Abstract
naturlig forekommende triterpenoid betulinsyre (BA) viser uttalt polypharmacology alt fra anti-inflammatorisk anti-lipogenic aktiviteter. Nylige bevis antyder at snarere diverse cellulære signalhendelser kan tilbakeføres til den samme felles oppstrøms bryteren i cellulær metabolisme. I denne studien undersøkte vi derfor de metabolske endringer indusert av BA (10 mm) administrasjon, med fokus på mobilglukosemetabolismen. Vi viser at BA løfter utbredelsen av mobilnettet glukoseopptak og aerob glykolyse i mus embryonale fibroblaster med samtidig reduksjon av glukose oksidasjon. Uten å fremlokkende tegn på åpenbar celledød BA fører til nedsatt mitokondriefunksjon, økt ekspresjon av mitokondrielle frakoblings proteiner (UCP) 1 og 2, og lever kinase B1 (LKB1) -avhengig aktivering AMP-aktivert proteinkinase. AMPK aktivering står for økt glukoseopptak og glykolyse som igjen er uunnværlig for cellenes levedyktighet på BA behandling. Samlet viser vi for første gang en betydelig innvirkning på BA på cellulære bioenergi som kan være en sentral formidler av de pleiotrope handlingene til BA
Citation. Heiss EH, Kramer MP, Atanasov AG, Beres H, Schachner D, Dirsch VM (2014) glycolytic bryter i Response til Betulinic Acid i ikke-kreftceller. PLoS ONE 9 (12): e115683. doi: 10,1371 /journal.pone.0115683
Redaktør: Mika Jekabsons, University of Mississippi, USA
mottatt: 18 juni 2014; Godkjent: 01.12.2014; Publisert: 22.12.2014
Copyright: © 2014 Heiss et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den østerrikske Science Fund (tilskudd nummer 23317) for å EHH Herzfelder «sche Familienstiftung til EHH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betulinic syre (3β-3-hydroksy-lup-20 (29) -en-28-syre; BA) er et naturlig forekommende penta triterpenoid med en mangeartet aktivitetsprofil. Flere studier avdekket blant annet anti-viral, anti-proliferative, pro-apoptotiske, anti-inflammatorisk, vasoprotective, så vel som anti-diabetiske og anti-lipogenic egenskaper for BA og dets derivater både
in vitro
og
in vivo product: [1] – [11]. I tråd med overflod av rapporterte bioaktivitet flere molekylære mål har vært foreslått inkludert nukleær faktor kB – [12], sterol regulatorisk element bindende protein – [7], og endotelial NO syntase pathway [5], mitokondrie permeabilitet overgangen pore (MPTP) [13], diacylglycerol-acyltransferase [14], den Tgr5 gallesyre-reseptor [6], lipaser [15] eller protein-tyrosin fosfatase-1B [16].
det har nylig blitt mer og mer verdsatt at den metabolske programmet er ikke en passiv bystander men en aktiv modulator av signaltransduksjon og fenotype av en celle [17]. En endring i den metabolske programmet kan påvirke samtidig flere og ved første øyekast ikke er relatert signalveier, f.eks ved å gi eller begrense sentrale underlag for anabolisme, cytobeskyttelse eller posttranslational modifikasjoner, og bli sett på som en sentral oppstrøms determinant av cellulær oppførsel [18].
hypoteser at noen av bioaktivitet utøves av BA er en konsekvens av endret bioenergi vi satt ut for å undersøke effekten av BA på glukosemetabolismen.
Materialer og metoder
celler, kjemikalier og antistoffer
Wild type (WT) og isogen AMPKα
1 – /- mus embryonale fibroblaster (MEF) og WT og LKB1 – /- MEF var snille gaver fra Benoit Viollet, INSERM Paris, Frankrike og Reuben Shaw, Scripps Institute, La Jolla, USA, rapportert i [19] og [20] hhv. Murine 3T3-L1, C2C12, RAW 264.7 celler var fra LGC /ATCC (Wesel, Tyskland). Primære humane endotelceller (HUVEC) var fra Lonza (Braine-L’Alleud, Belgia). Betulinic syre (99% renhet) ble kjøpt fra Biosolutions Halle GmbH (Halle, Tyskland). Tritium-merket 2-deoxyglucose (DOG) ble levert av NEN (Wien, Østerrike). Den CellTiterGlo, den CaspaseGlo- og CytoTox96 ikke-radioaktive cytotoksisitetsanalyser kom fra Promega (Mannheim, Tyskland). MitoTracker Grønn og MitoSox Red ble kjøpt fra Invitrogen (Wien, Østerrike). Spesielle cellekultur plater, kassetter, kalibreringsløsning samt glykolyse og mitokondriell stress test kits ble bestilt fra Seahorse biovitenskap. STO609 kom fra Calbiochem. Primære anti-AMPK (# 2532), anti-pAMPK (Thr172) (# 2535), anti-PACC (Ser79) (# 3661), anti-LKB1 (# 3047) anti-PDHE1 (# 2784), så vel som antistoffer rettet mot glykolytiske enzymer (glykolyse sampler kit) kom fra Cell Signaling Technology (Frankfurt am Main, Tyskland). Den anti-GLUT1 og GLUT3 antistoffer kom fra Millipore (Wien, Østerrike) (# CBL242; # AB1344), anti UCP1 eller 2 antistoffer ble bestilt fra Abcam (Cambridge, UK) (# 10983, 77363), anti-p -PDHE1 (Ser273) var fra Novus Biologicals (Cambridge, UK) (# NB11093479) og anti-aktin antistoff var fra mpbio (Eschwege, Tyskland) (# 69100). Sekundær pepperrotperoksidase (HRP) -koblet anti-kanin og anti-mus-antistoffer kom fra Cell Signaling Technology and mpbio, henholdsvis, og HRP-anti-geit-antistoff var fra Santa Cruz (Heidelberg, Tyskland). Alle andre kjemikalier var fra Sigma-Aldrich (Wien, Østerrike). Alle testforbindelser eller inhibitorer ble oppløst i DMSO, beskyttet mot lys så langt som mulig, alikvotert og lagret ved -20 ° C. For celleforsøk, ble den endelige konsentrasjonen av DMSO holdes konstant i alle prøvene og aldri oversteg 0,3% DMSO.
Dyrkning av celler
unntak av HUVEC-celler ble rutinemessig subcultivated i Dulbeccos modifiserte essensielle medium ( DMEM, 4,5 g /l glukose fra Lonza) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum (Invitrogen) og 2 mM glutamin (Lonza). HUVEC-celler ble dyrket i endotelial vekstmedium (EGM1) og supplerer levert av Lonza. For differensiering av 3T3-L1 celler til modne adipocytter og C2C12 myoblasts til myotubes standardprotokoller ble brukt som beskrevet andre steder [21], [22]. Celler ble rutinemessig undersøkt som mycoplasma-fri og holdt i kultur 11 passasjer (for primær HUVEC 5).
Bestemmelse av cellulært glukoseopptak hastighet
Bestemmelse av cellulært glukoseopptak hastigheten ble utført som tidligere beskrevet [23]. I korthet ble cellene fremstilt i 12-brønners plater. Etter behandling som angitt celler ble ekvilibrert i standard Krebs-Ringer-fosfat HEPES (KRPH) buffer inneholdende 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i 20 minutter. Den glukoseopptak ble initiert ved tilsetning av 2-DOG tilsatt 2-deoksy-D- (1H3) -glukose (sluttkonsentrasjon 0,1 mM, og 0,45 pCi /ml). Etter 15 minutter ble reaksjonen stoppet ved tre raske vaskinger med iskald PBS. Glukoseopptakshastigheten ble bestemt ved væske-scintillasjonstelling (Perkin Eimer, Brunn am Gebirge, Østerrike) av cellelysater (lysis av 0,05 N NaOH i PBS), normalisert til proteininnholdet bestemt ved Rotiquant ™ (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) proteinanalyse og opptak tid (for å oppnå inkorporert radioaktivitet pr mg protein og minutt), og korrigert for den ikke-transporter-mediert glukoseopptak (som ikke inhiberes ved ko-behandling med cytokalasin B (10 uM) under opptaks prosedyre). Oligomycin A (2 uM, 4 h) tjente som positiv kontroll for øket basal glukoseopptak.
vurdering av potensielle cytotoksisitet via bestemmelse av frigjort laktatdehydrogenase (LDH), ATP-nivåer, caspase spalting og biomasse
MEFs ble dyrket i 96-brønners plater (seeding tetthet 2,5 x 10
4 celler /brønn). Etter behandling som angitt bestemt vi utgivelsen av LDH (mål for membranintegritet), ATP nivåer (tiltak for celleviabilitet) og caspase cleavage (mål for apoptose induksjon) med CytoTox96 Non Radioactive Cvtotoksisitetsmålinq, den CellTiterGlo Lysende celleviabilitet analysen og CaspaseGlo 3/7 Selvlysende analysen, henholdsvis. Alle sett ble utført i henhold til de angitte protokollene. Biomasse ble farget ved å helle av medium og inkubering festede celler med krystallfiolett-oppløsning (0,5% (w /v) krystallfiolett /20% (v /v) MeOH) i 5-10 minutter. Etter grundige vasketrinn med vann fra springen (for å kvitte seg med overskuddsfarge) og tørking av bundet fargestoff ble oppløst med en alkoholisert citrate løsning (0,05 M citrat /50% (v /v) etanol) og kvantifisert ved avlesninger på 595 nm. Absorbans og luminescens ble overvåket på en Tecan (Grödig, Østerrike) Sunrise og GeniosPro plateleser, henholdsvis. Triton (1%), staurosporin (1 uM), eller en kombinasjon av oligomycin A (2 mm) og DOG (10 mM) tjente som positive kontroller for de respektive analysene.
Nuclear faktor E2 relatert faktor 2 ( Nrf2) -avhengig reporter gen analysen
Nrf2 avhengige reporter gen analysen var basert på luciferaseekspresjon utløst av den aktiverte antioksidant respons element (eR) av muse glutathione-
S
-transferase og utføres som tidligere beskrevet [24]. CDDO-IM, et syntetisk triterpenoid (100 nM), tjente som positiv kontroll og ble vennlig levert av Michael Sporn, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, Hanover, NH, USA.
ekstracellulær flux analyse for bestemmelse av glycolytic og luftkapasiteter
MEF ble sådd i passende kollagen-belagte 24-brønners cellekulturer plater (fra Seahorse biovitenskap, København, Danmark) celletetthet 2,7 × 10
4 celler /brønn). Etter behandling som angitt celler ble holdt i serumfritt medium (DMEM pluss 2 mM glutamin, 0 mM glukose, 0 (glykolyse stress test) eller to (mitokondriell stresstest) mM pyruvat, pH 7,35-7,40) ved 37 ° C og omgivelses CO
2 for en time før de ble utsatt for glykolyse (avlesning: ekstracellulære forsuring rate (ECAR) i mph /min) og mitokondrielle (avlesning: oksygenforbruk rate (OCR) i pmol O
2 /min) stresstester . Passende testsett kom fra Seahorse biovitenskap, ble utført i henhold til produsentens instruksjoner og analysert på en Seahorse 24XF
e ekstracellulære flux analysator og Wave programvare (www.seahorsebio.com). Optimalisert inhibitor konsentrasjoner for MEF var 2 mikrometer oligomycin A, 1,5 mikrometer carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), 1fiM rotenon A, 1fiM antimycin, og 100 mm 2-DOG. Normalisering til cellemasse ble rutinemessig utført av krystallfiolett farging etter analyse for å ta høyde for eventuelle forskjeller i celle nummer.
Fastsettelse av ekstracellulære laktat som markør for glykolyse
MEFs ble utarbeidet i 24-brønners plater. Etter behandling som angitt Cellene ble vasket med PBS og deretter inkubert med standard Krebs Ringer Fosfat HEPES (KRPH) buffer supplert med 0,2% BSA og 10 mM glukose i 2 timer. Deretter supernatanter ble analysert for deres laktatinnhold via en enzym-koblet fluorescens-analyse, og cellene ble lysert og deres proteininnhold ble bestemt. I korthet, en volum supernatant (vanligvis fortynnet 1:20) ble blandet med ett volum analysebuffer (KRP-buffer med 10 pM Amplex Red, 1 U /ml laktat-oksydase og 2,5 U /ml pepperrot-peroksydase), inkubert i 10 minutter og deretter lese i en flourimeter ved en eksitasjonsbølgelengde på 535 nm og emisjonsbølgelengde på 590 nm. Parallell overvåking av løsninger med kjente konsentrasjoner av laktat tilrettelagt en endelig avlesning av mol laktat /g protein * min.
Flow-cytometri bestemmelse av mitokondrie innhold og mitokondrie reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon
MEF ble dyrket i 12- eller 6- brønners plater (seeding tetthet 1,5 × 10
4 eller 3 × 10
4 celler per brønn) og behandles som angitt. For bestemmelse av de mitokondrielle innholds cellene ble farget med 50 nM MitoTracker Grønn (Invitrogen) i 20 minutter og deretter analysert i den grønne kanalen (FL1, ex 488 nm; em 530/30 nm) av FACS Calibur (BD Biosciences, Schwechat, Østerrike). Den vilkårlige gjennomsnittet av grønn fluorescens ble tatt som mål for den mitokondrielle innhold etter korreksjon for autofluorescens [25], [26]. Valinomycin fungerte som kontroll for potensial uavhengighet MitoTracker grønne signal. For bestemmelse av mitokondrienes ROS produksjonsceller ble inkubert med 5 uM MitoSox Rød (Invitrogen) i 10 min og deretter analysert med hensyn til deres autofluorescens-korrigert rød fluorescens (FL2 kanal, ex 488 nm; em 585/42 nm) i flowcytometer. Den vilkårlige gjennomsnittet av rød fluorescens ble tatt som avlesning for produsert mitokondrielle ROS. Antimycin A (2 mm) tjente som positiv kontroll i denne analysen.
Protein ekstraksjon, SDS-polyakrylamid-elektroforese og immunoblotanalyse
MEFs ble fremstilt i 6-brønns plater og behandles som angitt. Immunoblotanalyse inkludert proteinekstraksjon, gel løp, overføring, immundeteksjon og densitometrisk evaluering ble utført som beskrevet andre steder [23]. For påvisning av GLUT1 og 3 prøver ble ikke kokt før elektroforese for å forhindre aggregering og utfelling. For påvisning av proteiner av lik størrelse (f.eks fosforylerte formen versus totalt protein) to identiske membraner av de samme proteinekstrakter ble fremstilt og vurdert for å unngå mulige artefakter eller tvetydige signaler som skyldes ufullstendig stripping.
For statistiske analyser ble utført minst tre ganger (n≥3, uavhengige forsøk (biologiske replikat)). Søylediagram viser gjennomsnitts + SD. To grupper ble sammenlignet ved bruk av Student t test, ble flere grupper analysert ved hjelp av ett-eller to-veis ANOVA, avhengig av antall variable i de undersøkte datasett, etterfulgt av Dunnetts eller Bonferroni s post hoc test. Alle statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism. Forskjeller med p-verdier. 0,05 ble ansett som betydelig og er utpekt med *
Resultater
BA øker cellulær glukoseopptak
Først vurderte vi de cellulære glukoseopptak sats etter behandling med BA i forskjellige celletyper, inkludert primære, humane endotelceller (HUVEC), udødeliggjort murine makrofager (RAW264.7), differensiert mus myo (C2C12) – og adipocytter (3T3-L1) samt muse-embryonale fibroblaster (MEF). Vi konsekvent observert en øket basalglukoseopptak i alle celletyper med ca. 50 til 100% (figur 1A.) Med BA ved en konsentrasjon på 10 pM (kvasi-optimale konsentrasjon for alle cellelinjer som bestemt ved konsentrasjons-respons-forsøk; S1 fig.). Oligomycin A, en inhibitor av mitokondrial ATP-syntase, ble anvendt som positiv kontroll. Disse resultatene antydet en generell og celle-type uavhengig økning av glukose inkorporering av BA. Tilsetning av mettende konsentrasjoner av insulin til differensierte adipocytter og muskelceller, to store insulinfølsomme glukose avhende celletyper, har ført til en økt cellulær glukoseopptak på toppen av BA effekt (Fig. 1B) som peker til en insulin-uavhengig virkning av BA.
(A) Ulike celletyper (differensierte adipocytter (3T3-L1), differensierte myotubes (C2C12), endotelceller (HUVEC), makrofager (RAW264.7) og murine embryonale fibroblaster (MEF)) ble behandlet med 10 uM BA (+) eller 0,1% DMSO (-) i 16 timer før deres cellulært glukoseopptak hastighet ble bestemt som beskrevet. Oligomycin A (OL, 2 uM i 4 timer) tjente som positiv kontroll for øket basal glukoseopptak. Den søylediagram som viser glukoseopptak som står i forhold til middelverdien av den respektive DMSO-kontroll (n = 3 (dvs. tre uavhengige eksperimenter, hver i triplikat), * p 0,05 vs DMSO ctrl, ANOVA). (B) Differensierte adipocytter (til venstre) og muskelceller (til høyre) ble behandlet med BA (10 mm) for 16 timer før serum sult og insulin stimulering (15 min, 3T3-L1: 15 nM insulin, C2C12: 100 nM insulin). Deretter cellulært glukoseopptak ble bestemt. Søylediagram viser glukoseopptak priser i forhold til gjennomsnittet av de respektive unstimulated kjøretøykontroll. (N = 3 (det vil si tre uavhengige eksperimenter, hver i tre eksemplarer), gjennomsnittlig + SD; * p 0,05 vs unstimulated DMSO ctrl, ° p 0,05 vs insulinstimulert DMSO ctrl, to-veis ANOVA, Bonferroni). Oligomycin A (OL, to mikrometer for 4 h) tjente som positiv kontroll for økt basal glukoseopptak.
BA ikke induserer celledød i MEF
Som økt glukoseopptak kan tyde cellulært stress og cytotoksisitet, og BA er blitt vist å utøve pro-apoptotiske virkninger i forskjellige (kreft) celletyper, ved siden vi fastslått hvorvidt den observerte forhøyede glukoseopptaket er assosiert med påfølgende celledød. Vi behandlet MEF, celletypen som er valgt for alle videre studier, med 10 uM BA i 48 timer og bestemmes den relative frigivelse av laktat-dehydrogenase (LDH, forhold av ekstracellulær og total) som avlesning for celledød og membran oppløsning (figur 2A). aktivering av caspases som avlesning for apoptoseinduksjon (fig. 2B), ATP nivåer som tegn på generell celle levedyktighet (fig. 2C) og binding av krystallfiolett så enkelt biomasse flekken (fig. 2D). BA på 10 mikrometer og 30 mikrometer fremkalte ikke noen vesentlige endringer i forhold til DMSO-behandlede kontrollceller. Således er det observert økt glukoseopptak på BA eksponering usannsynlig på grunn av overhengende celledød. Videre BA ikke utløser aktivering av transkripsjonsfaktoren nukleær faktor E2 relatert faktor to (Nrf2) som vist i en Nrf2 avhengig reportergen analysen. Nrf2 aktivering er vel kjent som indikator for et cellulært stress reaksjon ved å utsettes for xenobiotika (S2 Fig.). Mangelen på toksisitet opp til konsentrasjoner av 30 mikrometer kan også bli bekreftet for endotelceller, adipocytter og muskelceller (S3 fig.) Og støtter den generelle oppfatningen av kreft-selektiv toksisitet av BA.
MEF ble behandlet med BA (10 uM og 30 uM) i 48 timer før de ble utsatt for bestemmelse av membranintegritet (% LDH-frigivelse) (A), potensial på proapoptotiske hendelser (aktivering av kaspase 3/7) (B), av ATP nivåer (C ) og biomasse (D). Stolpediagrammene viser sammenstillingen av tre uavhengige eksperimenter (uttrykt som fold av DMSO betyr verdien i B, C og D), som hver i fire (gjennomsnitt + SD, * p 0,05, ANOVA, Dunnetts stolpe test versus DMSO ctrl). Staurosporin (Stauro, 1 pM i 6 timer), triton (1% i 1 h) eller en kombinasjon av oligomycin A (OL, 2 uM) og DOG (10 mM; 5 h) tjente som positive kontroller i assayene
BA løfter aerob glykolyse
Neste vi var interessert i den metabolske skjebne inge glukose. Den glycolytic hastigheten ble undersøkt ved hjelp av ekstracellulære flux analyse. Vi observerte at BA-behandlede celler viste en signifikant høyere ekstracellulær surgjøring frekvens (ECAR) ved tilsetning av glukose enn de bærer-behandlede motparter (fig. 3A og B). I en utfyllende analyse bestemme ekstracellulære laktatnivåer konsekvent overvåket vi forhøyet laktat produksjon av BA-behandlede celler (S4 fig.). Disse funnene indikerer en høyere glycolytic rente i BA-behandlede celler og utelukket en påvirkning av en antatt membran V-ATPase til den observerte forsuring. Den maksimale glycolytic kapasitet (ECAR etter oligomycin addisjon og hemming av mitokondriell ATP produksjon) er sammenlignbar mellom DMSO og BA-behandlede celler. Derfor BA-behandlede celler har en betydelig redusert glycolytic reservekapasitet (ΔECAR
maximal- ECAR
basal) (Fig. 3B). Disse data viser at BA driver cellene mot full utnyttelse av deres glykolytisk potensial i disfavør av glukoseoksidasjon (Fig. 3C). En observert økt fosforylering av pyruvat dehydrogenase E1 (PDHE1) videre antydet en glycolytic bryter på BA behandling. Fosforylering gjengir PDHE1 mindre aktiv og griper med oksydativ dekarboksylering av pyruvat til acetyl-CoA som favoriserer pyruvat til laktat reduksjon (fig. 3D). Imidlertid vil videre eksperimenter være nødvendig for å utvetydig vurdere i hvilken grad PDHE fosforylering bidrar nesten maksimal glykolyse i BA-behandlede celler. Ekspresjonsnivået av flere undersøkte glykolytiske enzymer ble ikke endret (S5 fig.), Som imidlertid ikke utelukker en endret enzymatisk aktivitet som følge av kovalente eller allosterisk modifikasjon. Ekspresjonen av glukosetransportør GLUT1 var forhøyet på BA behandling i 16 timer, mens nivåene av GLUT3 ikke ble forandret (fig. 3E). GLUT2 /4 var ikke detekterbare i vårt MEF.
MEF ble behandlet med 10 uM BA eller DMSO (0,1%) i 16 timer før de ble utsatt for en glykolyse stresstest som beskrevet under «Materialer og metoder». I (A) det ekstracellulære surgjøring rate (ECAR) er vist ved å utsette cellene suksessivt til glukose (10 mM), oligomycin A (2 mm) og deoksyglukose (DOG, 100 mM) (gjennomsnitt + SD; kompilert rådata fra tre uavhengige eksperimenter med fire tekniske replikater hver). I (B) de data er analysert i forhold til basal (glycolytic ECAR etter glukose tillegg), maksimal (glycolytic ECAR etter oligomycin) og reservedeler (maksimal minus basal aktivitet) glycolytic aktivitet (gjennomsnitt + SD, * p 0,05, t-test , DMSO vs. BA). Kvantitering er basert på verdien på det endelige tidspunktet for hver behandling tilstand. I (C) verdier av OCR og ECAR (DMSO og BA-behandlede celler (16 h)) etter tilsetningen av glukose ble plottet mot hverandre for å visualisere skifte fra glukoseoksidasjon til glykolyse. Den observerte skift ved tilsetning av oligomycin A tilsettes til plottet som en referanse. (D) MEF ble behandlet med DMSO (0,1%, D) og 10 uM BA for de angitte tidsperioder før de totale cellelysatene ble underkastet immunblot analyser for pPDHE1 (Ser273) og total PDHE1 (molekylvekt 43 kDa). Representative blots av tre eksperimenter er vist. Diagrammet nedenfor ser samlet densitometriske verdier av pPDHE /PDHE (n = 3, middelverdi + SD; * p 0,05, t-test; DMSO vs BA ved hvert tidspunkt). (E) MEF ble behandlet med 10 uM BA eller DMSO (0,1%) i 16 timer før de ble utsatt for immunoblotanalyse for GLUT1 (-50 kDa), GLUT3 (~55 kDa) og aktin (42 kDa). Representative blots av tre uavhengige eksperimenter er vist. Diagrammet nedenfor ser samlet densitometriske verdier av GLUT1 /aktin og GLUT3 /aktin, henholdsvis (n = 3, middelverdi + SD; * p 0,05, t-test; DMSO vs BA ved hvert tidspunkt)
.
BA svekker mitokondrienes funksjon
Som økt aerob glykolyse kan kompensere for et svekket ATP produksjon av oksidativ fosforylering vi neste undersøkt mitokondrienes funksjon etter BA behandling. Vi observerte økt produksjon av mitokondrie ROS (fig. 4A) og forhøyet uttrykk for frakobling proteiner UCP1 og UCP2 i BA-behandlet MEF (Fig. 4B). Det totale mitokondrielle innhold forble upåvirket (fig. 4C). Endret mitokondrienes funksjon ble bekreftet i en mitokondrie stresstest og ekstracellulære flux analyse. Celler vist en noe redusert basal oksygenforbruk rate (OCR), redusert kobling av oksygenforbruk til mitokondrie ATP produksjon (Δ (OCR
basal-OCR
oligomycin), redusert maksimal respirasjon (OCR etter spredning av proton gradient ved FCCP), en redusert respiratorisk ledig kapasitet (Δ (OCR
maksimal-OCR
basal)), så vel som en øket proton lekkasje (Δ (OCR
oligomycin – OCR
A + R) ) når de behandles med BA i 16 timer (fig. 4E og F). Disse data indikerer at behandling med BA forstyrrer mitokondriefunksjon, imidlertid, mildt som uten reduksjon i celleviabilitet utløses av BA (se fig. 2). Tidsforløp forsøkene viste at frakoplet respirasjon (tydelig i reduksjon av OCR anvendes for ATP produksjon i S6a fig.) korreleres med tidsavhengig induksjon av UCPs (S6B fig.). imidlertid er problemene enten UCP induksjon står for den observerte frakopling eller hvorvidt BA selv som ganske hydrofob molekyl med en pKa-verdi på 5,5 er en svak uncoupler trenger videre etterforskning. Spesielt, ved korte inkuberinger med BA (1-3 h) basal OCR en tendens til å økes i forhold til DMSO-kontrollceller som forventet for ukoblet mitokondriell respirasjon (S6a fig.). Den senere reduksjon av OCR sett i BA-behandlede celler kan skyldes fortsatt unnvikende adaptiv eller tilleggsmekanismer utløses av den triterpenoid slik som spredning av mitokondriemembranen potensiale over tid, eller et svekket elektronstrøm gjennom respirasjonskjeden.
(A) MEF ble behandlet med 10 uM BA eller 0,1% DMSO i 16 timer før de ble utsatt for flowcytometrisk analyse av den mitokondrielle ROS produksjon med bruk av MitoSox røde og antimycin A (2 uM, 1 h) som positiv kontroll . (N = 3 (hver i to eller tre eksemplarer), gjennomsnittlig + SD, * p 0,05, t-test). (B) MEF ble behandlet med DMSO eller 10 uM BA i 16 timer før de totale cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse for UCP1, UCP2 (bånd ved ~25-35 kDa) og aktin (42 kDa) som lasting kontroll. Representative blot av tre uavhengige eksperimenter er vist. Grafen nedenfor skildrer utarbeidet densitometriske verdier av UCP1 /aktin og UCP2 /aktin, henholdsvis (n = 3; middel + SD; * p 0,05; t-test; DMSO vs BA). (C) MEF ble behandlet med 10 uM BA eller 0,1% DMSO i 16 timer før de ble utsatt for flowcytometrisk analyse av mitokondriell innhold ved hjelp av MitoTracker Green. Valinomycin (200 nM, 16 timer), en kjent disruptor av mitokondriemembranen potensialet tjente som kontroll for den potensielle-uavhengige signal fra MitoTracker Green. MEF ble behandlet med 10 uM BA eller DMSO (0,1%) i 16 timer før de ble utsatt for en mitokondriell stresstest som beskrevet i Materials. I (D) midlere oksygenforbruk rate (OCR) av tre uavhengige eksperimenter er avbildet på utsette cellene suksessivt til oligomycin (2 mm), FCCP (1,5 mm) og antimycin A + rotenon (A + R; 1 + 1 mm). I (E) de data er analysert i forhold til oksygenforbruk kurs under basale forhold, oksygenforbruk for ATP syntese, maksimal lufthastighet, ekstra luftkapasitet og proton lekkasje (gjennomsnitt + SD, * p 0,05, t-test, DMSO vs . BA).
BA aktiverer AMP-aktivert protein kinase (AMPK)
Redusert mitokondrienes funksjon har vært knyttet til aktivering av AMPK (anmeldt i [27]), en sentral metabolsk mester hub. AMPK aktivering kan dessuten forklare en kompensatorisk økt glukoseopptak og glycolytic hastighet [28], [29]. Vi har derfor undersøkt om BA fører til aktivert AMPK. Ved hjelp av immunoblot analyse vi observert en forbigående økning av AMPK fosforylering ved treonin 172, en indikasjon på forhøyet AMPK aktivitet, i BA-behandlede versus kontrollceller (Fig. 5A). AMPK aktivering ble ytterligere bekreftet av økt fosforylering av acetyl-CoA karboksylase (ACC) på serin 79, en felles nedstrøms mål av AMPK. Bruken av isogene WT MEF og AMPK knockout motstykker viste at økt glukoseopptak, økt ekspresjon av glukosetransportør GLUT1 og forhøyet glukosemetabolisme via glykolyse var avhengig av tilstedeværelse av AMPK (fig. 5B, C, D). Imidlertid BA induseres en tilsvarende reduksjon av mitokondriefunksjon (for eksempel reduksjon av maksimal åndedrett med omtrent 40% i forhold til DMSO-kontroll) i både WT og AMPK – /- MEF. Dette funnet er lagt mitokondriell dysfunksjon oppstrøms for AMPK-aktivering (fig. 5E) er i linje med den observerte aktivering av AMPK, induksjon av GLUT1, en forhøyet glukoseopptak og en øket glykolytisk hastighet ved svak FCCP pålagte frakopling (S7 fig.). Av notatet, AMPK – /- celler viste en generelt lavere oksygenforbruk rente enn WT MEF sannsynligvis delvis på grunn av deres redusert antall mitokondrier (S8 fig.). Sammenligning WT og celler som mangler i leveren kinase B1 (LKB1), den AMPK kinase lydhør overfor en endret AMP /ATP-forhold [30], foreslo LKB1 som den viktigste AMPK kinase involvert: LKB1 – /- celler som vises redusert AMPK fosforylering i på BA behandling (fig. 5F).
(A) MEF ble behandlet med DMSO (0,1%) eller BA (10 uM) for de angitte tidsperioder. Totalt cellelysater ble utsatt for immunoblot analyse for pAMPK (Thr172) og total AMPK (60 kDa) (venstre panel) eller pAMPK (Thr172), PACC (Ser79) (~245 kDa) og aktin (42 kDa) (høyre panel). Representative blots av tre uavhengige eksperimenter er vist. Grafene nedenfor viser bilder satt sammen densitometriske verdier av pAMPK /AMPK eller PACC /aktin, henholdsvis (n = 3, middelverdi + SD; * p 0,05, t-test; DMSO vs BA ved hvert tidspunkt). WT og AMPK – /- MEF ble behandlet med DMSO eller BA (10 uM) i 16 timer. Da de cellulære glukoseopptak priser (B) ble vurdert (n = 3 (i tre eksemplarer), gjennomsnittlig + SD, * p 0,05, ANOVA, Dunnetts post-test vs DMSO ctrl), samt uttrykket nivåer av GLUT1 (50 kDa), AMPK (60 kDa) og aktin (42 kDa) ved western blot analyse (C). En representant blot er vist av tre uavhengige eksperimenter. Grafen nedenfor skildrer utarbeidet densitometriske verdier av GLUT1 /aktin, henholdsvis (n = 3; middel + SD; * p 0,05; t-test; DMSO vs BA). I (D) celler ble underkastet bestemmelse av ekstracellulær surgjøring rate (ECAR) som beskrevet i fig. 3. Representative resultatene av tre uavhengige forsøk (med tre tekniske replikater hver) vises (gjennomsnitt + SD, * p 0,05, t-test). (E) WT og AMPK – /- MEF ble behandlet med DMSO (0,1%) eller BA (10 uM) i 16 timer før de ble utsatt for en mitokondriell stress test og ekstracellulære fluks analyse. Kompilerte data fra tre uavhengige eksperimenter blir vist (middel + SD). (F) WT og LKB1 – /- MEF ble behandlet med BA (10 uM) for de angitte tidsperioder før de totale cellelysatene ble underkastet immunoblotanalyse for pAMPK (Thr172), AMPK (60 kDa), LKB1 (~ 50 kDa ) og aktin (42 kDa). Representative blots av tre uavhengige eksperimenter er vist. Grafen nedenfor skildrer utarbeidet densitometriske verdier av pAMPK /AMPK, henholdsvis (n = 3, midlere + SD; * p 0,05, ANOVA, Dunnett (vs 0 h behandling med BA)
Disse data. viste at BA lett nedsatt mitokondriefunksjon, utløses AMPK aktivering via LKB1 som igjen fremkalte økt glukoseinntaket og skiftet mobilglukosemetabolismen mot oksidering til aerob glykolyse.
BA gjør cellene er avhengige av glukose
Fascinert ved det funn at BA driver cellene inn i forbedret glykolytiske aktivitet vi neste testet om BA gjengitt celler glukoseverdiene avhengig. for dette vurderes cellenes levedyktighet (ATP-nivåer, biomasse) i MEF behandlet med bærer eller BA i fravær og nærvær av glukose i 48 timer
