWF) (1:100 fortynning; Dako, Carpinteria, CA ). Vevssnitt ble deretter inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert geit-anti-kanin-IgG (1:500 fortynning; Invitrogen Molecular Probes) i 1 time ved romtemperatur. Alexa Fluor 488-farget fartøyer ble telt i tre tilfeldig valgte HPFS på hver av tre deler per svulst. Vaskulariteten ble bestemt som gjennomsnittlig antall farget fartøy per HPF. Tumor vaskulær Tverrsnittsarealet ble bestemt på samme måte, ved bruk av NIH Image software J, der er omsluttet av fartøyer område ble dividert med totalt areal av HPF for å bestemme prosent vaskulært område.
Statistical Analysis
middelverdien og standardavvik av gjennomsnittet (SEM) fra hver behandlingsgruppe ble beregnet for alle forsøk. Antall prøver er angitt i beskrivelsen av hvert eksperiment. Studenter T-test ble bruk til å sammenligne to behandlingsgruppene. Analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å sammenligne behandling effektivitet i tumorvekstforsinkelse studier. En
p-
verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekt av PLA-695 på Pro-overlevelse Signa etter Radiation
aktivering av ERK og Akt forekommer raskt etter bestråling i HUVEC-celler (Fig. 1). Behandling med PLA-695 demper IR-indusert ERK-fosforylering i en doseavhengig måte (fig. 1 A). ERK-aktivering er redusert til baseline (simulert-behandlede celler) ved 300 nm PLA-695. Ved høyere konsentrasjoner, (600 Nm), nivåene av ERK-fosforylering faller under baseline nivå. IR-induserte fosforylering Akt ble også opphevet når HUVEC-celler ble behandlet med 300 nM av PLA-695 (fig. 1 B). Vi fant lignende resultater i 3B11 celler behandlet med 300 nM PLA-695 (fig. 1 C og D).
HUVEC-celler (A) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PLA-695 som vist i 45 min før behandlingen med 3 Gy, ble cellene lysert ved 5 min etter IR. HUVEC (B) og 3B11 (C 0,001, 6 Gy P 0,001, 8 Gy P = 0,012) og A549 celler (2 Gy P = 0,163, 4 Gy P 0,001, 6 Gy P 0.001, 8 Gy P = 0,031) sammenlignet med celler behandlet med strålebehandling alene (figur 2B).. Dose enhancement Faktorer ble beregnet til 10% celleoverlevelse ved å dividere den dose av stråling fra strålings eneste overlevelseskurve med den tilsvarende dose fra PLA-695 pluss strålingskurve. Dose forsterkning faktorer var 1,17 for LLC-celler, 1,28 til A549-celler (fig. 2B).
LLC og A549-celler ble dyrket uavhengig av hverandre (A) eller som ko-kulturer (B) med bEND3 og HUVEC-cellene og ble behandlet med DMSO eller 300 nM PLA-695 i serumfritt medium i 45 min før IR. Cellene ble deretter bestrålt med 0, 2, 4, 6 og 8 Gy og belagt for klonogene overlevelsesanalyse. Etter 7-10 dager ble cellene farget med 1% metylenblått og kolonier bestående av 50 celler ble talt ved mikroskopi. Overlevende kolonier ble normalisert for plating effektivitet. Vist er gjennomsnittlig overlevelse fraksjoner og SEM.
PLA-695 Reduserer spredning i endotelceller og lungekreft celler etter bestråling
For å belyse hvilken rolle CPLA
2 i både endothelial celler og lungekreft celler, undersøkte vi hvordan PLA-695 påvirker spredning i LLC, A549, bEND3 og HUVEC celler (fig. 3A). Like mange LLC, A549, bEND3 og HUVEC-celler ble sådd i en 96-brønners plate. Den følgende dag ble cellene behandlet med 300 nM av PLA-695 i 45 minutter før IR. Platene ble avlest ved 24, 48, 72, eller 96 h ved hjelp av kolorimetrisk analyse celleproliferasjon ved å måle absorbansen ved 490 nm. bEND3 celler behandlet med PLA-695 alene viste en signifikant reduksjon i celleformering i forhold til DMSO ved 24 timer (P 0,001), 48 h (P = 0,002) og 96 h (P 0,001) og etter 72 h (P = 0,047). bEND3 celler behandlet med kombinasjonsbehandling av PLA-695 med IR viste en signifikant reduksjon i celleformering i forhold til IR alene etter 72 h (P = 0,001) og 96 h (P = 0,002) og redusert spredning på 24 timer (p = 1,0) og 48 h (P = 0,023). HUVEC-celler behandlet med PLA-695 alene viste en signifikant reduksjon i celleformering i forhold til DMSO ved 24 timer (p = 0,003), 48 h (P = 0,016), 72 timer (p = 0,013), og 96 h (P 0,001). HUVEC-celler behandlet med kombinasjonsbehandling av PLA-695 med IR viste en signifikant reduksjon i celleformering i forhold til IR alene ved 24 timer (p = 0,004) 72 h (P = 0,002) og 96 h (P 0,001). LLC celler behandlet med PLA-695 alene viste reduksjon i celleformering i forhold til DMSO ved 24 timer (p = 0,076), 48 h (P = 0,017), 72 h (P = 0,028) og 96 h (P = 0,175). LLC celler ble behandlet med kombinasjonsbehandling av PLA-695 med IR viste en signifikant reduksjon i celleformering i forhold til IR alene ved 24 timer (p = 0,001), 48 h (P = 0,010), 72 h (P 0,001) og 96 h (P 0,001). A549-celler behandlet med PLA-695 alene viste en reduksjon i celleformering i forhold til DMSO ved 24 timer (p = 0,017), 48 h (P = 0,008), 72 h (P = 0,070) og 96 h (P = 0,079). A549-celler ble behandlet med en kombinasjonsbehandling av PLA-695 med IR viste signifikant reduksjon i celleformering i forhold til IR alene etter 72 h (P = 0,003) og 96 h (P = 0,003).
likt antall bEND3 , HUVEC, LLC og A549 celler ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med 300 nM PLA-695 i 45 minutter før behandling med 3 Gy. Celleformering ble bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk analyse celleproliferasjon ved 24, 48, 72 og 96 timer etter behandling. Vist er absorbansen ved 490 nm. B. PLA-695 forbedrer celledød i bestrålte lungekreftceller. LLC og A549-celler ble behandlet med 300 nM PLA-695 eller DMSO i 45 minutter før behandling med 3 Gy. Celler ble farget med Annexin V-APC og propidiumjodid og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved 24, 48, 72 eller 96 timer etter bestråling. Vist er de linje grafer som viser dobling av celledød over kontrollen for hver behandling med SEM fra tre eksperimenter.
PLA-695 Forbedrer celledød i Bestrålet lungekreft celler
CPLA
2 har blitt vist å aktivere signalisering gjennom de Ras /Raf /ERK-reaksjonsveien [10], [28]. Aktivering av fosfolipase A2 er også blitt angitt å være årsaken til forsinket celledød indusert av H
2o
2 [29]. Vi studerte celledød i LLC og A549 ved farging for Annexin V og, PI ved hjelp av flow cytometri ved 24, 48, 72 og 96 timer etter IR (Fig. 3B). PLA-695 behandling av LLC celler fremkalte ikke noen betydelig celledød i det hele tatt av de testede tidspunkter. A549-celler behandlet med PLA-695 viste en svak økning i celledød med tiden. IR alene induserte en grad av celledød i både LLC og A549-celler som var lik på alle de tidspunkter som ble testet (24, 48, 72 og 96 h). Kombinert behandling med PLA-695 og IR induserte ikke økt celledød i forhold til IR alene på 24 timer i begge LLC celler (P = 0,831) og A549 celler (P = 0,192). Ved 48 timer ble kombinert behandling viste moderat celledød i LLC-celler (P = 0,100) og signifikant celledød i A549-celler (P 0,001). På 72 timer og 96 timer, den kombinerte behandlingen viste betydelig celledød i begge LLC celler (P 0,001) og A549 celler (P 0,001).
Vi har evaluert ved atom morfologi bestrålte celler ved hjelp av DAPI-farging (fig. 4); resultatene var tilsvarende vurdering gjort av Annexin V /propidiumjodidfarging. Ved 96 timer etter bestråling, den kombinerte behandling med PLA-695 og IR resulterte i signifikant mer multinucleate-celler og celler med forstørrede kjerner (karakteristiske mitotisk katastrofe) i både LLC celler og A549-celler (P 0,006), sammenlignet med IR alene ( LLC, P = 0,001; A549, P = 0,006) og PLA695 alene (LLC, P = 0,001;. A549, P = 0,002)
LLC og A549-celler ble dyrket i kammers objektglass ble behandlet med 300 nM PLA -695 eller DMSO i 45 min før bestråling med 3 Gy. Celler ble fikset 96 h senere og farget med 4 «, 6-diamidino-to-phenyllindole (DAPI). Vist er de mikrografer av DAPI flekker celler, piler indikerer multinucleate celler og kjempeceller. Multinucleated og kjempeceller ble telt i fem tilfeldig utvalgte felt. Et søylediagram som viser gjennomsnittlig prosent av multinucleate /kjempeceller for hver behandling er vist.
PLA-695 Reduserer endotelcelle Migration etter Radiation
Vi utførte Gash nedleggelse analyser med HUVEC og bEND3 celler for å bestemme virkningen av PLA-695 (fig. 5). I denne analysen ble en sår laget i cellekulturen (grunnlinje) og cellene ble behandlet med vehikkel (DMSO), kjøretøy og 3 Gy (DMSO + IR), PLA-695 (300 nM), eller en kombinasjon av PLA-695 og 3 Gy (PLA-695 + IR). Cellemigrering ble beregnet ved å telle antallet celler som beveger seg inn i såret (fig. 5). Vi fant at 24 timer etter behandling, flenge var nesten fullstendig dekket av HUVEC og bEND3 kulturer behandlet med DMSO. Bestråling alene førte til en reduksjon i migrasjon i HUVEC (82%) og bEND3 (77%) celler. Tilsvarende reduksjon ble observert i celler behandlet med PLA-695 alene både HUVEC (74%) og bEND3 (62%). Kombinasjonen av PLA-695 og IR førte til en betydelig reduksjon i migrasjon av HUVEC (61%; p = 0,003) og bEND3 (48%; p = 0,012) celler når sammenlignet med IR alene (Fig. 5)
HUVEC og bEND3 celler ble sådd ut på 60 mm plater og fikk vokse til 80% sammenflytning. Den semi-konfluente cellelaget ble skrapet ved anvendelse av en 200 ul steril pipette for å lage en ripe /sår fri for celler. De gjenværende celler ble behandlet med bærerkontrollgruppen, eller 300 nM PLA-695 i 45 min før IR med 3 Gy. Migrasjon ble vurdert til 24 timer etter behandling. Antall celler migrerte i grunnen /såret ble talt og normalisert til omkringliggende celletetthet per HPF. Vist er representative mikrofotografier og søylediagram som representerer gjennomsnitts prosenter av trekk celler i forhold til tilsvarende kontroller med SEM fra tre eksperimenter.
PLA-695 Reduserer Tumor Cell Invasion etter Radiation
CPLA
2 har vært implisert i cellemigrering, tubuli formasjon [26] og invasjon [30]. Vi undersøkte effekten av PLA-695 på tumorcelle invasjon i LLC og A549-cellelinjer ved hjelp av transwell-invasjonen analyser. I LLC, observerte vi en 24% reduksjon i celle invasjon når cellene ble bestrålt med 4 Gy; imidlertid forbehandling med 300 nM PLA-695 før IR resulterte i en 56% ytterligere reduksjon i celle invasjon (P = 0,003, fig. 6). Behandling av LLC celler med PLA-695 alene viste en 63% reduksjon av invasjon sammenlignet med kontroll. Tilsvarende i A549-celler, stråling alene forårsaket en 30% reduksjon av invasjon, mens forbehandling med 300 nM PLA-695 før IR redusert invasjon ytterligere med 37% (P 0,001 Fig. 6) .Treatment av A549-celler med PLA-695 alene ga en 58% reduksjon av invasjon sammenlignet med kontrollen.
LLC og A549-celler ble tilsatt til 8 mikron innsatsene og ble behandlet med 300 nM PLA-695 eller DMSO i 45 minutter før 3 Gy bestråling. Celler ble tillatt å invadere /migrere fra toppkammeret gjennom de belagte filterporene til den komplette medium ved bunnen av innsatsene i 48 time. Celler ble deretter fiksert, farget og celler som invaderte gjennom membranen ble beregnet ved å telle antall celler pr HPF. Vist er representative mikrofotografier og et søylediagram som representerer antall invasive celler med SEM; * P . 0,05
PLA-695 Radiosensitizes Svulster i dyremodeller av NSCLC
For å fastslå effekten av PLA-695 som en radiosesitizer i NSCLC, brukte vi heterotop LLC og A549 tumormodeller dyrket i C57 og nakne mus, respektivt. Når LLC og A549 svulster var følbar (område = 40-70 mm
3), ble musene behandlet i fem påfølgende dager med DMSO (kjøretøy), bestråling (IR) alene (10 Gy total, 5 fraksjoner av 2 Gy ), PLA-695 alene (7,5 mg /kg /dag, intraperitoneal), eller en kombinasjon av PLA-695 og IR. Etterfølgende tumorvekst ble overvåket ved hjelp av en Plethysmometer. Vi analyserte tumorvekstforsinkelse i disse eksperimentene på to måter. Først til tiden for tumorvolum når en størrelse på 0,25 cm
3 ble bestemt. For det andre, analyserte vi tumorvolum på dag 7 for LLC svulster og dag 15 for A549 tumorer (Fig. 7). Den LLC svulster vokser mye raskere enn A549 svulster. Ubehandlede tumorer og IR-behandlede tumorer tok 7 dager for å nå en tumorvolum på 0,25 cm
3, mens PLA-695 behandlede tumorer tok 7,5 dager. Tumorer som ble behandlet med en kombinasjon av PLA-695 og IR tok 9,5 dager for å nå et volum på 0,25 cm
3. På dag 7 tumorene behandlet med en kombinasjon av PLA-695 og IR var mindre (0,13 cm
3) sammenlignet med ubehandlede (0,27 cm
3; p = 0,019), IR alene (0,24 cm
3 ; P = 0,038) og PLA-695 alene (0,22 cm
3; P = 0.100)
LLC eller A549 celler ble implantert i høyre fotblad av C57 /BL6 mus.. Svulster ble bestrålt med 2 Gy i 5 påfølgende dager, for en total av 10 Gy. Mus ble behandlet med 7,5 mg /kg kroppsvekt eller bærerkontroll i 30 minutter før IR på dagene 1, 3, 5, 7 og 9 er middeltumorvolumer for LLC og A549 med SEM fra hver behandlingsgruppe av mus. Tumorvekstforsinkelse for LLC og A549-tumorer ble beregnet som antall dager for tumorer å nå 0. 25 cm
3 (B). Vist er et søylediagram som representerer den gjennomsnittlige tumorvekstforsinkelse med SEM fra hver behandlingsgruppe av 7 mus; * P 0,05. Tumorvolumer ble analysert på dag 7 for LLC svulster og dag 15 for A549 svulster. Vist er et stolpediagram som representerer tumorvekst på dag 7 for LLC tumorer og dag 15 for A549-tumorer med SEM fra hver behandlingsgruppe av 6 mus;
