Abstract
Emerging bevis indikerer at microRNAs (mirnas) kan spille en viktig rolle i kreft. Avvikende uttrykk for miRNAs har vært hyppig påvist i ulike menneskelige maligniteter, inkludert tykktarmskreft (CRC). Men den mekanismen som deregulert mirnas påvirker utviklingen av CRC fortsatt i stor grad unnvikende. I denne studien viser vi at MIR-124 er betydelig nedregulert i CRC sammenlignet med tilstøtende ikke-tumor kolorektale vev. MiR-124 undertrykker ekspresjonen av STAT3 ved direkte binding til dets 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR). Overekspresjon av MIR-124 førte til økt apoptose av CRC-celler og redusert tumorvekst in vitro og in vivo. Knocking ned STAT3 uttrykk av spesifikke siRNA undertrykte veksten av CRC celler in vitro og in vivo, som minner om MIR-124 overekspresjon. Videre overekspresjon av STAT3 i MIR-124-transfiserte CRC-celler effektivt reddet inhibering av celleproliferasjon forårsaket av MIR-124. Disse data tyder på at Mir-124 fungerer som en tumor suppressor ved å målrette STAT3, og krever bruk av MIR-124 som en potensiell terapeutisk verktøy for CRC, hvor STAT3 er ofte hyper-aktivert
Citation. Zhang J, Lu Y, Yue X, Li H, Luo X, Wang Y, et al. (2013) MiR-124 Undertrykker Vekst of Human tykktarmskreft ved å hemme STAT3. PLoS ONE åtte (8): e70300. doi: 10,1371 /journal.pone.0070300
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 18 februar 2013, Godkjent: 17 juni 2013; Publisert: 05.08.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Scientific Foundation of China (Grant nr 81171447), Foundation Natural Science i Guangdong-provinsen, Kina (Grant No. 104518036002006310), Shenzhen Science and Technology Project (GJHZ20120616153140827). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje største årsaken til dødsfall blant alle menneskelige maligne [1], [2]. De fleste CRC oppstår sporadisk, med sekvensiell mutasjoner i
APC /β-catennin, K-Ras, COX-2
, og
p53
signaliserer langs prosessen av kreft initiering, progresjon og metastase [3 ] – [5]. I tillegg til kreftcelle indre mekanismer som formidles av disse onkogener og tumorsuppressorgener, spiller interaksjonen mellom kreftceller og andre celler i tumor stroma også viktige roller i å forme utvikling av kreft [6]. I en prosess ligne naturlig utvalg, kreftceller samtidig utvikle seg med sin mikromiljøet og velges ved sin evne til å fornye sine omgivelser for å overleve, spredning og metastaser til fjerne områder [6], [7].
STAT3
er en kritisk kobling mellom tumorceller og deres microenvironments ved å regulere både tumorvekst og tumorassosiert inflammasjon [8], [9]. I kreftceller,
STAT3
spiller viktige roller i tumorvekst og progresjon [10]. Aktivert
STAT3
kan påvises i flere kreft hos mennesker, inkludert de av tykktarm, hud, mage, bryst, lunge og andre [10] – [13]. Tilstedeværelse av kjernefysisk-lokaliserte
STAT3
i humane kreftformer impliserer at
STAT3
kan tjene som et onkogen å fremme kreftutvikling. Faktisk betinget sletting av
STAT3
i colonic epitelceller og i hepatocytter resulterte i redusert svulstutvikling hos mus [10], [14]. I en musemodell av AOM /DSS-indusert kolitt-assosiert CRC, delesjon av
STAT3
i enterocytter resulterte i redusert tumorbelastning i tarmen [15], [16].
STAT3
, aktivert av pro-inflammatoriske cytokiner som IL-6 fra tumor-infiltrerende myeloide celler, fremmer både overlevelse og vekst av transformerte intestinale epitelceller. Delesjon av IL-6 eller kognatreseptoren gp130 i AOM /DSS modell resulterte i redusert tumorstørrelse og tumor nummer, mens ytterligere forsterkning av
STAT3
aktivitet ved innføring av hyper-aktiv gp130 ført til økt tumordiameter og tumor telle [15], [16].
STAT3
regulerer overlevelse av kreftceller ved å aktivere gener som gir resistens mot apoptose. Disse
Stat3
-avhengige anti-apoptotiske gener inkluderer
BCL-XL, Bcl-2, c-IAP2, Mcl-1 Hotell og
Survivin product: [13], [15 ] – [17]. Sletting av
STAT3
i kreftceller resulterte i redusert ekspresjon av disse pro-overlevelse gener og øket kreftcelle apoptose [10], [15], [16]. Tilleggs
Stat3
mål inkluderer gener som fremmer celledeling, som
Cykliner B Hotell og
D
, og
c-myc product: [9], [16 ], noe som forklarer den reduserte kreft størrelser på
STAT3
ablasjon [15], [16]. Ved å fremme svulst celle overlevelse og vekst,
STAT3
fungerer som et signal integrator å aktivere forvandlet celler til å overleve og formere seg i respons til stimuli stammer fra stromale celler i svulsten mikromiljøet [5].
mirnas er små ikke-kodende RNA av ~22 nt at taushet genuttrykk ved å undertrykke oversettelse av mRNA til proteiner [18] – [20]. Mirnas er beregnet til å regulere mer enn 60% av gener i pattedyr, noe som gjør dem til et større parti i celle adferd [21]. Mirnas er involvert i flere cellulære funksjoner inkludert proliferasjon, apoptose og differensiering, og er implementert i forskjellige fysiologiske og patologiske prosesser som strekker seg fra utvikling av kreft [18], [19], [22], [23]. Rollen miRNAs i kreft har blitt godt demonstrert [24] – [27]. Mirnas kan tjene som enten oncogener eller tumor-suppressor-gener, avhengig av arten av sine mål. Den første bevis som viser involvering av miRNA i kreft kom fra en studie i kronisk lymfatisk leukemi (KLL), der
MIR-15a Hotell og
MIR-16-1
blir ofte slettet [28]. Senere studier ytterligere demonstrert tumor-undertrykke roller
MIR-15a Hotell og
MIR-16-1
ved å identifisere
BCL2
som deres regulatoriske målet, som er en anti-apoptotiske genet som ofte blir overuttrykt i mange typer humane cancere [29]. Et annet eksempel på tumor-undertrykkende miRNA er
la-7
familie som hemmer uttrykk for
Ras
onkogen [30].
La-7
familie mirnas ligger i sårbare områder av menneskelige genom, og deres tap indikerer dårlig prognose i kreft hos mennesker [31], [32].
Flere mirnas med avvikende uttrykk har vært identifisert i forskjellige humane kreftformer, inkludert CRC [33] – [35]. Gener som er regulert av disse kreft-assosiert mirnas inkluderer
cox2
,
APC, K-Ras, EGFR
og mer, som er viktige for initiering og progresjon av CRC [34]. Blant dem er MIR-124 et interessant mål å studere i kreftutvikling. Det har vært omfattende studier over rollen til mir-124 i nervesystemet, hvor det regulerer neuronal utvikling og neural plastisitet ved å målrette Notch signalisering og andre gener som er involvert i nervecellen differensiering og aktivering [36]. MiR-124 er nedregulert i medulloblastoma og livmorhalskreft [37], [38] og er også involvert i en inflammatorisk feedback loop i leverkreft (HCC) [39]. Rollen MIR-124 i CRC, og den mekanismen som MIR-124 regulerer kreftutvikling, fortsatt i stor grad ukjent.
I denne studien, vi forsøkte å dechiffrere rolle MIR-124 i CRC utvikling. Vi viser at MIR-124 er nedregulert i menneskelig CRC. MiR-124 mål 3 «ikke-translatert område (3’UTR) av STAT3 å undertrykke sitt uttrykk. Ved downregulating STAT3, MIR-124 induserer programmert celledød i humane CRC celler og undertrykker vekst av CRC tumorer in vivo.
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
SW480 og LoVo menneskelig CRC cellelinjer ble oppnådd fra cellene Bank av den kinesiske Academy of Science (Shanghai, Kina). Alle celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet kammer supplert med 5% CO
2.
MiR-124
forløper (
Forhånds MIR-124
), miRNA forløper kontroll (
Pre-egge~~POS=TRUNC miRNA
), anti
MIR-124
oligonukleotid (
AS-MIR-124
), Cy3-stemplet
MIR -Scramble
, anti miRNA kontroll (
AS-egge~~POS=TRUNC
miRNA), siRNA mot
STAT3 product: (
STAT3-siRNA
), og egge siRNA-oligonukleotid (
siRNA-kontroll
) ble kjøpt fra Ambion (Austin, Texas, USA).
STAT3
antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).
PcDNA3.0-STAT3
, en STAT3 ekspresjonsvektor ble konstruert ved vårt laboratorium.
pasientprøver og RNA Utvinning
Menneskelig CRC prøver ble innhentet fra 90 kirurgiske pasienter i Institutt for gastroenterologi, Peking University Shenzhen Hospital. Tilstøtende normal slimhinne prøvene plassert minst 2 cm fra kantene av svulsten (polypp eller karsinom) ble brukt som kontroller. Alle tumorer ble adenokarsinomer mens mucinkjertler karsinom (når mer enn 50% av tumorvolumet var sammensatt av mucin) ble ekskludert. Kolorektal kreft ble iscenesatt i henhold til Dukes klassifikasjonssystem: Dukes A (T1-T2, N0, og M0; n = 26), Dukes B (T3-T4, N0, og M0; n = 16), Dukes C (noen T , N1-2, M0; n = 38) og Dukes D (noen T og noen N og M1, n = 10). CRC prøver ble samlet fra pasienter som gjennomgår tarm reseksjon. Innsamlede prøver ble lagret i flytende nitrogen. Alle pasientene ble informert om målene for prøveinnsamling og ga skriftlig samtykke i samsvar med de etiske retningslinjene i Peking University. Studien ble godkjent av etisk komité av Peking University Shenzhen Hospital. Mirna ble hentet fra friske vev ved hjelp av Ambion Mirvana miRNA isolasjon kit (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner.
Påvisning av Mature
MIR-124
av TaqMan Real-time RT-PCR
real-time RT-PCR-analyse for moden
MIR-124
ble utført i tre eksemplarer ved hjelp av TaqMan mikroRNA analyser kit (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. RT-reaksjonen inneholdt 10 ng total-RNA, 1 mM dNTPs, 50U Multiscribe revers transkriptase, 1,5 ul 10 x RT-buffer, 0,188 ul RNase-inhibitor, og 3 ul 5 x TaqMan mikroRNA RT primer i hver reaksjon (15 ul). RT-reaksjonen ble utført under følgende betingelser: 16 ° C i 30 minutter; 42 ° C i 30 minutter; 85 ° C i 5 minutter; og deretter holdt på 4 ° C. Etter RT-reaksjonen, ble cDNA-produkter fra RT-reaksjonsblandingen fortynnet 15 ganger. PCR ble utført med 1,33 ul av de fortynnede produkter i 20 pl PCR-reaksjon inneholdende 1 pl av TaqMan mikroRNA-analysen og 10 ul av TaqMan PCR Universal Master Mix. Amplifikasjon ble utført som følger: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 sek. Relativ uttrykk ble beregnet ved hjelp av komparative CT-metoden og normalisert til uttrykk av
RNU6B plakater (Ambion).
Kvantitativ Real-time RT-PCR analyse av
STAT3
mRNA uttrykk
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer transfektert med
Forhånds MIR-124
eller kontroll av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA ble syntetisert med revers transkriptase M-MLV kit (Takara, Dalian, Kina) ved hjelp av en mikrogram total RNA og 50 mikrometer Oligo (dT) primer i 10 ul reaksjonsvolum. Revers transkripsjon ble utført i henhold til følgende program: 30 min ved 70 ° C, deretter avkjølt på is umiddelbart, 1 time ved 42 ° C, 15 min ved 70 ° C og deretter holdt ved 4 ° C. RT produkter ble fortynnet 10 ganger. Real-time PCR ble utført i tre paralleller med iQ-SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad, CA, USA) og Icycler Instrument (Bio-Rad, CA, USA) ved bruk av 1 mL fortynnet cDNA som mal i et 20 ul reaksjonsvolum. PCR-reaksjonen ble utført som følger: 95 ° C i 3 minutter og 40 sykluser av 95 ° C i 20 s, 55 ° C i 30 s, og 72 ° C i 20 sek. Primere som brukes for real-time PCR er:
STAT3
frem primer: 5′-ATCACGCCTTCTACAGACTGC-3 «, Reverse primer. 5»-CATCCTGGAGATTC
TCTACCACT-3′.
GAPDH
forover-primer: 5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3 «, revers primer: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3». Relativ uttrykk ble beregnet ved 2
-ΔΔCt metode.
Transfeksjon
For RNA oligonukleotider, celler ble transfektert med SIPORT NeoFX (Ambion) med 50 nM siRNA eller 100 nM miRNA. For plasmid, ble celler transfektert med 4 ug DNA i 35 mm brønner av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). I rednings eksperimentet, ble cellene ko-transfektert med 100 nM miRNA og 3 ug plasmid i 35 mm brønner. Transfeksjon effektivitet ble estimert ved Cy3-merket MIR-Scramble for RNA oligonukleotider eller ved GFP-uttrykke vektor for plasmid.
proteomikk analyse
SW480 celler ble transfektert med
Forhånds MIR-124
eller
Pre-egge~~POS=TRUNC
miRNA kontroll. 48 timer etter transfeksjon, ble celleprotein ekstrahert og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad, CA, USA). Proteiner ble anvendt for 2-DGE som beskrevet av Bio-Rad manuell. Massespektrometri analyse ble utført på Teaching Center of Biology Experiment, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina). 2-DGE med den første dimensjonen isoelectrofocusing ble utført pH3-10 IPG klar strimler, og i den andre dimensjonen ble atskilt med 8-14% stigning SDS-PAGE.
Plasmid Construction
forsterket 3′-UTR segment av
STAT3
inneholder spådd
MIR-124
målområde ved PCR fra SW480 celle genomisk DNA, og satt den inn i Spel /Hindlll setene nedstrøms luciferase genet i pMIR-RAPPORT Luciferase miRNA Expression Reporter Vector (Ambion). I henhold til genbanken sekvensen av
STAT3
, vi utviklet de følgende primere for å amplifisere det 3′-UTR av
STAT3
av PCR: forover primer, 5′-CGGACTAGT AAATGAGTGAATGTGGGTG-3 «, og revers primer, 5»-CCAAGCTTTGTTGCTGGAGAAGTAAGAG-3 «. 3»-UTR segment av
STAT3
med mutant
MIR-124
målområde ble generert av overlapp-PCR ved hjelp av vill type 3′-UTR konstruere som mal. De følgende primere ble anvendt for å danne 3′-UTR inneholdende mutant
MIR-124
målstedet: 3′-UTR-
STAT3
-M-revers 5′-CCAGCCCTGAGGACTACACCACAGAAACAACCTAGCC-3 «, 3»-UTR-
STAT3
-M-forward, 5′-GTTTCTGTGGTGTAGTCCTCAGGGCTGGGATACTTCTG-3 «. Alle de positive konstruksjoner ble identifisert ved restriksjons fordøyelse og bekreftet ved DNA-sekvensering.
luciferase Analyser
SW480 celler ble transfektert med luciferase konstruksjoner som inneholder 3′-UTR av
STAT3 product: ( med villtype eller mutant
MIR-124
målse) og /eller
Forhånds MIR-124
eller
Pre-egge~~POS=TRUNC
miRNA kontroll. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene høstet for luciferase-analyser ved anvendelse av et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
pMIR-RAPPORT-β-gal
ble brukt for normalisering.
celleproliferasjonsanalyse
SW480 og LoVo celler ble transfektert med
Forhånds MIR-124
eller
Pre-egge~~POS=TRUNC miRNA
kontroll som beskrevet ovenfor. 6 timer etter transfeksjon, ble cellene tellet og sådd ut i en tetthet på 3 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater og 3 x 10
5 celler pr 30 mm-plate i triplikater. WST-1-analyser ble utført ved 72 timer etter transfeksjon. For WST-1-analysen, ble spektrofotometri utført ved λ = 450 nm og λ ref = 690 nm etter inkubasjon med 10 ul WST-1 (Roche, New York, NY, USA) i 3 timer.
immunfluorescens analysen
SW480 og LoVo celler ble transfektert med
Forhånds MIR-124
eller
Pre-egge~~POS=TRUNC miRNA
kontroll. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i PBS. Kaninantistoffer mot
STAT3 plakater (Cell Signaling Technology, BSN, USA) ble anvendt som primært antistoff og FITC-konjugert geite-anti-kanin-IgG (Chemicon International, Temecula, CA, USA) ble anvendt som sekundært antistoff for å visual
STAT3
. Kjerner ble farget med DAPI.
Western blotting
Total protein ble isolert fra cellelinjer transfektert med RNA oligonukleotid og /eller plasmid-DNA i cellelyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF og 1% natriumdeoksycholat). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse kit. Proteinprøver ble separert ved 10% SDS-polyakrylamidgel og overført til en polyvinylidendifluorid-membran (Amersham, Buckinghamshire, UK). Blottene ble analysert med antistoffer mot
STAT3 Hotell og fosfo
STAT3 plakater (Cell Signaling Technology, BSN, USA), etterfulgt av en sekundær pepperrot peroksidase-konjugert antistoff. De antigenantistoffkomplekser ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence kit (Roche) som anbefalt av produsenten.
apoptose Analyse
SW480 og LoVo celler ble transfektert med
Forhånds MIR-124
eller
Pre-egge~~POS=TRUNC miRNA
kontroll. Etter transfeksjon 72 timer, ble cellene farget med propidiumjodid og anti-annexin-V-antistoff og analysert ved strømningscytometri.
Animal Experiments
spesifikke patogen-frie hunn atymiske BALB /c nakne mus , 4-6 uker gamle (20-30 g), ble oppnådd fra Guangdong medisinske laboratoriet dyr senter. Mus ble plassert 5 per bur og fri tilgang til mat og vann. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i Shenzhen-PKU-HKUST Medical Center (Permit Number: 158). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. SW480 cellelinjer ble transfektert in vitro med RNA oligonukleotid og /eller plasmid (pcDNA3.0-STAT3) vektor. 24 timer etter transfeksjon, 10
7 levedyktige celler ble suspendert i 100 ul PBS og injisert subkutant inn i høyre dorsale korsrygg av nakne mus. Minst 7 mus ble benyttet pr gruppe for å teste effekten av MIR-124 i tumorvekst. Tumorvekst ble vurdert ved å måle todimensjonale diametre to ganger i uken med calipers. Tumorvolum (V) ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: V = A x B
2/2, hvor A representerer den større diameter, og B er den mindre diameter. 40 dager etter celleinjeksjon, ble mus ofret for vev analyse.
Immunhistokjemisk analyse og TUNEL analysen
Transplanterte svulster ble resected fra verts mus, fiksert i 10% formalin, parafin innebygd, og kutt i 4 mikrometer tykke seksjoner. Snittene ble deparaffinized, rehydrert i xylen etterfulgt av graderte alkoholer, og mikrobølge antigen hentes med 10 mM citrat-bufferoppløsning (pH 6,0 i 15 minutter). Etter inaktivering ved eksponering til 3% H
2o
2 i 10 minutter for å blokkere endogen peroksidase, Snitt ble inkubert med 10% geiteserum i PBS i 30 minutter for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding. Seksjoner ble inkubert med STAT3 antistoff (Cell Signaling, # 9132) ved 1:200 fortynning over natten ved 4 ° C og deretter vasket i PBS. Sekundært antistoff (biotinylert anti-kanin-IgG, fortynning 1:200) ble påført, og snitt ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med PBS ble snittene inkubert med peroksidase-merket streptavidin-komplekset i 20 minutter ved romtemperatur. Seksjonene ble deretter inkubert med en oppløsning av 3% diamino-benzidin (DAB) som kromogen i 20 minutter. Fromowitz standard ble anvendt for å vurdere semikvantitativt farging av STAT3 [37].
TUNEL-farging ble utført på 6-um deler av det utskårede tumorer. Snittene ble deparaffinized forut for merkingsreaksjonen. TUNEL Analysen ble utført ved hjelp av TumorTACS in situ apoptose Detection Kit (Trevigen Inc. USA). Denne analysen påviser spesifikt apoptotiske celler når undersøkt gjennom Zeiss mikroskop.
Statistical Analysis
Betydningen analyse av mikromatriser (SAM) ble brukt til å identifisere mirnas forskjellig uttrykt mellom prøvene (FDR = 0).
MiR-124
uttrykk i CRC svulster og tilstøtende ikke-tumorvev ble sammenlignet med Mann-Whitney U test, og i evalueringen mellom scene svulster tidlig og avanserte. En sammenligning av midler mellom to eller flere grupper ble utført ved å bruke en-veis analyse av varians eller t-test. Alle numeriske data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. P-verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, California) og SPSS (versjon 11).
Resultater
MiR-124
er Ned- regulert i human CRC
for å undersøke uttrykket profilen til
MIR-124
i CRC, vi utført kvantitativ real-time RT-PCR bruker TaqMan analysen i 90 paret tumor og normal kolorektal prøver. Som vist på fig. 1A, fant vi betydelig redusert
MIR-124
i CRC prøver (P 0,0001). Sammenlignet med kolorektal kreft vev fra pasienter med lavgradig CRC (Dukes A og B), høyverdig (Dukes C og D) CRC vev uttrykke enda lavere
MIR-124 plakater (P = 0,0156, Fig. 1B ). Disse resultatene tyder på at
MIR-124
kan være involvert i patogenesen av CRC.
(A) QRT-PCR-analyse på uttrykk for MIR-124 i CRC i forhold til tilstøtende ikke-ondartede kolorektal vev fra 90 pasienter (P 0,0001). PCR-reaksjoner ble utført i tre paralleller med RNU6B som intern kontroll. (B) Association of Mir-124 uttrykk nivå med CRC progresjon (P = 0,0156).
STAT3
er et mål på posttranskripsjonelt undertrykkelse av
MIR-124
for å identifisere mål av MIR-124 vi utført differensial proteomikk analyse fra protein av SW480 celler etter behandling med enten Pre-MIR-124 eller Pre-egge~~POS=TRUNC miRNA. Etter separering av proteiner ved isoelektrisk fokusering og SDS-PAGE, plukket vi 12 protein flekker som ble nedregulert mer enn to ganger i cellene behandlet med
Forhånds MIR-124
og deretter identifisert med massespektrometri ( fig. S1 A). Blant dem,
STAT3
har vært innblandet i tumorigenesis.
STAT3
er en viktig transkripsjonsfaktor som regulerer ulike fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert kreft. Knocking ut
STAT3
i tykktarm epitelceller ført til redusert tumordannelse i en modell av kolitt-assosiert CRC i mus [15]. For å teste om STAT3 er et direkte mål for MIR-124 regulering, forsterket vi 3′-UTR-regionen i
STAT3
ved hjelp av PCR fra genomisk DNA SW480 og settes det til den nedstrøms for luciferase reporter-genet i
pMIR- RAPPORT
vektor for luciferase assay, med
pMIR- RAPPORT β-gal
vektor som kontroll (fig. S1Bi). Analyse med TargetScan programvare avslørte en potensiell bindingssete for
MIR-124
innenfor 3’UTR av
STAT3 plakater (Fig. S1Biii). For å teste om
MIR-124
binder seg til 3′-UTR av
STAT3 Hotell og regulerer
STAT3
uttrykk gjennom dette nettstedet, vi også bygget en luciferase vektor smeltet til
STAT3
3’UTR bærer et mutert
MIR-124
respons element (fig. S1Bii). Vi deretter transfektert disse konstruerer inn SW480 celler sammen med
Forhånds MIR-124
eller
før egge miRNA Hotell og målt luciferase aktivitet. Som vist på fig. S1C, transfeksjon av
Forhånds MIR-124
, men ikke kryptert miRNA, redusert luciferase aktivitet av luciferase reporter bærer WT
STAT3
3’UTR betydelig. I kontrast, verken
Forhånds MIR-124
eller
Pre-Egge miRNA
hatt noen effekt på luciferase aktiviteten av luciferase reporter inneholder mutant
MIR-124
bindingssetet . Disse dataene indikerer at
MIR-124 samhandler
direkte med 3’UTR av
STAT3 Hotell og hemmer dens uttrykk.
Vi undersøkte også effekten av overekspresjon
MIR-124
på endogen
STAT3
uttrykk i humane CRC celler. Vi brukte LoVo og SW480-celler med høye nivåer av
STAT3
uttrykk for å utføre dette forsøket. Sammenlignet med celler utransfekterte eller transfektert med
Pre-Egge miRNA
,
Forhånds MIR-124
-transfected menneskelige CRC celler viste redusert
STAT3
uttrykk dokumentert av både farging og Western blotting (fig. 2A, B). Viktigere, nivået av aktiv (tyrosin-fosforylert)
STAT3
ble også redusert i
Forhånds MIR-124
-transfected CRC celler, men ikke kontroll (Fig. 2B). For ytterligere å validere effekten av
MIR-124
på
STAT3
i menneskelige CRC celler, vi nøytralisert endogent uttrykt
MIR-124
hjelp antisensoligonukleotid (
AS- MIR-124
). Etter
MIR-124
stanse,
STAT3
proteinnivå ble oppregulert (Fig. 2C). I sum er disse resultatene viste at
STAT3
er et direkte mål for
MIR-124
.
(A-B) Effekt av
MIR-124
overekspresjon på endogen
STAT3
nivå i menneske CRC celler. (A) SW480 og LoVo celler ble transfektert med
Pre-Mir-124
og farget for
STAT3
av immunfluorescens analyse. Green,
STAT3
protein ble immunostained med anti-
STAT3
; blå, kjerner ble farget med DAPI. (B) SW480 og LoVo celler ble transfektert med
Pre-Mir-124
og
STAT3
protein nivåer ble undersøkt ved Western blotting-analyse. (C) SW480 og LoVo celler ble transfektert med AS-MIR-124.
Stat3
protein nivåer ble undersøkt ved Western blotting. (D) Nivåene av
STAT3
mRNA ble kvantifisert ved QRT-PCR-analyse etter transfeksjon av Pre-MIR-124.
GAPDH
ble brukt som en intern kontroll. Data er representert som gjennomsnitt ± SD ± SD.
mirnas ned-regulere sine målgener ved nedbrytning av målet mRNA eller hemming av mRNA oversettelse. For å undersøke mekanismen for
STAT3
hemming av
MIR-124
, testet vi virkningen av
Forhånds MIR-124
transfeksjon på
STAT3
mRNA stabilitet. Det var ingen forskjell i nivåene av
STAT3
mRNA mellom celler transfektert med
Forhånds MIR-124 Hotell og
Pre-Egge miRNA
, noe som tyder på at MIR-124 ned- regulere
STAT3
uttrykk ved hjelp av å hemme oversettelse (fig. 2D).
MiR-124
hemmer vekst av CRC
Å vite at
MIR-124
er betydelig nedregulert i CRC, vi undersøkt om
MIR-124
kan tjene som en tumor suppressor i CRC. For å utforske effekten av
MIR-124
på kreftcelleoverlevelse, vi transfektert
MIR-124
forløper til menneske CRC cellelinjer SW480 og LoVo, og målt hastighet på spredning og apoptose. Vi har bekreftet transfeksjonseffektiviteten (mer enn 90% SW480 og LoVo-celler) ved hjelp av Cy3-merkede MIR-scramble (Ambion, data ikke vist). Overekspresjon av
MIR-124
indusert celledød dokumentert av avrunding opp morfologi av celler (fig. 3A). Vekst av både kreftcellelinjer ble betydelig hemmet på 48 time etter transfeksjon av
Forhånds MIR-124 plakater (fig. 3B). Induksjon av apoptose etter overekspresjon av
MIR-124
ble bekreftet ved flowcytometri (FCM) (Fig. 3C).
(A) SW480 og LoVo celler ble transfektert med
Pre- MIR-124
eller
Pre-egge~~POS=TRUNC
miRNA og undersøkt av lysmikroskop. (B) Cellene ble transfektert med
Forhånds MIR-124
eller
Pre-Egge
miRNA, og cellevekst ble bestemt av WST1 analysen. Kolonner representerer gjennomsnittet av tre uavhengige tester. Barer, SD. *, P 0,05. (C) Celle apoptose ble målt ved Annexin V og propidium jod flekker.
For å kunne fastslå hvilken rolle
Mir-124
i regulering av tumorvekst in vivo, vi etablert xenograft modell ved injeksjon av SW480-celler subkutant i nakne mus. Før injeksjon ble SW480 celler transfektert med
Forhånds MIR-124
eller
Pre-Egge miRNA
. Uttrykk for
MIR-124
etter transfeksjon ble bekreftet av TaqMan RT-PCR (data ikke vist). Vi fant at 100% av mus injisert med SW480 celler transfektert med
Pre-Egge miRNA
utviklet målbare svulster etter 10 dager med celle inokulasjon. I kontrast, tumor var ikke synlig i to mus injisert med SW480 celler behandlet med
Forhånds MIR-124
. Tumorvekst ble vurdert ved å måle bi-dimensjonale diameter to ganger i uken med calipers. Som vist på fig. 4A, svulster stammer fra celler behandlet med
Forhånds MIR-124
var betydelig mindre enn de som ble behandlet med
Pre-Egge miRNA
, eller mock transfekterte (P 0,01) på dag 40. Gjennomsnittlig tumorvekt for
Pre-Egge miRNA
behandlede og ubehandlede grupper var henholdsvis 4,36 ± 1,69 g og 3,99 ± 1,11 g, mens i mus inokulert med
Pre-MIR-124
behandlede cellene var det 2,42 ± 1,55 g (p 0,01) (figur 4B.).
STAT3
uttrykk nivået ble også redusert i
Forhånds MIR-124
-transfected celle-stammer svulster sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 4C), noe som tyder hemming av
STAT3
av
Forhånds MIR-124
er bevart under fysiologiske tilstand. I samsvar med sin rolle i å fremme celledød in vitro,
Forhånds MIR-124
-transfected celle-avledet tumor viste også økt dramatisk celledød, noe som forklarer den reduserte tumorstørrelse etter transplantasjon (fig. 4D).
(A) SW480 celler ble transfektert med
Forhånds MIR-124
eller
Pre-egge~~POS=TRUNC
miRNA. 24 timer etter transfeksjon, 10
7 levedyktige celler ble suspendert i 100 ul PBS og injisert subkutant i den høyre dorsale korsryggen på nakne mus. Tumorvekst ble vurdert ved å måle todimensjonale diametre to ganger i uken med calipers. (B) Tumorvekt ved slutten av studien. På dag 40 etter behandling, ble alle dyrene avlivet og svulstene ble fjernet og veid. Dataene representerer middelverdi ± SD fra minst 7 dyr pr gruppe. (C)
STAT3
nivå er nedregulert i
Forhånds MIR-124-
behandlet kolorektal tumorvev. Venstre: representative kolorektal kreft vevsdelene farget med antistoff mot
STAT3
. Høyre:
STAT3
fargeintensitet ble gradert av en patolog og analysert ved Fromowitz standard. (D) Venstre: tumorsnitt ble farget av TUNEL analyse for apoptotiske celler. Høyre: kvantifisering av antall apoptotiske celler. Kolonner, mener tre uavhengige tester. Barer, SD, **, P 0,01, ***, P . 0.001
Samlet utgjør disse resultatene viser at
MIR-124
er en tumor suppressor i CRC .
MiR-124
Fungerer som en tumor suppressor av målretting
STAT3
mirnas identifisere sine mål gjennom degenerert samsvarer med målet sekvenser. Som et resultat av hver miRNA kan hemme ekspresjonen av multiple gener. For å forsikre seg om at
STAT3
er faktisk nedstrøms formidler av
MIR-124
«s hemmende effekt på kreftcelleoverlevelse og in vivo tumorvekst, har vi designet siRNA mot
STAT3
