Abstract
epigenetisk regulering av gener innebærer koordinering av DNA metylering og histonmodifikasjonene å opprettholde transkripsjonen status. Disse to funksjonene er ofte forstyrret i malignitet slik at kritiske gener bukke under for inaktivering. 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) er et middel som hemmer DNA-metyltransferase, og har et stort potensiale som en behandling for kreft, men omfanget av dens effektivitet varierer mellom tumortyper. Forrige tyder uttrykk status etter fem-aza-dC eksponering kan ikke forklares med DNA metylering status alene.
Sikt
Vi har søkt å identifisere kromatin endringer involvert med kort og lang sikt genet reaktive følgende 5-aza-dC eksponering. To kolorektal kreft cellelinjer, HCT116 og SW480, ble behandlet med 5-aza-DC og deretter dyrket i medikamentfrie medier for å tillate DNA re-metylering. DNA metylering og kromatin modifikasjoner ble vurdert med bisulfite sekvensering og Chromatin Immuno-Nedbør analyse.
Resultater
Økt H3 acetylering, H3K4 tri-metylering og tap av H3K27 tri-metylering var assosiert med reaktivering. Hypermethylated gener som ikke viser økt acetylering ble transient uttrykt med 5-aza-dC behandling før tilbakestilling til en inaktiv tilstand. Tre reaktivert gener, CDO1, HSPC105 og MAGEA3 ble likevel uttrykt 10 dager etter 5-aza-dC behandling og vises lokaliserte hypometylering på transkripsjons start området, og også en økt berikelse av histon H3 acetylering.
Konklusjoner
disse observasjonene tyder på at hypometylering alene ikke er tilstrekkelig for å reaktivere forstummet gener og at økt Histone H3 acetylering i samklang med lokaliserte hypometylering tillater langsiktig hjemfall av disse epigenetiske forstummet gener. Denne studien tyder på at kombinerte DNA metyltransferase og histondeacetylase hemmere kan hjelpe langsiktig reaktivering av forstummet gener
Citation. Mossman D, Scott RJ (2011) Long Term Transkripsjonell reaktive av epigenetiske forstummet Gener i kolorektal kreft celler Krever DNA hypometylering og Histone acetvlering. PLoS ONE 6 (8): e23127. doi: 10,1371 /journal.pone.0023127
Redaktør: Michael Freitag, Oregon State University, USA
mottatt: 16 desember 2010; Godkjent: 12 juli 2011; Publisert: 04.08.2011
Copyright: © 2011 Mossman, Scott. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av midler fra NBN TV-aksjonen, University of Newcastle og Hunter Medical Research Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det menneskelige genom inneholder ca 3 milliarder basepar av DNA [1] som krever strategisk emballasje til et kompakt, men likevel dynamisk struktur. Kondensering oppnås med supercoiling av ~147 bp DNA rundt en octamer av histonproteinene (to kopier av hver H2A, H2B, H3 og H4) for å danne en nucleosome [2] som hindrer utilsiktet genekspresjon og øker avhengighet av transkripsjonsaktivatorer [ ,,,0],3]. Transkripsjonell undertrykkelse kan formidles av DNA metylering og er assistert av omfattende modifikasjoner på høyt konserverte lysinresidier på de haler av histonproteinene. Lysin acetylering letter transkripsjon ved å svekke foreningen av histon og DNA [4] og lar transkripsjonsfaktor bindende [5]. Lysin metylering er mer kompleks og kan være assosiert med både aktive og fortrengte regioner av DNA, og kan være tilstede i mono-, bi- og tri-metylert formene [6]. For eksempel, trimethylation av histon H3 lysin 4 (H3K4me3) er en aktiv mark [7] mens metylering av H3K9 og H3K27 vises transcriptionally tause genet arrangører [7], [8].
Aberrant epigenetisk stanse av gener kan initiere malignitet og ofte kommer i tillegg til genetiske endringer, som bidrar til sykdomsutvikling i flere former for kreft [9], [10], [11]. I tillegg kan avvikende hypometylering av proto-onkogener fører til deres aktiverings [12], [13] Redusert ekspresjon av mange gener på grunn av epigenetisk stanse korrelerer med dårlig prognose i mange former for kreft så som lunge- [14], melanom [15] , bryst [16], gastrisk [17] og tykktarm [18]. Sjeldne tilfeller av soma bred mono-metylering av allelisk MLH1 har vist seg å oppstå ved kimlinje-overføring [19]. I tillegg kan arvelige kopitallvariasjoner resultere i transkripsjonen lese gjennom og in-
cis
metylering når tilstøtende til nøkkelgener [20]. Disse mekanismene har en forklaring på hvorfor noen familier er på et høyere risiko for sykdomsutvikling til tross for ikke å gjennomføre en underliggende genetisk mutasjon av viktige gener. Individer innenfor slike familier kan ha nytte av tidlig påvisning av avvikende epigenetiske merker med gener som gir økt risiko for en bestemt sykdom. Med en økende bevissthet om epigenetiske forandringer i sykdommen, motvirker disse endringene med metyltransferase hemmere som 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-DC) ville synes å være et potensielt effektiv behandling. I virkeligheten er denne behandlingen ikke er effektiv i en bestemt gruppe av tumortyper [21], noe som kan skyldes reaktivert gener å innta forstummet tilstand ved opphør av behandlingen.
Vi har tidligere identifisert reaktivering av mange gener i kolorektal kreft cellelinjer etter behandling med demethylating agenten 5-aza-dC [22]. Etter fjerning av medikamentet og ti dagers vekst, og noen av disse genene forble høyt uttrykt, noe som tyder på en reversering av den transkripsjonelle status av disse genene. Selv om det reduseres med 5-aza-dC, ble endringene i DNA-metylering ikke i forhold til nivåene av ekspresjon i gruppen av gener som ble analysert, noe som indikerer andre epigenetiske modifikasjoner ble kontrollerer transkripsjon. Genene som er valgt for analyse ble undersøkt på grunn av deres engasjement i en rekke tumortyper og mulig anvendelse som biomarkører i slike tumorer [23], [24], [25], og /eller på grunn av deres sterke re-ekspresjon og mønster genuttrykk følgende 5-aza-st i kolorektal kreft celler [22]. CDKN2A ble valgt spesielt som det er ofte undertrykt i kolorektal kreftsvulster [26]. Disse genene kan gi viktige gener i epigenetisk utviklingen av et antall av tumortyper. I denne studien har vi preget endringer av DNA metylering og kromatin tilstand som gir mulighet for enten en lang eller kort sikt reaktivering av uttrykket etter 5-aza-dC eksponering.
Metoder
Cell Culture
Triplikat kulturer av HCT116 og SW480-celler ble dyrket i DMEM media supplementert med 10% føtalt kalveserum (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ved 37 ° C og 5% CO
2. Celler ble behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet [22]. DNA og RNA ble ekstrahert fra ubehandlede celler, 5-aza-dC behandlede celler (72 timer med behandling), og ved 4 og 10 dager etter avsluttet behandling (dag 4 og 10 av re-metylering). Cellene ble opprinnelig hentet fra ATCC og ble autentisert bruker Identifiler DNA identifikasjon kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Globalt metylering
Globalt metylering var vurdert som tidligere beskrevet [22]. I korthet ble 50 ug DNA ble enzymatisk spaltet med nuklease P1 (US Biological, Swampscott, MA, USA) fulgt av kromatografisk separering på en Varian stjerne Kromatografi arbeidsstasjon med en Supelcosil LC-18-DB-kolonne (Sigma-Aldrich). Absorbansen ble målt ved 278 nm og topparealene ble kvantifisert med Star Anmelder programvare (Varian, Palo Alto, CA, USA). Den 5-metylcytosin innhold ble uttrykt som en prosentandel av den totale cytosin bassenget etter korrigering for utryddelse co-efficients.
Bisulfite Sekvense
DNA ble konvertert i to eksemplarer ved hjelp av en Qiagen Epitect Bisulfite konverteringssett ( Qiagen, Valencia, CA, USA) ved hjelp av to mikrogram av fenol-kloroform renset DNA. Prøvene ble eluert i 30 ul elueringsbuffer og en prøve ble fortynnet 1:03 før PCR og lagret ved 4 ° C, mens den resterende del ble lagret ved -20 ° C. CpG øyer rundt transkripsjon start stedet av gener var målrettet i PCR-analyse ved hjelp av primere som er oppført i tabell S1. Sekvenseringsreaksjoner ble utført i duplikat og ble analysert på en ABI 3730 sequencer. Dataanalyse ble utført med Sequence Scanner programvare (Applied Biosystems). Den prosentvise Metyleringen ved hver CpG ble bestemt ved å dividere cytosin toppen av de kombinerte høyder av cytosin og tymin topper som tidligere beskrevet [27].
Real Time PCR-analyse av genekspresjon
RNA ble omdannet til cDNA ved hjelp Hevet II (Invitrogen) og tilfeldige primere (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Reaksjonene ble utført i triplikat ved anvendelse av primere som er oppført i tabell S1, 2 x SYBR grønn (Applied Biosystems) i en ABI PRISM 7500 PCR maskin (Applied Biosystems). C
T-verdier ble avgjort automatisk av Sequence Detection Software versjon 1.4 og endelige beregninger ble uttrykt som ganger forskjellen i forhold til B-aktin bruker ΔΔC
T-metoden. Gener med uoppdaget uttrykk ble tildelt en C
T verdi på 40. Feilfelt i uttrykk tallene representerer standard feil.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) og analyse
Kort, tverrbindingen av DNA med protein og cellelyse ble utført ved hjelp av EZ-Magna brikken Kit (Upstate /Millipore) i henhold til produsentens instruksjoner. Ultralydbehandling ble utført ved anvendelse av 8 x 30-sekunders sykluser ved 60% driftssyklus i et isbad, og prøver ble videre avkjølt i 30 sekunder mellom sonikering sykluser. Kromatin Immunoutfelling ble utført som tidligere beskrevet [28] med små modifikasjoner. Antistoffer ble oppnådd fra Upstate (katalognummer, a-H3Ac 06-599, α-H3K4me3 07-473, α-H3K9me3 17-625, α-H3K27me3 17-622) med unntak av kanin IgG ikke-spesifikt antistoff fra Santa Cruz Bioteknologi (Katalognummer nummer~~POS=HEADCOMP SC2027). Antistoff mengder per reaksjon ble bestemt i gangsetting og var 5 mL for α-acetyl H3, 5 mL for α-H3K4me3, 4 mL for α-H3K9me3, 4 mL for α-H3K27me3. 5 ul av kanin-IgG ble tilsatt til negative kontrollprøver. Kryssforbindelser ble reversert ved tilsetning av 20 ul proteinase K (Promega) og inkubert ved 62 ° C i 3 timer med risting. Gjenvunnet DNA ble deretter renset ved hjelp av en PCR rydde opp kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
Real time PCR-analyse av immunopresipitert kromatin
DNA ble kvantifisert ved hjelp av DNA Kvantifisering System (Promega ) i henhold til produsentens instruksjoner, og målinger ble tatt ved hjelp av en TD 20/20 luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA). De Real-Time PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av 200 ρg av DNA mal med SYBR Green 2 × Mastermix (Applied Biosystems) og primere oppført i tabell S1. Reaksjonene ble utført i triplikat og utføres ved anvendelse av et ABI PRISM 7500 PCR maskin (Applied Biosystems). C
T-verdier ble avgjort automatisk av Sequence Detection Software versjon 1.4 (Applied Biosystems) og de endelige verdiene ble uttrykt som en prosentandel av inngangs fraksjonen. Feilfelt i kromatin endringstallene representerer standard feil.
Statistical Analysis
Standardavvik beregnet og en T-test ble benyttet for å sammenligne uttrykk nivåer og histon endringsnivåer i legemiddelbehandlede celler mot ubehandlet celler.
P
-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Genomisk DNA Metylering med 5-aza-dC behandling
Globalt metylering nivåer redusert følgende 5-aza-dC behandling med 53% og 59% i HCT116 og SW480 cellelinjer henholdsvis (figur 1). Dette representerer en betydelig nedgang sammenlignet med celler som var mock behandlet som ikke gjennom demetylering (HCT116 p-verdi = 0,003, SW480 p-verdi = 0,017). Fortsatt inkubasjon av cellene i ytterligere ti dager etter behandling i narkotika gratis medie tillatt DNA re-metylering og genomiske nivåer økt, men kom ikke tilbake til samme nivå som observert før behandling i denne perioden.
Genomisk metylering -nivåene minket signifikant i begge cellelinjene følgende 5-aza-dC eksponering. Genomiske metylering nivåene ble gradvis gjenopprettet i løpet av de neste ti dagene av rusfritt vekst hvor de nærmet seg før behandlingsnivåer.
Gene Spesifikk metylering og re-uttrykk med 5-aza-dC behandling
Bruk av genom vide uttrykks arrays vi tidligere har identifisert genekspresjonsmønster følgende 5-aza-dC behandling [22]. De samme genene ble igjen undersøkt i denne studie for å tillate karakterisering av histonmodifikasjonene. I dette eksperimentet, ble ekspresjon bestemt ved kvantitativ PCR og gener ble deretter klassifisert i fem kategorier; «Alltid uttrykt» (ekspresjon detektert ved alle tidspunkter), «oppregulert» (to ganger i ekspresjon etter 5-aza-dC behandling), «lang sikt reaktivert» (uoppdaget i ubehandlede celler, men uttrykkes etter behandling så vel som fire og ti dager etter legemiddeleksponering (basert på en C
T verdi av 40 for ikke-detekterbare transkripsjoner)), «short term reaktivert «(samme som» lang sikt reaktiveres» med unntak av dagen fire og /eller ti ekspresjon som var nødvendig for å være 100 ganger høyere enn nivået av ubehandlede celler), eller «andre» (et annet mønster av genekspresjon)
de tre gener som ble aktivert på nytt for et kort tidsrom (. CXCL6 og ZFP3 i HCT116-celler og CDKN2A i SW480 celler) ble alle hypermethylated over analysert region av sine CpG øyer. Uttrykket mønster av disse genene var markert forskjellig i den andre av de to cellelinjer; her, disse genene viste svært lite eller lite metylering ved transkripsjon start hotellet (TSS) og ble enten uttrykt kontinuerlig eller ble oppregulert (figur 2). Genene som forble høyt uttrykte etter reaktivering (CDO1, HSPC105, MAGEA3) vises unike metylering profiler og inneholdt en hypomethylated CpG område som grenser til transkripsjon start hotellet (TSS), som vist i figur 3. CpG island bestemt demetylering etter behandling var 10- 15% på det meste ,, derfor bare ubehandlede metylering mønstrene er vist i figur 2 og 3. data for de fire tidspunktene er vist i figur S1 for den MAGEA3 gen som viste den største genet med reduksjon av DNA-metylering. Et eksempel på den direkte sekvense kromatogrammer av MAGEA3 er vist i figur S2
A – CXCL6 CpG øy metylering.; kort sikt v alltid uttrykt. (B) – SW480 celler vises hypometylering og CXCL6 ble uttrykt ved alle tidspunkter. (C) – Uniform hypermethylation av HCT116 cellelinjen var assosiert med en kortsiktig reaktivering av uttrykk. D, E, F – CDKN2A CpG Island metylering; kort sikt v konstant uttrykk. SW480 celler vise CDKN2A hypermethylation og ble midlertidig gjen uttrykt, mens i HCT116 cellene CDKN2A er -50% denaturert ved CpG områder i nærheten av TSS, og ble uttrykt ved alle tidspunkter. Stjernene betegner vesentlig endring i forhold til ubehandlede celler. G, H, I – ZFP3 CpG Island metylering; kort sikt v oppregulert uttrykk. SW480 celler viste hypometylering på CpG områder i nærheten av TSS og uttrykket ble oppregulert etter 5-aza-dC behandling. ZFP3 forblir hypermethylated i HCT116 cellene og ble midlertidig reaktivert med 5-aza-dC behandling. J – Vesentlige endringer i histonmodifikasjonene sammenlignet med ubehandlede celler (p 0,05).
A, B, C – CDO1 CpG Island metylering; lang sikt v kort sikt uttrykt. Sekvense Analysen avdekket CpG områder i nærheten av TSS i SW480 celler har lavere metylering og vises langsiktig uttrykk sammenlignet med HCT116-celler som er jevnt hypermethylated på CDO1 og opplevd en oppregulert mønster av uttrykk. D, E, F – HSPC105 CpG Island metylering; alltid uttrykt v langsiktig uttrykt. Den SW480 cellelinje viser lokalisert hypometylering på TSS og kan forbli uttrykt ti dager etter behandling. Den HCT116-cellelinjen er hypomethylated ved HSPC105 promoteren og blir kontinuerlig uttrykt. G, H, I – MAGEA3 CpG Island metylering; alltid uttrykt v langsiktig re-uttrykk. SW480 celler viser lokalisert hypometylering på TSS og uttrykkes ti dager etter behandling. HCT116 cellene vise -50% metylering på TSS og MAGEA3 uttrykkes ved alle tidspunkter. J – Vesentlige endringer i histonmodifikasjonene sammenlignet med ubehandlede celler (p 0,05).
Gener bestemt på å være «alltid uttrykt «vises maksimalt 50% metylering ved TSS som tyder på mono-alleliske metylering, og oppregulert gener viste varierende mønstre av metylering. Den MLH1-genet ble uttrykt i begge cellelinjene og metylering ble ikke påvist i den TSS forbundet CpG øy (data ikke vist). Motsatt, en variant av DICER1 ble ikke uttrykt i enten cellelinje som helst punkt som bestemmes av mikromatriseanalyse og fravær av dens ekspresjon ble bekreftet ved kvantitativ PCR. DICER1 er ikke tilknyttet en CpG øy, derfor bisulfite sekvensering analyse ble ikke utført. CDKN2A ble uttrykt i HCT116 og viste delvis metylering ved TSS. Den tilsvarende region i SW480 celler ble hypermethylated og uttrykk ble klassifisert som kortsiktig reaktivert etter behandling.
Fortsatt inkubasjon av celler i narkotika frie medier tillates re-metylering av DNA, som kom tilbake til opprinnelig nivå på promoter CpG øyer . Genekspresjon ble ikke nødvendigvis påvirket av tilbakeføring av arrangøren metylering imidlertid, og uttrykk for CDO1, HSPC105 og MAGEA3 gener i SW480 celler holdt seg høy ti dager etter at 5-aza-dC behandling. Disse genene vises unike CpG island metylering mønstre som har hypomethylated CpG områder i tilknytning til TSS. Som metylering nivåer ved promoter CpG øyer ikke nøyaktig gjenspeiler uttrykket av gener studert, forsøkte vi å undersøke mønstre av histonmodifikasjonene på de respektive CpG øyer som kan forklare høye nivåer av uttrykk.
Chromatin endringer etter 5-aza-dC eksponering
Chromatin Immunpresipitasjon og q-PCR viste at Histone H3Ac og H3K4me3 var funksjonene som uttrykte gener som GAPDH og MLH1 og fortrengte genene ble assosiert med H3K9me3 og sjeldnere H3K27me3 som var fraværende fra konstitutivt uttrykte gener .. chip resultatene er oppsummert i figur 2 og 3, med p-verdier som er oppført i Tabell 1. Spesifikke endringer i kromatin modifikasjon er vist i figur S3, S4, S5, S6.
endringer av kromatin proteinene følgende 72 timer eksponering var avhengig av genekspresjon status. Gener med større uttrykk etter behandling økt i H3K4me3, mens H3Ac ble bare forbundet med gener reaktivert for lengre perioder. Vanligvis undertrykkende H3K27me3 farge ble redusert etter behandling, med unntak av CXCL6 genet. En sammenligning av histonmodifikasjonene i kortsiktige reaktivert gener viste forbigående økning av histon H3K4me3 og redusert eller stabilt nivå av trimetyl-histon H3 lysin 9 og 27. Til tross for dette, transkripsjon av disse genene ti dager etter behandlingen var på et tilsvarende ubehandlede celler. Den mest åpenbare forskjellen mellom kortsiktige og langsiktige reaktivert gener var H3Ac modifisering. Gener anses å være «langsiktig reaktivert «viste en økning på H3Ac, men ikke alltid nådde statistisk signifikans, etter behandling som vedvarte inntil ti dager etter behandling. Det var også en trend i langsiktige gjen uttrykte gener hvor en reduksjon i H3K27me3 ble observert oppregulert gener (CDO1 i HCT116 cellene og ZFP3 i SW480) og gener som alltid ble uttrykt viste en gevinst på aktive kromatin merker og et tap av undertrykkende histonmodifikasjonene etter 5-aza-dC eksponering.
Diskusjoner
epigenetisk kontroll av genekspresjon formidles av DNA metylering og histonmodifikasjonene. Ved å endre DNA metylering og opp-regulerer genuttrykk vi kan identifisere mønstre av endring i histone protein modifikasjoner som følger med lang og kort sikt reaktivering av epigenetiske forstummet gener. Av særlig relevans for denne studien var den tilsynelatende transkripsjonen oppregulering av forstummet gener som viste mindre enn 15% DNA demetylering, hvor histonmodifikasjonene er sannsynlig å bli involvert i reguleringen av genuttrykk i slike tilfeller.
The effekten av DNA-metylering på genekspresjon
Uavhengig av den uttrykksmønster i løpet av behandling, graden av metylering av denne CpG øyer holdt seg forholdsvis uendret i forhold til genomiske nivå etter 5-aza-dC eksponering. Denne observasjonen er gjort tidligere, med metylering av gjentatte sekvenser egnet til å bidra til dette avviket [22], [29]. En annen studie har vist at DNA metylering øker ved arrangører av ikke-uttrykte gener når hemmet av doksycyklin i en tet-responsiv promoter system [30]. Konstitutivt uttrykte gener ble hypomethylated på begge allelene, eller oppviste CpG øy metylering på 50% som indikerer mono-allelisk metylering, slik som CDKN2A genet i HCT116-celler som tidligere er vist [31]. Svakt demetylering av promoter CpG øyer ble indusert med 5-aza-dC, men uttrykket ble ikke nødvendigvis begrenset i enkelte gener når metylering tilbake til opprinnelig nivå. Høy ekspresjon av langtids reaktivert genene syntes å være avhengig av pre-eksisterende hypometylering ved TSS uavhengig av om de tilstøtende CpG områder ble hypermethylated. Dette resultatet indikerer mønsteret av metylering snarere enn den generelle nivået av metylering over CpG island er avgjørende for å re-aktivere forstummet gener via interaksjoner med andre epigenetiske faktorer. Hypomethylated CpG områder innen hypermethylated promotorer, har tidligere blitt identifisert i Oncostatin M-reseptorgenet [27], men virkningen av dette på hypometylering transkripsjon ble ikke undersøkt. Hvorfor uttrykk for langsiktig reaktivert gener ikke forekomme i ubehandlede celler som viste en nesten identisk metylering mønster kan forklares av endringer i endringer på histonproteiner.
Effekten av histonmodifikasjonene på genekspresjon
Et øyeblikksbilde av hva som styrer genuttrykk ble oppnådd med utarbeidelsen av CpG island sekvensering og kromatin immuno-nedbør resultater. Ved aktivering av mange gener og klassifisering av uttrykk, kan vi skille mellom genene basert på metylering og kromatin endringer til stede. Før behandling, transkripsjonelt inaktive gener ble karakterisert av høyere nivåer av undertrykkende modifikasjoner og lavere nivåer av aktiverende merker. Ved behandling med 5-aza-dC var det vanligvis en økning i nivåene av H3K4me3 og H3K9me3, mens H3Ac økte bare i noen av de gener. Reduksjoner til H3K27me3 skjedde i gener som i utgangspunktet viste denne egenskapen. Med hensyn til kromatin modifikasjoner, det var under rusfri vekstperioden som histone acetylering ble den mest skjelnes funksjonen mellom kortsiktige og langsiktige reaktivert gener. Langsiktig reaktivert genet arrangører ble stadig forbundet med acetylering av histon H3 bistå med genaktivering imidlertid kun nådd betydelige nivåer etter ti dager med rusfri vekst. Midlertidig reaktivert gener ikke tiltrekke seg denne endringen til tross for en kort periode av uttrykk. Det synes derfor at innføringen av H3 acetylering er en avgjørende faktor i å snu transcriptional status som epigenetiske forstummet genet som er assistert av lokaliserte DNA hypometylering. Med unntak av H3K27me3 på CDKN2A i SW480 celler, ble langvarige endringer i epigenetiske modifikasjoner som ikke er observert i midlertidig reaktivert gener.
oppregulering av ydmyk uttrykte gener var assosiert med økt H3 acetylering og H3K4me3, for eksempel den ZFP3 genet i SW480 celler. Metylering profiler som dette kan indikere en mellomting mellom alltid uttrykte gener og de langsiktige reaktivert gener. Co-eksisterende aktive og undertrykkende merker kan tillate et begrenset nivå av transkripsjon, noe som tyder på kontroll av uttrykket av disse genene er avhengig av likevekt av begge typer modifikasjoner.
I de genene som ble undersøkt i denne studien, roller histon H3 acetylering og H3K27me3 var tydelig som aktiverer og undertrykke markerer henholdsvis gjorde imidlertid effekten av H3K4me3 og H3K9me3 ikke synes tilstrekkelig til å endre genuttrykk på en langsiktig basis. Etter 5-aza-dC eksponering, ble H3K9me3 ofte øket ved uttrykte gener som er sammenfallende med nylige funn at det kan også være kombinert med genaktivering [29], [32], [33]. Tilsvarende H3K4me3 som assosierer med aktive regioner av genomet ble funnet på inaktive gener, om enn på et redusert nivå. Observasjoner av denne art markere dynamikken i kromatin og eventuelt foreslå en mellomform av undertrykkelse lik bivalent kromatin rundt utviklingsgener [34] eller effekten av nabo kromatin som har blitt oppdaget på grunn av variasjoner i klipping effektivitet under lydbehandling.
Kobling DNA-metylering, kromatin modifikasjoner og genekspresjon
mønstre av ekspresjon av reaktiveres og oppregulert gener kan hovedsakelig forklares ved kombinasjonen av promoter metylering analyse og kromatin immuno-utfelling analyser. Ved observasjon og sammenligning av langsiktige og kortsiktige reaktivert genene våre resultater viser at gener med en lokalisert hypometylering på TSS er mer sannsynlig å oppleve en økning på histon H3 acetylering og forbli uttrykte etter 5-aza-dC eksponering. I tillegg observerte vi at spesifikk genekspresjon ble reaktivert uten store endringer i den tilhørende CpG island metylering og dette var uavhengig av nærliggende hypermethylation innenfor samme CpG island.
En sekvens av hendelser involvert med epigenetisk reaktive har blitt foreslått av Litt
et al.
[35]. Forfatterne angir at reaktiveringen av den HPRT-genet som kreves hemi-demetylering av promoteren, «åpning» av kromatinstruktur, transkripsjonsfaktorbindende og montering av transkripsjon komplekset før syntesen av den HPRT RNA. Basert på våre eksperimenter, kan vi utvide denne kunnskapen ved å foreslå at mindre demetylering indusert av 5-aza-DC og økt H3K4me3 tillater initiering av transkripsjon. Rollen til H3K9 trimethylation er ikke klar, men kan være forbundet med reaktivering i noen tilfeller. Et tap av undertrykkende merker som H3K27me3 kan også ytterligere øke transkripsjon. Selv om det ikke undersøkt her, er det mulig MBD2 bindende kan gå tapt ved dette punkt som ikke lenger ville hindre histon acetyltransferase fra området [36]. Transkripsjon er forlenget hvis økt acetylering av histon H3 skjer, ellers uttrykk er forbigående og genuttrykk er sannsynlig å gå tilbake til en inaktiv tilstand.
metyltransferase hemmere ved behandling av svulster
Tidligere studier har vist at gener brukt i denne studien etter for metylering med andre ondartede sykdommer så som visse former for brystkreft [24] og ovarie [37] kreft. Derfor kan reaktiveringen som er beskrevet i denne studien ikke være begrenset til kolorektal kreft, men også andre tumortyper, hvor reverseringen av epigenetisk undertrykkelse kan være av terapeutisk nytte. Effekten av 5-aza-dC som en behandling er begrenset til visse tumortyper, men hva som forårsaker et positivt resultat fra 5-aza-dC behandling er ukjent. Suksessen kan ligge med metylering mønster etter nåværende FN-identifiserte mål gener og narkotika evne til å reaktivere forstummet gener over en lengre periode. Derfor våre resultater tyder på at undertrykte gener viser lokalisert TSS hypometylering kan reaktiveres med kombinert metyltransferase /histondeacetylase hemmer behandling. Økt acetylering på hypermethylated transkripsjonsstartsider som fører til lang sikt reaktivering av anti-proliferative gener kan være nyttig i behandling av svulster når denne informasjonen er kjent. Denne mekanismen vil være i tillegg til den synergistiske rapporterte apoptotiske virkning av metyltransferase og histondeacetylase inhibitorer [28], [38].
Konklusjon
Analyse av kromatin ved promoteren av genene i denne studien tyder på at eksisterende hypometylering følgende (men ikke nødvendigvis indusert av) 5-aza-dC behandling, hjelpemidler histon H3 acetylering, enten direkte eller indirekte. Kombinasjonen av hypometylering av CpG nettsteder på TSS og H3 acetylering resultat i stabil reaktivering av gener studert her. Resultatene av denne studien fremheve de epigenetiske funksjoner som må modifiseres med hensyn til reversering av transkripsjonelle status av gener i behandling av sykdom. En mer strategisk tilnærming vil føre til utvikling av epigenetiske terapi i stedet for bruk av epigenetiske modifiserende legemidler som cytotoksiske terapier.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
metylering av MAGEA3 i SW480 celler behandlet med 5-aza-DC. Bisulfitt sekvense PCR ble utført ved hvert tidspunkt og plottet for å vise endringer før og etter 5-aza-dC behandling, The MAGEA3 gen viste den største demetylering av alle genene analysert, med en reduksjon på 10-15% ved flere CpG områder nær TSS genet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0023127.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Metylering på MAGEA3 transkripsjon Start-nettstedet. A – Arrangøren metylering over MAGEA3 CpG island. Den røde linjen viser den regionen i sekvensen vist i B og C. B – Metylering på MAGEA3 TSS i SW480 celler. Direkte sekvensering av bisulfitt PCR-produkter forårsaker dual C og T topper på CpG områder, og er representative for denaturert og ikke-denaturert alleler hhv. CPG området ved siden av TSS viser en større andel av T-alleler (som representerer unmethylated cytosin) indikerer hypometylering, mens nærliggende CpG nettsteder viser økt cytosin topper og høyere metylering nivåer. Pilene viser CpG nettsider, eske Ts indikere posisjon av ikke-CpG cytosin og understrekede sekvens representerer transkripsjon start stedet. C – CpG steder i HCT116 cellelinje er større enn 50% denaturert
doi: 10,1371 /journal.pone.0023127.s002 plakater (TIF)
Figur S3..
