Abstract
microtubule-forstyrrende legemidler hemmer lysosomale menneskehandel og indusere lysosomal membran permeabilization fulgt av cathepsin-avhengig celledød. For å identifisere spesifikke menneskehandel relaterte proteiner som styrer celleoverlevelse og lysosomal stabilitet, vi skjermet en molekylær motor siRNA bibliotek i menneskelig MCF7 brystkreftceller. Sirnas rettet mot fire kinesins (KIF11 /EG5, KIF20A, KIF21A, KIF25), myosin 1G (MYO1G), myosin tung kjede 1 (MYH1) og tropomyosin 2 (TPM2) ble identifisert som effektive indusere av ikke-apoptotisk celledød. Den celledød indusert av KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 eller TPM2 sirnas ble innledet av lysosomal membran permeabilization, og alle identifiserte sirnas indusert flere endringer i endo-lysosomale,
dvs.
økt lysosomal volum (KIF11, KIF20A , KIF25, MYO1G, MYH1), økt cystein cathepsin aktivitet (KIF20A, KIF25), endret lysosomal lokalisering (KIF25, MYH1, TPM2), økt dekstran akkumulering (KIF20A), eller redusert autophagic fluks (MYO1G, MYH1). Viktigere, alle syv sirnas også drept menneske cervix cancer (HeLa) og osteosarkom (U-2-OS) celler og sensitive kreftceller til andre lysosome-destabiliserende behandlinger,
dvs.
fotooksidasjon, siramesine, etoposid eller cisplatin . I likhet med KIF11 siRNA, til KIF11 inhibitor monastrol indusert lysosomale membran permeabilization og sensitive flere kreftcellelinjer siramesine. Mens KIF11 hemmere er under klinisk utvikling som mitotiske blokkere, våre data indikerer en ny funksjon for KIF11 kontrollere lysosomal stabilitet og innføre seks andre molekylære motorer som mulige kreft narkotika mål
Citation. Groth-Pedersen L, Aits S , Corcelle-Termeau E, Petersen NHT, Nylandsted J, Jäättelä M (2012) Identifisering av cytoskjelettet assosierte proteiner viktig for lysosomal stabilitet og overlevelse av humane kreftceller. PLoS ONE 7 (10): e45381. doi: 10,1371 /journal.pone.0045381
Redaktør: Michael Sherman, Boston University Medical School, USA
mottatt: 3 mai 2012; Godkjent: 17 august 2012; Publisert: 11 oktober 2012
Copyright: © Groth-Pedersen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den danske Kreftforeningen, den danske Medical Research Council, det danske departementet for vitenskap, EU-kommisjonen FP7 (APO-SYS), den danske National Research Foundation, ML Jørgensen G. Hansen Foundation, Alfred Benzon Foundation, Meyer Foundation, Novo Nordisk Foundation, Landshövding Per Westling minnefond og John og Augusta Persson stiftelse. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lysosomer er sure vesikler som inneholder flere hydrolaser, som forringer organeller og makromolekyler levert til dem ved autofagi, endocytose og fagocytose [1]. Forbedret lysosomal syntese, trafficking og ekstracellulære frigjøring av lysosomale proteaser (Katepsiner) er viktige kjennetegn på kreft og er assosiert med metastatisk og invasiv kapasitet på kreftceller [2], [3], [4]. Interessant nok har disse omdannings-assosierte forandringer sensibilisere kreftceller for det lysosomale celledød veien [5], en form for programmert celledød som kan ta over når apoptose hemmes, slik tilfellet er i mange kreftformer [6]. Lysosomal celledød er karakterisert ved lysosomale permeabiliseringen og etterfølgende translokasjon av katepsin inn i cytosolen hvor de aktiverer apoptose eller utføre død uten caspaseaktivering [3].
Blant de kreft stoffer som aktiverer lysosomal celledød er mikrotubulus-destabiliserende og -stabilizing stoffer (
f.eks
vinca alkaloider og taxaner), som hemmer lysosomale handel og induserer en utvidelse av lysosomale fulgt av lysosomale brudd og cathepsin-avhengig celledød [7], [8]. Dessverre, for eksempel en alvorlig cytoskeletal forstyrrelse påvirker også livsviktige prosesser i friske celler fører til toksisitet hos pasienter [9]. En mer spesifikk målretting av lysosomal menneskehandel kan dermed forbedre behandling betraktelig.
cytoskjelett dynamikk og intracellulær transport av vesikler, organeller og makromolekyler langs mikrotubulidynamikk og aktin cytoskeletons avhenge av molekylære motor proteiner. De kan deles inn i kinesins, dyneins og myosins, som alle har vært innblandet i lysosome menneskehandel [10], [11], [12]. I tillegg har tallrike aksessoriske proteiner regulere funksjonen til motor proteiner [13], [14], [15]. Kinesins og dyneins, som beveger seg langs mikrotubuli, transportere en rekke gods og bidra til å skape den mitotiske spindelen. De 44 kjente humane kinesins bevege seg hovedsakelig langs pluss ender av mikrotubuli i periferien av cellen (antero transport) [13]. I motsetning til dette er de to kjente humane lasttransporter dynein tunge kjeder, som danner fungerende motor proteinkomplekser med flere aksessoriske proteiner, gå mot minus ender av mikrotubuli i det perinukleære område av cellen (retrograd transport) [14]. I tillegg koder det menneskelige genom for fjorten axonemal dyneins ansvarlig for glide av mikrotubuli som forårsaker juling av flimmerhårene og flageller. Myosins, hvorav mennesker har ~40, binder seg til aktin filamenter som er konsentrert under plasmamembranen. De er spesielt viktig for kort rekkevidde transport under endocytose og eksocytose. Myosins også generere mekanisk kraft for muskel sammentrekning, cellemigrasjon og cytokinese [15]. Andre aktin-bindende proteiner som tropomyosins som påvirker aktin dynamicity og stabilitet [16], modulere myosin funksjon.
For å identifisere molekylære motorer og relaterte proteiner som kreves for kreft celle overlevelse, vi skjermet en siRNA bibliotek targeting 136 molekylær motorer og relaterte proteiner for sirnas som reduserer levedyktigheten til MCF7-celler. De syv proteinene identifisert ble så karakterisert for deres rolle i celledød, cellesyklus, cytoskjelettet struktur, autophagy, lysosomal funksjon og lysosomal integritet. Bemerkelsesverdig, uttømming av alle identifiserte proteiner utløste ikke-apoptotisk celledød som ble innledet av dramatiske endringer i lysosomal stabilitet og funksjon.
Resultater
Identifikasjon av cytoskjelett-assosiert proteiner som uttømming induserer ikke-apoptotiske kreft celledød
Cytoskjelett forstyrrende stoffer er potente indusere av lysosomal celledød [7], [8]. For å identifisere cytoskjelett regulerende proteiner som er nødvendige for kreft celle overlevelse, vist vi en Ambion Silencer® Molecular Motor Library (tabell S1) for toksiske effekter på MCF7- brystkreftceller ved hjelp av MTT reduksjonen analysen. Proteiner ble ansett som kandidater hvis ≥2 /3 sirnas redusert celletetthet ved 40% på tre uavhengige forsøk. Fire kinesin familiemedlemmer (KIF11, KIF20A, KIF21A, KIF25), to myosins (MYO1G og MYH1) og tropomyosin 2 (TPM2) oppfylte disse kriteriene (Fig. 1a) og ble videre analysert etter å ha bekreftet knockdown av siRNAs (Fig. S1) .
(A, B) MCF7 (A), HeLa (B) og U-2 OS-(B) celler ble ubehandlet, behandlet med Oligofectamine (Oligo), eller transfektert med kontroll siRNA (CT) eller tre uavhengige sirnas mot de angitte målene individuelt (8 nm; A) eller i bassengene (3 × 6,67 nm; B). Celletetthet ble målt etter 72 timer ved MTT-reduksjonsanalysen. (C) MCF7-Bcl-2 eller MCF7-pCEP (kontroll) celler ble transfektert som i (B).
Venstre bunnen
, Etter 96 timer ble celledød bestemt ved å telle Hoechst 33342-fargede celler med kondensert kjerner (tre tilfeldige felt av 100 celler). TNF (20 ng /ml, 24 timer) tjente som en positiv kontroll for Bcl-2 følsomme apoptotisk celledød.
Venstre toppen
, Western blot bekrefter overekspresjon av Bcl-2 i ubehandlede MCF7–BCL-2 celler.
Høyre
, Eksempler på bilder av Hoechst 33342-farget kjerner av MCF7-pCEP og MCF7–BCL-2 celler 96 timer etter transfeksjon med angitte sirnas. (D) MCF7-celler ble behandlet som i (B).
Venstre
, etter 60 timer, DNA ble farget med propidiumjodid og cellesyklus distribusjon analysert ved flowcytometri (FL-2A).
Høyre
, Eksempler på histogrammer som viser cellesyklus distribusjon av celler 60 timer etter transfeksjon med angitte sirnas. Verdier representerer middel + SD fra tre uavhengige eksperimenter (A, C, D) eller tre paralleller i en representativ eksperiment (B, n = 3). *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. kontroll siRNA-transfekterte celler eller som indikert ( C).
for etterfølgende eksperimenter de tre sirnas for hvert mål ble slått sammen hvis ikke annet er angitt. Som i MCF7-celler, uttømming av de identifiserte proteiner redusert tetthet av HeLa cervix carcinoma og U-2 OS-osteosarcom-celler i betydelig grad, selv om mønsteret noe annerledes enn det som ble observert i MCF7-celler (Fig. 1A, B). Dette resultatet ble bekreftet ved hjelp av enkle sirnas i U-2 OS-celler (data ikke vist). Deretter undersøkte vi om den observerte celledød var BCL-2-sensitive (apoptotiske) ved trans BCL-2-overekspresjon og vektor-transfektert MCF7 celler [17] med sirnas og kvantifisering død-forbundet kromatin kondens etter 96 timer. De syv sirnas forårsaket kromatin kondensasjon i 20-60% av cellene. Bcl-2 inhiberte kromatin kondensering først etter tumor nekrose faktor (TNF) behandling (en kontroll for apoptotisk celledød), og delvis i KIF21A siRNA-transfekterte celler (fig. 1C). Spesielt KIF21A siRNA fortsatt indusert atom kondens i ~40% av BCL-2-overekspresjon celler (Fig. 1C). Lignende resultater ble oppnådd med enkle sirnas (data ikke vist).
KIF11 og KIF20A er kjent for å regulere mitotisk spindel-dannelse og cytokinese, henholdsvis [18], [19]. KIF11 uttømming arrestert celler i G2 /M-fase, som forventet, mens KIF20A siRNA-transfekterte celler er samlet opp i G1 fase (Fig. 1D). De andre sirnas forårsaket ingen vesentlige endringer i cellesyklus distribusjon (Fig. 1 D).
Effekt av de identifiserte siRNAs på lysosomer og cytoskjelettet
Siden ikke-apoptotisk celledød kan skyldes lysosomal skade, vi neste studert effekten av de identifiserte siRNAs på lysosomene i MCF7 celler. KIF11, KIF20A, KIF25, MYO1G og MYH1 sirnas betydelig økt andel av celler med en forstørret endo-lysosomalt (sur) kammer (fig. 2A), og i celler utarmet for KIF20A, KIF25 eller MYO1G denne økningen var forbundet med øket lysosomal protease aktivitet (fig. 2B). Tvert imot, KIF11, MYH1 og TPM2 sirnas redusert cathepsin aktivitet muligens på grunn av lysosomal membran permeabilization (se nedenfor). Lysosomer ble spredt over hele cytoplasma i celler transfektert med kontroll, KIF11, KIF21A eller MYO1G siRNAs (Fig. 2C). Tvert imot, KIF20A-utarmet celler vises lange utstikkere som ble ofte tett befolket av lysosomer, og KIF25, TPM2 og MYH1 sirnas forårsaket perifer lysosomal aggregering (Fig. 2C). Ligner lysosomal fordeling ble observert ved transfeksjon med alle tre enkelts sirnas rettet mot KIF20A, KIF25 og MYH1 og sirnas 1 og 3 målretting TPM2 (data ikke vist).
(A-D) MCF7 celler ble stående ubehandlet, behandlet med Oligofectamine (Oligo) eller transfektert med kontroll siRNA (CT) eller indikert siRNA bassenger. (A) Etter 60 timer ble cellene med forstørret surt kupé (sen endosomer og lysosomer) identifisert av flowcytometri (FL-2A) av LysoTracker Red-fargede celler. Terskelen for høy intensitet farging ble definert slik at 90% av kontroll siRNA-transfekterte celler var under. (B) Etter 72 timer, total cystein cathepsin aktivitet (zFR-AFC cleavage) ble bestemt. HSPA1 og CTSB sirnas fungerte som internkontroll. (C, D) Etter 60 timer, ble cellene farget for lampe-2 (C) eller F-aktin (D) og analysert ved konfokal mikroskopi. Representative bilder vises.
Piler
, aggregering av lysosomale strukturer i celle utstikkere /periferi.
Barer
, 20 mikrometer. Verdier representerer middel + SD av et minimum av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0.001, vs. kontroll siRNA-transfekterte celler
Deretter undersøkte vi om det endrede lysosomal lokalisering ble forbundet med endringer i aktin eller microtubule cytoskjelettet, som begge er involvert i lysosomal menneskehandel [20]. Uttømming av KIF25 og MYH1 dramatisk økt F-aktin nivåer og spennings fibre som kan bidra til det lysosomale relocalization (fig. 2D). En mindre økning i spennings fibere ble observert ved behandling med MYO1G og TPM2 sirnas, mens ingen endringer ble sett sammen med de andre sirnas (fig. 2D). Ingen av de identifiserte sirnas hadde påvisbare effekter på mikrotubuli som visualiseres ved α-tubulin flekker (data ikke vist).
Effekt av de identifiserte siRNAs på autofagi og dekstran akkumulering
lysosomer får sin last hovedsakelig gjennom autofagi og endocytose. For å teste effekten av de identifiserte sirnas på autophagy, vi brukte MCF7-celler som uttrykker tfLC3, et pH-følsomt tandem fluorescerende protein som består av monomere rødt fluorescerende protein (mRFP), forsterket grønt fluorescerende protein (EGFP) og mikrotubulus-assosiert protein en lettkjede 3 (LC3) [21]. I innledende autophagic vakuoler (AVI) tfLC3 avgir grønn og rød fluorescens mens i degraderende autophagic vakuoler (AVD) det fluoresces bare røde siden EGFP fluorescens er tapt i sure amphisomes og autolysosomes. Som rapportert tidligere [22], uttømming av raptor, en del av mammalian target of rapamycin kompleks en som normalt blokker autofagi, økte antall både AVI og avd indikerer økt autophagic fluks (Fig. 3A, B). I kontrast, MYO1G og MYH1 siRNA bassenger samt alle tre enkelts sirnas rettet mot MYH1 og sirnas 1 og 3 målretting MYO1G økt AVI, men ikke AVD. Sirnas rettet mot de andre fem kandidatene hadde ingen åpenbare effekter i denne analysen (fig. 3A, B og data ikke vist). Evnen til MYO1G og MYH1 sirnas å inhibere autophagic fluks ble også indikert ved en økning i p62 /sequestesome (p62 /SQSTM1, et protein som effektivt nedbrutt av Autophagy) nivåer og redusert evne av en autophagy inducer, rapamycin, for å redusere P62 /SQSTM1 nivåer etter siRNA behandlinger (fig. 3C).
(A-D) tfLC3-MCF7 celler (A, B) eller MCF7 celler (C, D) ble stående ubehandlet, behandlet med Oligofectamine (Oligo) eller transfektert med kontroll siRNA (CT) eller indikert siRNA bassenger (3 × 6,67 nm). (A, B) Etter 48 timer, ble tfLC3-MCF7-celler analysert ved konfokal mikroskopi. Representative bilder (A;
Barer
, 10 mikrometer) og kvantifisering av puncta (B) er vist. Raptor siRNA (RPTOR) fungerte som kontrollgruppe for økt autophagic forandring. Lukkede piler indikerer AVD, åpne piler indikerer AVI. (C) Etter 60 timer, nivået av p62 /SQSTM1 (P62), som er degradert ved autophagy, ble undersøkt ved Western blot. Rapamycin (20 nM, 4 h) ble anvendt for å indusere autophagy. Tallene representerer P62 nivå som prosentdel av nivået i ubehandlede kontroll siRNA-transfekterte celler. (D)
Top
, etter 60 timer, MCF7 celler ble behandlet med 100 mikrogram /ml Alexa Fluor 488-dekstran (dekstran-488) i 1 time og analysert ved flowcytometri (FL1-H). Terskelen for høy intensitet farging ble definert slik at 88% av kontroll siRNA-transfekterte celler var under.
Bottom
, Eksempel histogram viser dekstran-488 innhold av celler transfektert med kontroll eller KIF20A siRNA. M1 = gate for høy intensitet farging. Verdier representerer gjennomsnitt + standardfeilen av 20 celler i løpet av en representativ eksperiment (B, n = 3) eller middel + SD fra tre uavhengige eksperimenter (D). *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0.001, vs. kontroll siRNA-transfekterte celler
Deretter undersøkte vi effekten av de identifiserte siRNAs på opptaket av 10 kDa Alexa Mel 488-dekstran av flowcytometri. KIF20A uttømming økt opphopning av dekstran betraktelig KIF11 siRNA forårsaket en liten (p = 0,066) øker. De øvrige fem sirnas hadde ingen effekt i denne analysen (fig. 3D). Det bør bemerkes at denne analysen ikke kan skille mellom økt endocytose og redusert eksocytose.
Reduksjon av lysosomal stabilitet ved de identifiserte sirnas og monastrol
De ikke-apoptotisk celledød og mange lysosomale endringer observert ovenfor bedt oss å studere effekten av de identifiserte siRNAs på lysosomal stabilitet. Først målte vi evnen til lysosomer for å beholde akridinorange, en metachromatic grunnleggende fargestoff, når utfordret med blått lys [23]. KIF11, KIF20A, KIF21A, MYH1 og TPM2 sirnas sensitivisert MCF7 celler vesentlig til fotooksidasjon-indusert lysosomal lekkasje og KIF25 siRNA viste en lignende tendens 60 timer etter transfeksjon (Fig. 4A, B). Når analysert etter 72 timer, hadde alle sirnas indusert lysosomal lekkasje (utseende av lysosomale proteaser i cytosol), selv om effekten av KIF20A og MYO1G sirnas ikke helt statistisk signifikans (fig. 4C). Spesielt, behandling av MCF7 celler med monastrol, en godt karakterisert lite molekyl hemmer av KIF11 [24], også indusert lysosomal membran permeabilization (fig. 4D). Således uttømming av hver av de syv proteiner samt monastrol behandling resulterer i lysosomal destabilisering.
(A-C) MCF7 celler forble ubehandlet, behandlet med Oligofectamine (Oligo), eller transfektert med kontroll siRNA (CT ) eller indikert siRNA bassenger (3 × 6,67 nM). (A og B) Etter 60 timer ble cellene behandlet med akridinorange og analysert ved hjelp av levende celle avbildning for å måle tapet av lysosomale integritet (økt grønn fluorescens) ved laserbehandling. En miminum av 25 celler fra forhåndsdefinerte områder ble undersøkt for hvert forsøk. Tre uavhengige eksperimenter er vist i A og verdiene i B representerer middel + SD av disse eksperimentene på 60 sek tidspunkt. (C) Etter 72 timer, cytosoliske og totalt cystein katepsinaktivitet ble målt ved å analysere spalting av zFR-AFC. Aktivitetene i cytosoliske ekstrakter er vist som prosenter av aktivitetene i de tilsvarende totalt ekstrakter. HSPA1 og CTSB sirnas tjente som kontroller for induksjon av lysosomale lekkasje og transfeksjon effekt, henholdsvis. (D) cystein-cytosoliske katepsinaktivitet i MCF7 celler ubehandlet eller behandlet med bærer (2% dimetylsulfoksyd, DMSO) eller indikerte konsentrasjoner av monastrol i 72 timer ble bestemt som i (C). Verdier representerer middel + SD av fem (C) eller tre (D) uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. kontroll siRNA-transfektert (B, C) eller kjøretøy-behandlede celler (D).
Sensibilisering til lysosome forstyrrende stoffer av de identifiserte sirnas og monastrol
Siden sirnas destabilisert lysosomene, vi undersøkt om de ville også bevisst celler til lysosome forstyrrende stoffer. For dette formål ble MCF7-celler transfektert med sirnas i 48 timer og deretter behandlet i ytterligere 48 timer med siramesine, etoposid eller cisplatin, som alle er i stand til å forårsake lysosomal celledød [5], [25]. Alle sirnas unntatt KIF25 siRNA sensibiliserte celler til siramesine med den sterkeste virkning observert for KIF11 og KIF21A sirnas (Fig. 5A, B). For KIF11, ble dette bekreftet ved hjelp av de tre enkelts sirnas (data ikke vist). Sensibilisering til etoposid ble sett med KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 og TPM2 siRNAs (Fig. 5A, B). KIF20A siRNA hadde ingen effekt, mens MYO1G siRNA redusert celledød som følge av etoposid, muligens på grunn av dens evne til å inhibere autophagy, noe som kan bidra til etoposid-indusert død [26]. I tillegg KIF11, KIF21, MYH1 og TPM2 sirnas forbedret cisplatin-indusert celledød, men på grunn av variasjoner mellom eksperimenter effekten var bare betydning for KIF21A siRNA. Videre, ved å kombinere monastrol og siramesine resulterte i synergistisk induksjon av celledød i MCF7, HeLa, U-2 OS-og DU-145-celler (fig. 5C, S2). Dermed er alle sirnas lysfølsomt kreftceller til en eller flere lysosomet forstyrrende stoffer med de sterkeste virkninger ble observert i celler som mangler KIF11 eller KIF21A.
(A, B) MCF7 celler forble ubehandlet, behandlet med Oligofectamine (Oligo) eller transfektert med kontroll siRNA eller indikert siRNA bassenger (3 x 6,67 nM). Etter 48 timer ble cellene forblir ubehandlet eller behandlet med 2 mikrometer siramesine (
toppen
), 50 mikrometer etoposid (
midten
) eller 10 mm cisplatin (
nederst
) for ytterligere 48 timer før den lysmikroskopi bildene ble tatt (representative bilder i B) og celledød ble kvantifisert ved LDH-frigivelse assay (A). (C) MCF7 celler ble etterlatt ubehandlet eller behandlet med 2 uM siramesine sammen med angitte konsentrasjoner av monastrol i 72 timer og celledød ble kvantifisert ved LDH-frigivelse analysen. Verdier representerer middel + SD av et minimum av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001, vs. kontroll siRNA-transfekterte celler (A) eller celler behandlet med 2 mikrometer siramesine alene (C).
Diskusjoner
I denne studien har vi identifisert KIF11, KIF20A, KIF21, KIF25, MYO1G, MYH1 og TPM2 som proteiner som depletion forårsaker veksthemming og ikke-apoptotisk celledød i kreftceller (tabell 1). Så vidt vi vet, er denne studien den første til å identifisere KIF21A, KIF25, MYO1G, MYH1 og TPM2 som proteiner viktig for kreft celle overlevelse, mens andre har tidligere rapportert celledød ved nedbryting av KIF11 [27], [28], [29 ] og KIF20A [30] i andre kreftcellelinjer. I likhet med funnene i vår tidligere studie som viser at uttømming av KIF5B er mer giftig for HeLa-celler enn til MCF7 celler [31], observerte vi noen forskjeller i følsomheten til de ulike kreftcellelinjer til de identifiserte sirnas. Dette kan skyldes forskjeller i uttrykk nivåer av målet gener eller beslektede gener med redundante funksjoner.
Spesielt, ektopisk uttrykk for BCL-2 ikke klarte å redde MCF7 celler fra cytotoksisitet indusert av alle identifiserte sirnas bortsett KIF21A siRNA. Selv i KIF21A-utarmet celler, ektopisk Bcl-2 redusert celledød bare delvis 60-40%. Den ufølsomhet for BCL-2 antydet involvering av alternative celledød mekanismene snarere enn klassisk apoptose. Denne forestillingen ble sterkt støttet av den påfølgende observasjon at uttømming av alle syv proteiner forårsaket en viss grad av lysosomal destabilisering, et kjennetegn på det lysosomale celledød pathway [3], [32]. Det er imidlertid ikke umiddelbart innlysende hvordan uttømming av de identifiserte proteiner som fører til lysosomal avbrudd.
Av de identifiserte kinesins, KIF11, også kalt kinesin spindelprotein eller EG5, er blitt undersøkt i utstrakt grad, spesielt i sammenheng av kreft [33]. KIF11 danner en homotetramer som er ansvarlig for spindel formasjon under mitose [18]. Følgelig, og i overensstemmelse med andre studier [28], [29], KIF11 uttømming arrestert MCF7 celler i G2 /M-fase cellesyklus. KIF11 inhibering er også blitt rapportert til å drepe human ovarian carcinoma og leukemiceller via det indre apoptotiske reaksjonsvei i en Bcl-2-sensitiv måte [28], [34]. I motsetning til dette, KIF11 siRNA forårsaket Bcl-2-insensitive ikke-apoptotisk død i MCF7-celler som sannsynligvis skyldes destabilisering av lysosomene og den etterfølgende frigjøring av cystein katepsin inn i cytosol. KIF11 hemming kan utløse lysosomal celledød sti også i andre celletyper siden lysosome stabiliserende Hsp70 beskytter myelomcellenes mot cytotoksisitet indusert av dimethylenastron, en farmakologisk hemmer av KIF11 [29].
I likhet med KIF11, uttømming av KIF21A forårsaket overdreven lysosomale permeabilization og celledød. Det bør bemerkes at celledød indusert av KIF21A uttømming startet allerede ~ 50 timer etter transfeksjon, og kan således ha påvirket på andre målinger av lysosomal funksjon i denne studien (tabell 1). KIF21A binder seg til guanin nukleotid-utveksling faktor BIG1 [35], noe som bidrar til å opprettholde organiseringen av Golgi-apparatet [36]. Dermed kan KIF21A uttømming påvirke smugling av lysosomale komponenter fra Golgi-apparatet til endo-lysosomale dermed forårsaker lysosomal dysfunksjon. Ellers ingenting er kjent om KIF21A og våre resultater sterkeste oppfordre videre undersøkelse av sin rolle i normale celler og kreftceller.
Den tredje kinesin identifisert i vår skjerm, KIF20A (også kalt Rabkinesin-6, RAB6KIFL eller MKlp2) har blitt rapportert å være avgjørende for cytokinese i HeLa-celler i hvilke den hemmende effekten fører til dannelse av flerkjernede celler [19], [37], og for overlevelsen av kreft i bukspyttkjertelen celler ved en mekanisme som ikke innbefatter blokkering av cytokinese [30]. I likhet med kreft i bukspyttkjertelen celler, gjorde KIF20A-utarmet MCF7 cellene ikke arrestere i mitose eller vise en multinucleated fenotype som tyder på at andre kinesins kan ha tatt over sin mitotisk funksjon i disse cellene. I stedet KIF20A uttømming resulterte i akkumulering av MCF7-celler i G1 fasen av cellesyklusen og forårsaket lysosomal celledød. Den celledød ble innledet av øket lysosomal volum, cystein katepsin aktivitet og dekstran akkumulering og destabilisering av lysosomale membraner. De observerte virkninger på endo-lysosomale kan være relatert til en annen tidligere rapportert funksjon av KIF20A, nemlig sitt engasjement i smugling av Golgi-relaterte vesikler til plasmamembranen gjennom et samspill med Rab6 [30], [38].
Nedbrytning av den siste identifisert kinesin, KIF25, forårsaket perifer lysosomal aggregering og en økning i lysosomal volum, en fenotype som ligner den som forårsakes av mikrotubul-forstyrrende stoffer [7]. Deregulert trafficking og økt lysosomal volumet kan ha bidratt til lysosomal permeabilization som forstørret lysosomer er utsatt for forstyrrelser [39]. KIF25 uttømming også forårsaket dannelsen av aktin stresset fiber, som kan være på grunn av endret Rho signalanlegg som tidligere observert på microtubule destabilisering [40]. Disse første ledetråder til KIF25 funksjon i lysosomale menneskehandel og kreft biologi garanterer en nærmere studie av dette i stor grad ukjent medlem av kinesin familien.
I tillegg til de mikrotubulidynamikk-samspill kinesins, vi identifisert tre aktin-bindende proteiner, MYH1, MYO1G og TPM2, som essensielle proteiner for kreft celle overlevelse. MYH1, også kalt Myosin tung kjede 2 × (MyHC-2X), er en del av sarcomere i raske skjelettmuskelfibre [41]. Dens funksjoner i ikke-muskelceller er praktisk talt ukjent, men det kan bidra til å organisere aktin fiber og dermed påvirke aktin-avhengig menneskehandel eller organelle forankring. I samsvar med dette, MYH1-utarmet MCF7 celler viste en økning i aktin stress-fibre og perifer lysosomal aggregering ledsaget av en utvidet lysosomale og lysosomal permeabilization. I tillegg MYH1 utarming skyldes hemming av autophagic nedbrytning og akkumulering av innledende autophagic vakuoler som tyder på defekt autophagosome-lysosome fusjon, som kan være på grunn av feilplassering av lysosomer.
Den andre identifiserte myosin, MYO1G, er beriket på plasmamembranen til hematopoetiske celler hvor det har vært foreslått for å forbedre cellulært elastisitet [42], [43]. Som andre klasse I myosins [15], kan MYO1G også være involvert i vesikkel menneskehandel. Imidlertid er verken lysosomal lokalisering eller dekstran opphopning endret i MYO1G-utarmet celler, og de andre lysosomale effektene var mildere enn etter utarming av de andre identifiserte treff. MYO1G uttømming hadde imidlertid en sterk hemmende effekt på autophagic forandring, noe som kan resultere fra de observerte endringene i aktin fibre. Nylig ble MYH9 /NMHC-IIA funnet å være involvert i autophagosome formasjon under sult [44], og våre resultater tyder på at rollen som ekstra myosins, spesielt MYH1 og MYO1G, i autofagi bør undersøkes nærmere.
den eneste ikke-motor protein identifisert i vår skjerm var TPM2, som danner filamenter langs aktin fiber og kontrollerer muskelkontraksjon ved å blokkere aktin-myosin interaksjon. I ikke-muskelceller, blir TPM2 og andre tropomyosins antas å stabilisere aktin filamenter og regulerer actin funksjoner, inkludert celle motilitet og organeller og vesikkeltransport [16]. TPM2 utarming forårsaket perifer lysosomal aggregering indikerer at TPM2 kan faktisk funksjon i aktin-avhengig lysosomal menneskehandel. Dette er konsistent med data som viser at mikroinjeksjon av TPM1 og TPM2 antistoffer hemmer transporten av intracellulære granulat [45].
Skadelige lysosomale endringer observert på utarming av KIF25, TPM2 og MYH1 kan være knyttet til deres tilsynelatende funksjon i lysosomal menneskehandel, men det gjenstår mindre klart hvor nedregulering av de andre proteiner forstyrret lysosomer. Det er mulig at deres utarming hadde subtile effekter på lysosomal menneskehandel, for eksempel endringer i kortdistansehandel Lysosomers eller smugling av et lysosome undergruppe, som ikke var påviselig med brukte metoder. Alternativt transport av lipider eller proteiner som fremmer lysosomal integritet, for eksempel lysosomale membran proteiner, Hsp70 og syre sfingomyelinasen [5], [23], kan ha blitt endret. Mer indirekte, kan deres utarming føre cytoskeletal endringer som skader andre cellulære organeller og derved aktiverer signalkaskader som utløser lysosomal permeabilization.
De identifiserte proteiner kan være egnede mål for kreftbehandling som kreftceller blir sensibilisert for lysosomal celledød [ ,,,0],4], [5]. Flere inhibitorer av KIF11, som er oppregulert i et bredt spekter av cancere (Oncomine, https://www.oncomine.org), er allerede i kliniske studier som anti-kreft medikamenter [9], og en KIF20A inhibitor har nylig blitt identifisert [46]. Disse inhibitorer ble utviklet som mitotiske blokkeringer men våre resultater tyder på at deres anti-kreft-aktivitet kan også resultere fra lysosomal avbrudd. Vi fant også at uttømming av de syv treff forbedret toksisitet av fotooksidasjon og av lysosome forstyrrende stoffer siramesine, etoposid og cisplatin. Sterk synergi med alle rusmidler ble observert etter uttømming av KIF11, KIF21A og TPM2 mens nedregulering av de andre proteiner var synergis bare med noen av narkotika, muligens gjenspeiler forskjeller i mekanismen av lysosomal avbrudd eller narkotika opptak. Følgelig, ved å kombinere motor protein inhibering med andre lysosom-forstyrre behandlinger synes å være en lovende strategi for kreftterapi. Dette bør spesielt testes for de som allerede er tilgjengelig KIF11 hemmere, som kun har beskjedne anti-kreft effekt som enkle midler [9].
I tillegg til kreft tilkoblinger studert her, våre resultater gir ledetråder til etiologi sjeldne genetiske lidelser forårsaket av mutasjoner i KIF21A og TPM2.
