Abstract
I radikalt resected magekreft mulighet til å forutsi stedet for tilbakefall kan være klinisk relevant for valg av post-kirurgiske inngrep. Vi har tidligere vist at spesifikke kreftinte genotyper uavhengig assosiert med enten peritoneal eller hematogene metastaser (ITGA og ITGV). Nylig VEGF og VEGF-R polymorfismer har vist seg å potensielt påvirke tumor angiogenese og metastatisk prosess i magekreft. Vi deretter undersøkt hvilken rolle VEGFs og VEGF-R genotyping i å bestemme enten peritoneal carcinosis eller hematogene metastaser i radikalt resected mage kreftpasienter. Tumor genotyping for inte (ITGA og ITGV) ble også utført i henhold til våre tidligere funn. Genotyping for VEGF-A, ble VEGF-C, VEGFR-1,2,3 og ITGA og ITGV utført på pT4a radikalt resected mage svulster tilbakevendende med enten peritoneal-bare carcinosis eller hematogene metastaser. 101 pasienter oppfylte inklusjonskriteriene: 57 med bare peritoneal karsinomatose og 44 med hematogenous spredning bare. Ved multivariat analyse, intestinal histologi og AC genotype av rs699947 (VEGFA) viste til selvstendig korrelere med hematogene metastaser (henholdsvis p = 0,0008 og 0,008), mens diffus histologi og AA genotype av rs2269772 (ITGA) uavhengig korrelert med peritoneal-bare diffusjon (p = 0,0001 og 0,03 henholdsvis). Våre resultater tyder på at å kombinere informasjon fra genotyping av rs699947 (VEGFA, AC), rs2269772 (ITGA, AA) og tumorhistologi kan tillate klinikere til individuate magekreft med høy risiko for tilbakefall enten med peritoneal eller hematogene metastaser. Utvalget verktøy som stammer fra denne analysen kan gi en optimal utnyttelse av de tilgjengelige behandlingsstrategier i disse pasientene
Citation. Scartozzi M, Loretelli C, Galizia E, Mandolesi A, Pistelli M, Bittoni A, et al. (2012) Rolle av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og VEGF-R Genotyping i Føring av metastatisk Process i pT4a resected Gastric kreftpasienter. PLoS ONE syv (7): e38192. doi: 10,1371 /journal.pone.0038192
Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 24 januar 2012; Godkjent: 01.05.2012; Publisert: 09.07.2012
Copyright: © 2012 Scartozzi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den globale utfallet for radikalt resected mage kreftpasienter forble hovedsakelig uforandret på tvers av årene i vestlige land, med en 5-års overlevelse varierer mellom 15% og 35% av alle tilfeller [1], [2]. Til tross for flere forsøk, de fleste kliniske studier som undersøker rollen til postoperativ behandling viste kontroversielle resultater.
I vestlige land bare en beskjeden overlevelsesfordel, har blitt observert for adjuvant kjemoterapi hovedsakelig i sammenslåtte analyser og den reelle effekten av kjemoradioterapi virket begrenset til pasienter som får en utilstrekkelig klarering av lymfekjertlene [3], [4].
Peritoneal carcinosis kan være det første stedet for tilbakefall hos omtrent 40-50% av pasienter som gjennomgår radikal reseksjon [5], [ ,,,0],6], [7]. Basert på disse dataene en potensiell rolle for intraperitoneal kjemoterapi i forebygging av peritoneal karsinomatose er blitt formodet [6], [7]. Imidlertid oppdemning av sykdom med en lokoregional behandling kan være utilstrekkelig hos pasienter med høy risiko for hematogene metastaser og bør være bedre reservert bare for de som er sannsynlige til å gjenta seg i peritoneum uten hematogenous diffusjon. Dessverre prediktive faktorer for området for tilbakefall og potensielt i stand til å foreslå en personlig postoperative strategi er i stor grad mangler. Selv om mange kliniske determinants har blitt analysert i det siste, bare få av dem viste seg å være effektivt relevant forutsi stedet for tilbakefall. Kliniske og patologiske forhold som tumor serøse engasjement, tumorhistologi (diffus vs. tarm), er omfanget av lymphadenectomy og tilstedeværelsen av tumorceller i peritoneal lavage under laparotomi blitt indikert som prediktiv for området av tilbakefall i magekreft [4] [8], [9].
i en tidligere analyse fant vi at Genotyping av rs2269772 (
ITGA
) og rs11902171 (
ITGV
) kan representere en kritisk ressurs i definisjonen av høyrisiko mage kreftpasienter for peritoneal carcinosis [10].
vaskulær endotel vekstfaktorer (VEGF) super har blitt identifisert til å kritisk innflytelse angiogenese i solide svulster. Publiserte data tyder på at i nærvær av tumor angiogenese-relaterte faktorer fjernmetastaser er mer sannsynlig å oppstå [11], [12].
Interessant nok har det også vært vist at den angiogene fenotypen kan variere mellom intestinal-type og diffuse-type magekreft. I forskjellige analyser intestinal-type tumorer synes faktisk mer biologisk avhengig av angiogenese enn diffuse-type svulster [13], [14], [15].
Single-nukleotid polymorfismer (SNPs) i vaskulær endotelial vekst faktorer (VEGF) og VEGF reseptorer (VEGF-R) gener har blitt korrelert til tumor neoangiogenesis gjennom ulike biologiske mekanismer. Hos pasienter med kolorektal kreft spesifikke SNP’er i VEGF-R2 har vist seg å påvirke microvessel tetthet [16] betraktelig. Spesifikke SNP’er i VEGFA genet resulterte i stand til å bestemme respons på kjemoterapi ved modulering av tumorblodkarene struktur og funksjon [17].
Tumor lymphangiogenesis er strengt avhengig av den biologiske aktivitet av VEGFC og VEGF-R3 [ ,,,0],18], [19]. Interessant lymfatisk diffusjon med direkte kolonisering av kreftceller representerer også avgjørende, men biologisk distinkt, trinn for peritoneal formidling. Basert på disse forutsetningene kan vi da hypoteser at den endrede uttrykk for VEGFC /VEGFR-3 bane kan påvirke peritoneal spredning av kreftceller gjennom lymfesystemet [20]. På den annen side den VEGFC /VEGF-R3 veien har også blitt demonstrert relevant for hematogenous kreftspredning så vel [21].
forutsi beliggenheten av tilbakefall blant individer med høy risiko kan tillate skreddersydd adjuvant tilnærminger. Vi undersøkte derfor rollen som kreft VEGFs og VEGF-Rs polymorfismer i å bestemme enten peritoneal carcinosis eller hematogene metastaser i radikalt resected mage kreftpasienter. Kliniske data og SNPs resultater for kreft VEGFs, VEGF-R og inte er analysert med sikte på å foreslå en biologisk-drevet profil som skal benyttes som et verktøy for riktig behandling valg i den aktuelle pasienten.
Metoder
pasienter Utvalg
Den pasienter studiepopulasjonen ble valgt fra en sentral database, inkludert pasienter rammet av magekreft, som drives i fire forskjellige institusjoner i vår region. Klassifisering av T, N og M-faktorer ble gjort i henhold til tallsystem innført av 7
th TNM.
Bare pasienter som fikk tilbakefall innen 2 år, med enten peritoneal-bare carcinosis eller hematogenous metastaser etter kurativ gastrektomi for en pT4a adenokarsinom i ventrikkel, som ikke fikk adjuvant kjemoterapi og hvis svulsten prøven var tilgjengelig ble valgt for svulst genotyping. Pasienter med enten fjernmetastaser ved diagnosetidspunktet eller tilstedeværelse av ekspandert tumorceller i peritoneal lavage innhentet under laparotomi ble ekskludert fra analysen. Vi bestemte oss for å begrense vår analyse til pasienter med pT4a svulster som denne gruppen av pasienter er høyere risiko for peritoneal diffusjon og blir ofte ansett for lokoregionalt behandling som intraperitoneal kjemoterapi. Men en ikke ubetydelig andel av disse pasientene ikke oppstår lokalt og derfor et utvalg verktøy i denne innstillingen vil være en spesielt verdifull ressurs for behandlende leger. Siden de fleste tilbakefall er registrert innen 2 år fra diagnose valgte vi å ekskludere pasienter tilbakevendende etter denne tidsperioden for å oppnå en homogen befolkning.
Oppfølging av begge gruppene (peritoneal-bare eller hematogene metastaser) forekom hos tre måneders mellomrom. Oppfølging bestod av fysisk undersøkelse, en komplett blodprosent, brystet røntgen og UL av magen eller CT-skanning som klinisk indisert. Området og dato for første tilbakefall og dødsdato ble registrert
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etisk komité AOU Ospedali Riuniti -. Umberto I vår institusjon. Alle pasienter forutsatt informert skriftlig samtykke.
Tumor VEGF og VEGF-R Genotyping
VEGF og VEGF-R genotyping ble utført på formalinfiksert parafin-embedded vevsblokk (ca. 30 mg) av primær magekreft prøver.
Parafinvoks voks~~POS=HEADCOMP ble fjernet med xylen, og prøvene ble vasket to ganger med 100% etanol. DNA ble isolert fra deparaffinised vev ved hjelp av RecoverAll ™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE- Vev (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. DNA fra hver prøve ble så eluert i 120 mL av eluere løsning.
enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) innen hvert gen ble valgt ved hjelp av Pupasuite programvare (https://pupasuite.bioinfo.cipf.es/index. JSF – versjon 2.0.0, bioinfo 2008), den CIPF enkeltnukleotidpolymorfi database (dbSNP) generert av National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) og ved gjennomgang av medisinsk litteratur, ved hjelp av følgende kriterier:
polymorfismen hadde en viss grad av sannsynlighet for å endre strukturen eller ekspresjon av genet i en biologisk relevant måte (det vil si som påvirker ESE sekvenser, 3′-UTR eller promoter region);
den mindreårige allelfrekvens var over 10% (med det eneste unntaket av rs2305948, rs6877011 og rs307822);.
genetisk polymorfisme ble etablert og veldokumentert
Videre betraktninger kjørte valg av SNPs for vår studie. En korrelasjon mellom tilstedeværelsen av et bestemt allel på et polymorft område og ekspresjon av det respektive proteinet tidligere er blitt dokumentert for VEGF [22], [23]. SNP’er i regulatoriske sekvenser, så som introner, og 5 «og 3′ UTR, har vist seg å endre mRNA stabilitet [24], [25] prosessering effektivitet [26], isoformen uttrykk [27], [28] og lokalisering [29] . Dessuten har regulatoriske sekvenser motiv innen 3»-UTR av mRNA vist å påvirke stabiliteten av messenger og /eller dets transla-sjonsvirkning [28]. Således kan det argumenteres at SNP’er i disse sekvenser kan påvirke VEGF og VEGF-R-genekspresjon. Også på disse basene, valgte vi SNPs kjent for å påvirke VEGF og VEGF-R uttrykk og de som ligger i regulatoriske sekvenser, som kan antas en antatt rolle i protein regulering.
Globalt vi antok at valgt SNPs hadde . effekt på protein uttrykk og derfor på biologisk funksjon
Valgte SNPs var som følger: seks polymorfismer i VEGFA genet (rs10434, G A; rs2010963, G C; rs25648, C T; rs3025039, C T; rs699947, A C; rs833061, C T), to i VEGFC (rs4604006, T C; rs7664413, C T), to i VEGF-R1 (FLT1) (rs664393, G A; rs7993418, A G), fire i VEGF-R2 (KDR) (rs1870377, A T; rs2071559, A G; rs2305948, G A; rs7667298, A G) og tre i VEGF-R3 (FLT4) (rs307805, A G; rs6877011, C G; rs307822, G A). Kromosom steder, posisjoner og biologiske effekter av forsket VEGF og VEGFR SNPs er oppsummert i tabell 1.
SNP genotyping ble utført av TaqMan teknologi, ved hjelp av SNP genotyping produkter (Applied Biosystems). Polymerase kjedereaksjon (PCR) ble utført og genotyper ble analysert på 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ved hjelp av en ABI Prism 7300 Sequence Detection System (versjon 1.3.1, Applied Biosystems). Hver reaksjon inneholdt 0,2 mL av totalt genomisk DNA. Genotyping ble utført av laboratoriepersonell blindet for pasientens status, og en tilfeldig 10% av prøvene ble gjentatt for å validere genotyping prosedyrer.
Alle SNPs genotypet måtte presentere en samlet samtalepriser på ≥90% som skal inkluderes i vår analyse.
tumor inte~~POS=TRUNC griner~~POS=HEADCOMP Genotyping
Genotyping for kreftinte uavhengig assosiert med enten peritoneal eller hematogene metastaser i vår forrige analyse (A og G genotyper av rs2269772,
ITGA Hotell og G og C genotyper av rs11902171,
ITGV
) ble gjennomført som tidligere beskrevet [10].
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med MedCalc programvareversjon 10.4.8 for Windows. Sammenhengen mellom kategoriske variabler ble estimert ved Chi-kvadrat test. Logistisk regresjonsanalyse ble brukt for å vurdere den uavhengige rollen variabler resulterte signifikant ved univariat analyse
variabler Testet inkludert kjønn (menn kontra kvinner), alder ( 65 år vs. ≥ 65 år)., Fravær eller tilstedeværelsen av lymfeknutemetastaser (pN0 vs. pN +), type lymphadenectomy (D1 vs D2), tumorhistologi ifølge Lauren klassifikasjon (intestinal vs. diffus), lymfatiske /blodkar invasjon (tilstedeværelse kontra fravær), den kliniske senter hvor operasjonen ble utført, inte genotyping (A og G genotyper av rs2269772,
ITGA Hotell og G og C genotyper av rs11902171,
ITGV
) og hver VEGF og VEGF-R polymorfisme.
forholdet mellom odds for utfallet (odds ratio) i 2 grupper (peritoneal carcinosis bare og hematogene metastaser) ble beregnet med 95% konfidensintervall. En betydelig nivå på 0,05 ble valgt for å vurdere statistisk signifikans.
Alle polymorfismer ble undersøkt for avvik fra Hardy-Weinberg likevekt med Powermarker v. 3.25 pakke (www.statgen.ncsu.edu/powermarker).
koblingsulikevekt (LD) analyse ble også utført med Powermarker v. 3.25 pakke (www.statgen.ncsu.edu/powermarker). LD ble beregnet ved hjelp av r2, med r2 = 1 indikerer fullstendig LD og r2 = 0 indikerer fraværende LD.
Resultater
Hardy-Weinberg likevekt og koblingsulikevekt
Hyppigheten av de testede genotypene resulterte sammenlignes med det som er rapportert i kaukasiere, med ingen signifikant avvik fra Hardy-Weinberg likevekt.
koblingsulikevekt ble ikke observert for kreft genotyper uavhengig korrelerte med enten peritoneal eller hematogene metastaser.
pasienter Kjennetegn
ett hundre og ett pasienter var tilgjengelig for våre analyser: 66 menn og 35 kvinner med en median alder ved diagnose av 67 år (spredning 34-89). Oppfølgingsdata var tilgjengelig for alle pasienter inkludert. Oppfølging bestod av fysisk undersøkelse, en komplett blodprosent, brystet røntgen og UL av magen eller CT /MR-røntgen som klinisk indisert. Kun pasienter som utelukkende utviklet enten peritoneal carcinosis eller hematogene metastaser under hele forløpet av sykdommen ble vurdert.
Alle pasientene gjennomgikk radikal kirurgi (R0) for pT4a magekreft, regionale lymphnodes var negative for metastaser (pN0) i 23 pasienter (23%). De fleste av pasientene gjennomgikk en D2 lymphadenectomy (94 tilfeller, 93%). Patologi Rapporten viste tarm histologi i 51 tilfeller (51%) og diffus histologi i 50 pasienter (49%) (tabell 1). Femti-sju pasienter (56%) utviklet peritoneal carcinosis-bare svulst diffusjon, mens hematogene metastaser ble diagnostisert i de resterende 44 pasientene (44%). Clinicopathological variabler av begge gruppene (carcinosis-bare og hematogene metastaser) var sammenlignbare med unntak av tumorhistologi. Alle store kliniske og patologiske egenskaper er oppsummert i tabell 2.
Tumor VEGF og VEGF-R Genotyping
Alle SNPs genotypet presenteres en samlet samtalepriser på ≥90%.
Gjentatte prøver for genotyping validering bekreftet resultatene oppnådd ved forrige analyse i alle tilfeller.
Gastric svulster viser AA genotype av rs10434 (
VEGFA
), AC genotype av rs699947 (VEGFA) og GG genotypen til rs7993418 (FLT1) resulterte mer utsatt for hematogene metastaser (peritoneal carcinosis vs. hematogene metastaser: 8% vs. 27%, p = 0,02; 30% vs. 59%, p = 0,006 og 2% vs 16 %, p = 0,02 henholdsvis) (tabell 3). Ingen sammenheng ble funnet mellom disse svulst genotyper og peritoneal-bare diffusjon.
Analyse av de gjenværende VEGF og VEGF-R polymorfismer viste ingen sammenheng med enten peritoneal carcinosis eller hematogene metastaser (tabell 4) .
tumor inte~~POS=TRUNC griner~~POS=HEADCOMP genotyping
Globalt resultater for kreftinte genotyping bekreftet våre tidligere funn.
Pasienter svulster med GG genotype av rs2269772 (
ITGA
) ga mindre utsatt for peritoneal carcinosis (peritoneal carcinosis vs. hematogene metastaser: 39% og 77% av pasientene henholdsvis, p = 0,002), mens AA genotypen til rs2269772 (
ITGA
) ble oftere forbundet til peritoneal carcinosis (peritoneale carcinosis vs hematogene metastaser: 25% og 5% av pasientene henholdsvis, p = 0,014). CC genotype av rs11902171 (
ITGV
) ble oftere assosiert til peritoneal carcinosis (peritoneal carcinosis vs. hematogene metastaser: 21% og 5% av pasientene, p = 0,016). Tvert imot pasienter med GG genotype av rs11902171 i
ITGV
genet utviklet peritoneal carcinosis sjeldnere enn hematogene metastaser (peritoneal carcinosis vs. hematogene metastaser: 42% og 66% av pasientene, p = 0,02) .
andre kliniske /patologiske faktorer
Blant de andre testede variabler, viste svulst diffus histologi en sammenheng med peritoneal carcinosis (peritoneal carcinosis vs. hematogene metastaser: henholdsvis 81% og 9% av pasientene, p 0,001), mens svulsten intestinal histologi ble knyttet til hematogene metastaser (peritoneal carcinosis vs. hematogene metastaser:. 19% og 91% av pasientene, p 0,001) (tabell 2)
multivariat analyse
i multivariat analyse, intestinal histologi og AC genotype av rs699947 (VEGFA) viste til selvstendig korrelere med hematogene metastaser, mens diffus histologi og AA genotype av rs2269772 (ITGA3) uavhengig korrelert med peritoneal-bare diffusjon (p = 0,001 ). Odds ratio resultater for disse sistnevnte faktorene bekreftet sin rolle i å veilede kreftceller gjennom metastatisk prosess mot peritoneum eller hematogene områder (tabell 5).
Diskusjoner
Innføring av flere behandlingsmetoder alternativer for post-kirurgisk behandling av radikalt resected mage kreftpasienter har åpnet spørsmålet om optimal pasienter utvalg. Dessverre er en kritisk begrensende faktor for potensialet i disse behandling valg er representert ved den manglende av kliniske og biologiske faktorer i stand til å forutsi stedet for gjentakelse. Oppdemning av sykdom med en lokoregional behandling, så som intraperitoneal kjemoterapi kan være i virkeligheten utilstrekkelig hos pasienter med høy risiko for hematogene metastaser og burde være bedre reservert for pasienter som mest sannsynlig vil gjenta seg med peritoneal-bare diffusjon. På den annen side hos pasienter mer sannsynlig å gjenta seg med hematogene metastaser adjuvant kjemoterapi kan representere en mer effektiv strategi.
I vår erfaring rs699947 (VEGFA, AC) polymorfisme er uavhengig knyttet til en høyere risiko for hematogenous metastaser med en OR 8,08 (95% KI 1,7 til 37,5, p = 0,008). SNP’er i promoterregionen av VEGF-genet er allerede vist seg å påvirke utfallet pasienter i kolorektal, bryst og mage kreft [17], [30], [31]. Den biologiske forstyrrelser på VEGF genet funksjon forårsaket av polymorfe varianter i promoterområdet er faktisk sannsynlig for å bestemme en endret ekspresjon av genet. Dette kan både øke tumor-relatert pro-angiogenese potensiale og til slutt lede den metastatiske prosess ved dannelse av nye blodkar [16], [17], [30], [31]. Men ikke finnes data om rollen VEGFs og VEGF-R genotyping ved fastsettelse av metastatisk prosess radikalt resected magekreft. De fleste studier undersøkt bare noen få SNP’er potensielt er involvert i tumor angiogenese, mens i den foreliggende undersøkelse flere SNP’er i VEGFs genene og reseptorer er blitt globalt analysert sammen med andre kjente determinanter.
Som tidligere beskrevet rs2269772 (ITGA, AA ) genotype av tumorintegriner bekreftet å være uavhengig relevant ved bestemmelse peritoneal diffusjon av magekreftceller [10). Dette funnet stammer fra en multivariat analyse inkludert tumor-angiogenese relaterte faktorer tyder på at denne spesifikke tumor inte polymorfisme bør vurderes i fremtidige studier. Tvert imot vår analyse kunne ikke bekrefte rollen til tumorintegriner i å bestemme hematogenous diffusjon. Vi vet fra tidligere utgitt analyser som oppregulering av inteunderklasser kan forbedre neoplastiske celler bevegelighet og VEGF uttrykk [32],. Integriner kan derfor miste sin funksjon med å bestemme hematogenous tumor diffusjon når angiogenese-relaterte faktorer som allerede er aktivert.
Tumor histologi medførte en ytterligere faktor uavhengig er i stand til å identifisere den magekreft potensial for å bestemme enten peritoneal eller hematogene metastaser. Likevel tumorhistologi alene ikke synes tilstrekkelig til å nøyaktig forutsi metastaser. I vår erfaring, på samme måte som tidligere rapporter, en relevant andel av pasientene utviklet peritoneal carcinosis eller hematogene metastaser uavhengig av tumorhistologi. Lignende betraktninger kan brukes til tilstedeværelsen av tumor serøse engasjement og /eller skrubbet kreftceller i peritoneal lavage. Ikke alle mage svulster med serøse infiltrasjon vil etter hvert utvikle carcinosis og en negativ peritoneal lavage dessverre ikke utelukke en fremtidig peritoneal diffusjon [8], [9]. Vi viste at genotyping av rs699947 (VEGFA, AC) og rs2269772 (ITGA, AA) har en selvstendig rolle i å bestemme metastatisk området av magekreftceller selv når tumorhistologi er inkludert i analysen. Våre resultater synes deretter å indikere at å kombinere informasjon fra genotyping av rs699947, rs2269772 og tumorhistologi kan tillate klinikere til individuate magekreft med høy risiko for tilbakefall enten med peritoneal eller med hematogene metastaser hos pasienter som gjennomgår tilsynelatende radikal kirurgi for pT4a kreft uten ekspandert kreftceller i peritoneal lavage. I vår studie DNA genotyping ble utført bare på tumor DNA, og dette kan representere en begrensning for tolking.
i utlandet vi tror at genotyping for spesifikk VEGFA og integrin gener kan representere en kritisk ressurs i definisjonen av metastatisk spredning for radikalt resekterte magekreftpasienter. Radikalt resekterte magekreft pasienter med høy risiko for peritoneal gjentakelse kan være optimale kandidater for intraperitoneal behandling, mens dersom risikoen for hematogene metastaser er fremherskende systemisk kjemoterapi kan representere et bedre alternativ. Utvalget verktøy som stammer fra denne analysen kan da gi en optimal utnyttelse av de tilgjengelige behandlingsstrategier og bør representere en mulig lagdeling faktor i fremtidige studier i disse pasientene.
