Abstract
Rollen av kalsiumbindende protein, Calbindin 2 (CALB2), i regulering av responsen av kolorektal kreft (CRC) -celler til 5-fluorouracil (5-FU) ble undersøkt. Sanntids RT-PCR og Western blot-analyse viste at CALB2 mRNA og protein ekspresjon ble nedregulert i p53 villtype og p53 null isogene HCT116 CRC-cellelinjer etter 48 timer og 72 timer 5-FU-behandling. Videre har 5-FU-indusert apoptose var signifikant redusert i HCT116 og LS174T CRC cellelinjer som CALB2 ekspresjon var blitt kvittert. Videre undersøkelser viste at CALB2 translocated til mitokondriene følgende 5-FU behandling og at 5-FU-indusert tap av mitokondriemembranen potensial (Δψ
m) ble opphevet i CALB2-forstummet celler. Videre redusert CALB2 stanse 5-FU-indusert cytokrom c og smac utgivelse fra mitokondrier og også redusert 5-FU-indusert aktivering av caspases 9 og 3/7. Av notatet, co-stanse av XIAP vant 5-FU motstand i CALB2-forstummet celler. Til sammen antyder disse resultatene at etter 5-FU behandling i CRC-cellelinjer, er CALB2 involvert i apoptose-induksjon gjennom den indre mitokondrie-reaksjonsveien. Dette indikerer at CALB2 kan være en viktig mediator av 5-FU-indusert celledød. Dessuten kan nedregulering av CALB2 som respons på 5-FU representerer en iboende mekanisme for motstand mot denne anti-kreft legemiddel
relasjon:. Stevenson L, Allen WL, Proutski I, Stewart G, L Johnston, McCloskey K, et al. (2011) Calbindin 2 (CALB2) Regulerer 5-Fluorouracil følsomhet i tykktarmskreft ved Moduler Intrinsic apoptotiske Pathway. PLoS ONE 6 (5): e20276. doi: 10,1371 /journal.pone.0020276
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 14 desember 2010; Godkjent: 28 april 2011; Publisert: May 24, 2011
Copyright: © 2011 Stevenson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var mottatt fra Cancer Research UK (C212 /A7402); og forsknings- og utviklingskontoret Nord-Irland, avdeling for helse, sosiale tjenester og offentlig sikkerhet (RRG /3261/05, RRG 6,42). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Professor Patrick Johnston er grunnlegger og direktør for ALMAC Diagnostics, Craigavon, UK. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i Europa og USA 5-Fluorouracil (5-FU) -baserte kjemoterapiregimer forbli standard behandling for CRC i både adjuvant og avansert sykdom innstillinger. Men responsrater til 5-FU terapi er mellom 10-20% i metastatisk setting [1]. Kombinasjonen av 5-FU med topoisomerase inhibitor, irinotecan (CPT-11), eller DNA-ødeleggende middel, oksaliplatin, har betydelig forbedret responsrater opp til 50% [2] – [3]. Nye midler, så som det monoklonale antistoff cetuximab, har panitumumabs (epidermal vekstfaktor-reseptor-inhibitorer), og bevacizumab (en vaskulær endotelial vekstfaktor-inhibitor) også vist seg fordelaktige effekter i kombinasjon med kjemoterapi [4] – [6]. Til tross for dette, er prognosen for de fleste pasienter med avansert CRC er fortsatt dårlig på grunn av iboende eller ervervet chemoresistance. Derfor er identifiseringen av signalmolekyler involvert i mediering av den reaksjon av CRC til 5-FU er nødvendig for å bestemme de underliggende mekanismer for 5-FU motstand.
Calbindin-2 (CALB2, også kjent som calretinin) er en 29 kDa-kalsium (Ca
2+)-bindende protein av den EF-hånd familie [7], som er en familie av proteiner som inneholder Ca
2 + -binding motivene er sammensatt av to skruelinjer (E og F). Ca
2 + -indusert konformasjonsendringer antyder at CALB2 er sannsynlig å tilhøre en gruppe av Ca
2+ sensor proteiner i denne familien [8]. Hos mennesker er CALB2 primært uttrykt av visse celler i nervesystemet, men kan også bli funnet i ovarieceller [9]. Normal tykktarm epitelceller uttrykker ikke CALB2, men det er funnet i kolon karsinom [10], cellelinjer avledet fra primære tumorer [11] og det er en diagnostisk markør for mesotheliomas [12] – [13]. Rollen CALB2 i moduler nevronale eksitabilitet har konsekvent vist [14]. Imidlertid gjenstår det fysiologiske funksjon av CALB2 i kreftceller til å bli belyst.
Ca
2 + har blitt identifisert som en budbringer som koordinerer endoplasmatiske retikulum (ER) -mitochondrial interaksjoner som regulerer apoptose [15]. Mange typer cellulært stress er kjent for å indusere Ca
2+ utgivelse fra ER og påfølgende Ca
2+ tilstrømningen inn i mitokondriene som resulterer i tap av mitokondriell membranpotensiale fulgt av frigjøring av cytokrom c og smac [16]. Induksjon av ER stress har også blitt rapportert å forbedre kjemoterapi sensibilisering [17]. Mitokondrielle Ca
2 + dynamikk er også involvert i reguleringen av cellulær energi metabolisme og i prosesser som cellemotilitet og frigjøring av nevrotransmittere. Derfor regulering av Ca
2+ frigivelse er under streng kontroll, og mange Ca
2 + -binding proteiner, slik som CALB2, kan fungere nedstrøms for ER Ca
2+ frigivelse for å modulere apoptose eller annen cellefunksjoner.
En DNA microarray studie utført av vår gruppe med HGU133 pluss 2,0 array (Affymetrix, UK) undersøkte uttrykk profiler av p53
+ /+ HCT116 CRC celler behandlet med 5-FU [ ,,,0],18]. I den studien, ble CALB2 identifisert som en potensiell ny regulator av 5-FU respons. Hensikten med denne studien var å undersøke mekanismen som CALB2 regulerer 5-FU respons i CRC celler.
Materialer og metoder
Reagenser
5-FU ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Stamløsninger ble fremstilt i steril PBS og lagret ved 4 ° C før bruk. Den CALB2 antistoff ble kjøpt fra Chemicon International (Temecula, California). Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) antistoff ble kjøpt fra PharMingen (San Diego, California, USA). Smac /DIABLO og Cytokrom c antistoffer ble kjøpt fra BD Biosciences (Oxford, UK). Cytokrom c oksidase underenhet IV (Cox IV) og X-bundet inhibitor av apoptose protein (XIAP) antistoffer ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc (Danvers, MA, USA). Alpha-tubulin antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). GAPDH ble kjøpt fra Abd Serotec (Kidlington, UK). Propidiumjodid ble kjøpt fra Sigma (Poole, UK) og FITC-Annexin V ble kjøpt fra BD Biosciences (Oxford, UK). En pan-caspase-hemmer, Z-VAD (OMe) -FMK, ble kjøpt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland)
Cell kultur
Foreldre HCT116 og isogen p53
-. /- og Bax
– /- CRC cellelinjer ble vennlig levert av professor Bert Vogel (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Den LS174T cellelinje ble kjøpt fra ATCC® (CL-188 ™). De HCT116-cellelinjer ble opprettholdt i McCoys 5A medium (Invitrogen, UK) og den LS174T-cellelinjen ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (Invitrogen, UK). Mediet ble supplert med 10% dialysert føtalt kalveserum, 50 ug /ml penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C.
celleviabilitet assay
cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av en 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT, Sigma) analyse som beskrevet tidligere [19].
real-time RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp av RNA STAT-60 reagens (biogenesis, Poole, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble utført med 8 mikrogram av RNA ved hjelp av en Moloney Murine Leukemi Virus (M-MLV) basert revers transkripsjon kit (Invitrogen, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. Sanntids revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) amplifisering ble utført som beskrevet tidligere [18]. Primer sekvenser var som følger: CALB2 (fremover) 5′-GCAGAGCTGGCGCAGATC- 3 «, CALB2 (revers) 5′-GCTCATCGTACGGCCGGTTCG- 3»; GAPDH (fremover) 5 «-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT- 3» og GAPDH (revers) 5 «- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG -3». Genekspresjon ble normalisert til ekspresjon av GAPDH-genet referanse. Endelige uttrykk verdier ble presentert i forhold til den ubehandlede tids-matchet kontroll.
Western-blotting
Western blots ble utført som tidligere beskrevet [19]. Immundeteksjon ble utført ved anvendelse av primære mus monoklonale antistoffer mot CALB2, PARP, Smac, cytokrom c, XIAP, α-tubulin eller GAPDH i forbindelse med pepperrot peroxidise-konjugert sau anti-mus-antistoff (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, England). En kanin polyklonalt antistoff mot Cox IV ble brukt i forbindelse med et esel anti-kanin-sekundært antistoff (Amersham). Den fluorescerende signal ble påvist ved hjelp av Super Signal kjemiluminescens deteksjon system (Pierce, Rockford, IL), i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot protein kvantifisering
densitometry verdier av proteinbånd ble anskaffet ved hjelp den ChemiDoc-XRS-systemene leveres dokumentasjonssystem (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Bånd ble deretter analysert ved hjelp av Antall One®1-D analyseprogramvare (Bio-Rad Laboratories, Inc., versjon 4.5.2).
Analyse av subG1 /G0
DNA innhold av -celler ble evaluert ved propidiumjodid (PI) farging som tidligere beskrevet [18]. Målinger og analyser ble utført på en FACS Calibur flowcytometer med Cellquest programvare (BD Biosciences, San Diego).
FITC Annexin V /Propidium Iodide analyse
Cellene ble høstet og analysert i henhold til produsentens instruksjoner (BD Biosciences, Oxford, UK). I korthet, ble nivåer av apoptose beregnet som summen av FITC-Annexin V positiv /negativ propidiumjodid (tidlig apoptose) og FITC-Annexin V positiv /propidiumjodid positiv (sen apoptose) cellepopulasjon. Målinger og analyser ble utført på en FACS Calibur flowcytometer med Cellquest programvare (BD Biosciences, San Diego).
Mitokondriell membranpotensialet analyse
For å bestemme tapet av mitokondriemembranen potensial (Δ
ψ
m), ble celler inkubert med 25 nM tetramethylrhodamine, etylester percholate (TMRE) ved 37 ° C i 15 min og oppsamlet ved trypsinering. Celler ble pelletert ved sentrifugering ved 800
g
i 5 min ved 4 ° C og resuspendert i 0,5 ml PBS. Måling og analyse ble utført på en FACS Calibur flowcytometer med Cellquest programvare (BD Biosciences, San Diego).
siRNA transfeksjon
CALB2 målretting (siCALB2) og ikke-måls kontroll (SC) siRNA konstruksjonene ble kjøpt fra Dharmacon Inc. (Chicago, IL). De siCALB2 konstruere sekvenser som ble brukt var GGCUCUGGCAUGAUGUCAAdTdT (fornuft) og UUGACAUCAUGCCAGAGCCdTdT (antisense). De SC konstruere sekvenser som ble brukt var UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT (fornuft) og ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (antisense). En ekstra 4 CALB2 målretting siRNA sekvens ble kjøpt fra Qiagen: siCALB2_5 (SI02660980), siCALB2_6 (SI03190824), siCALB2_7 (SI04157790) og siCALB2_8 (SI04267697). Pre-designet siRNA for XIAP ble kjøpt fra Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA). siRNA transfections ble utført med Oligofectamine reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 5 timer ble cellene behandlet med foreldre ~IC
60 (72 h) doser av 5-FU (5 uM for HCT116 og 20 uM for LS174T). Cellene ble høstet etter 72 timer, og 5-FU behandling før analyse ved strømningscytometri og Western blot.
sub-cellulær fraksjonering
celler ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket i 1 ml iskald mitokondrie isolasjon buffer (200 mM mannitol, 70 mM sukrose, 1 mM etylenglykol bis (α-aminoethylether) –
N
,
N
,
N
1
,
N
1
, -tetraeddiksyre, 10 mM HEPES, 0,5 mg /ml bovint serumalbumin, pH 7,4) før Dounce-homogenisering. Cellerester ble oppsamlet ved sentrifugering ved 800
g
i 10 min. mitokondrie fraksjonen ble pelletert ved sentrifugering ved 10 000
g
i 10 min. Supernatanten inneholdende den cytosoliske fraksjonen ble overført til et nytt rør, og den mitokondrielle pelleten ble resuspendert i 50 ul RIPA-buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) som inneholdt protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).
caspaseaktivering analyser
caspaseaktivering ble målt ved hjelp av caspase Glo 3/7, 8 og 9 analyser (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
Resultatene ble oppsummert som et gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) av 3 uavhengige eksperimenter. Den statistiske betydningen av dataene ble testet ved hjelp av en to-veis ANOVA (GraphPad PRISM® versjon 5.01).
Microarray analyse
5-FU-resistente HCT116 sub-linjen ble generert i vår laboratorium som tidligere beskrevet [20]. HCT116 parentale celler og HCT116 5-FU-resistente datterceller ble behandlet med 5 uM 5-FU i 24 timer for å identifisere gener som er differensielt uttrykte. Total RNA ble isolert fra
in vitro
eksperimenter ved hjelp av RNA STAT-60 Total RNA isolering reagens (Tel-Test) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (5 mikrogram) ble sendt til ALMAC Diagnostics for cDNA syntese, cRNA syntese, fragmentering, og hybridisering på kolorektal sykdom Spesifikk Array (DSA, ALMAC Diagnostics) mikromatriser. Alle
in vitro
analyser ble utført i tre eksemplarer. All microarray data er MIAME kompatibel og alle rå data har blitt deponert i en MIAME kompatibel database (ArrayExpress tiltredelse Nummer: E-MEXP-1691)
Generering av genet lister
I utgangspunktet hver matrise var. normalisert til den midlere signalintensiteten av alle matriser. For de legemiddelbehandlede matriser, den 24 timer 5-FU-behandlede prøvene ble deretter normalisert til de ubehandlede kontrollprøver. I tilfellet av basal forsøket ble 5-FU-resistente matriser normalisert til de HCT116 foreldre matriser. Alle microarray data (E-MEXP-1691) ble deretter filtrert ved hjelp av følgende kriterier: Affymetrix flagg samtaler (P /M i alle prøvene), Cross Gene Feil Modell (gjennomsnittlig base /proporsjonal cut-off), fold endring (1,5 ganger ) og t-test (p 0,05), ble bare gener som passerer alle 4 filtre beholdes og brukes som de endelige arbeids genelists. Tre
in vitro
genelists ble opprettet: 5-FU-induserbar i foreldre, 5-FU-induserbar i 5-FU-resistente og konstitutivt deregulert i 5-FU-resistente
Identifikasjon av. trasé i forbindelse med 5-FU-motstand
KEGG pathway funksjon innenfor Genespring GX (v7.3.1) ble brukt til å identifisere deregulerte trasé passerer en 1,5 ganger endring og t-test (p 0,05) fra microarray
in vitro
genelists.
Association of CALB2 uttrykk med klinisk respons
Vi har lastet ned CALB2 uttrykk data fra offentlig microarray datasett. GraphPad Prism 5 programmet ble brukt til å generere Kaplan-Meier overlevelseskurver basert på median CALB2 uttrykk over hver svulst scenen eller kombinert iscenesettelse. Disse datasettene inngår en CRC kohort (GSE12945, PMID: 19399471) av 62 pasienter (13 scene 1, 23 trinn 2, 21 trinn 3 og 5 stadium IV) elektiv standard onkologisk reseksjon [21] og en brystkreft kohort (GSE9893; PMID: 18347175) av 132 tamoxifen-behandlede pasienter) [22]
Resultater
CALB2 uttrykk i HCT116 cellene er nedregulert med 5-FU behandling
En tidligere. microarray studie av vår gruppe rapporterte CALB2 genuttrykk i HCT116 cellelinje til å være oppregulert etter 24 timer 5-FU behandling i forhold til en ubehandlet 0 h kontroll [18]. Men videre analyser viste at konstituerende CALB2 uttrykk øker over tid (Fig. S1), derfor har vi re-analysert 5-FU-indusert mRNA endringer i CALB2 genuttrykk nivåer i forhold til en ubehandlet, tids matchet kontrollgruppe. I motsetning til vår tidligere studie, denne metoden viste at behandling med en ~IC
60 (72 h) dose (5 uM) av 5-FU faktisk resulterte i en signifikant, tidsavhengig nedregulering av CALB2 genekspresjon i p53
+ /+ HCT116-cellelinjen (fig. 1A). I p53
– /- HCT116-cellelinjen, CALB2 genekspresjon ble ikke signifikant endret etter 24 timer 5-FU-behandling, men var signifikant nedregulert ved 48 timer og 72 timer (figur 1B.). Western blot-analyse viste at denne nedreguleringen ga seg utslag i redusert CALB2 protein ekspresjon i 5-FU-behandlede celler (fig. 1C). Disse resultatene tyder på at CALB2 ekspresjon i HCT116-celler er akutt nedregulert som respons på 5-FU-behandling, og at denne modulering er ikke avhengig av p53.
Sanntids RT-PCR kvantifisering av CALB2 mRNA-nivåer i isogene (A) p53
+ /+ og (B) p53
– /- HCT116-celler etter 24 timer, 48 timer og 72 timer, og 5-FU behandling (foreldre ~IC60
(72 h) dose på 5 mikrometer). Fold endring i uttrykket verdier står i forhold til den ubehandlede tids matchet kontrollgruppe. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, NS: ingen signifikant forskjell, ** p 0,01, *** p 0,001. (C) Western blot analyse av CALB2 i HCT116 cellelinjer etter 72 timer 5-FU (5 mm) behandling og tilhørende densitometry data av CALB2 uttrykk i forhold til GAPDH lasting kontroll.
5-FU indusert nedregulering av CALB2 er caspase-uavhengig
for å avgjøre om nedgangen i CALB2 protein som svar på 5-FU var caspase-avhengige, HCT116 foreldre celler ble behandlet med en ~IC
60 (72 h ) dose (5 uM) av 5-FU alene eller i kombinasjon med en 10 uM dose av et pan-kaspaseinhibitor (Z-VAD) i 72 timer. Inhibering av kaspase-aktivitet etter Z-VAD behandling ble validert ved anvendelse av en caspase 3/7-spesifikk aktivitetsanalyse (fig. 2A). 5-FU behandling signifikant (p 0,05) øket kaspase 3/7 aktivitet ved ~4 fold, sammenlignet med de ubehandlede kontroller, og dette ble fullstendig opphevet ved Z-VAD. Viktigere, har Z-VAD ko-behandling ikke hemme 5-FU-indusert nedregulering av CALB2 genekspresjon (fig. 2B) eller protein ekspresjon (Fig. 2C), som indikerer at CALB2 nedregulering ikke er kaspase-avhengig.
p53
+ /+ HCT116-celler behandlet med en ~IC60
(72 h) dose av 5-FU alene eller i kombinasjon med en 10 uM dose av pan-kaspaseinhibitor Z-VAD (OMe ) -FMK (Z-VAD) i 72 timer (A) Caspase 3/7 aktiviteten~~POS=HEADCOMP ble kvantifisert ved anvendelse av et luciferase reporter basert assay. Verdier er RFU lese-outs i forhold til celle levedyktighet, som bestemmes av MTT. (B) Real-time RT-PCR kvantifisering av CALB2 mRNA (fold-endring i forhold til ubehandlet, tids matchet kontrollgruppe). (C) Western blot analyse av CALB2 uttrykk og tilsvarende densitometry data av CALB2 uttrykk i forhold til GAPDH lasting kontroll.
CALB2 lyddemping overfører 5-FU motstand
Siden CALB2 er ned- reguleres etter 5-FU behandling, undersøkte vi dens rolle ved formidling av 5-FU-respons. En genet Slå tilnærmingen ble anvendt for å bestemme funksjonen av CALB2 i 5-FU-indusert apoptose. CALB2 slå ned av siRNA ble bekreftet ved Western blot (Fig. 3A). siRNA-mediert stanse av CALB2 ekspresjon ble ytterligere forbedret med 5-FU ko-behandling, mest sannsynlig på grunn av undertrykkelse av CALB2 mRNA som respons på 5-FU behandling (Fig. 1A). PARP-spaltning, en indikator på celledød, ble observert i kontrollgruppen siRNA-transfekterte p53
+ /+ HCT116-celler etter 5-FU-behandling. Dette ble helt avskaffet i CALB2-forstummet celler, noe som indikerer redusert 5-FU-indusert død. Disse resultatene ble understøttet ved hjelp av strømningscytometri data som indikerte at nivået av 5-FU-indusert apoptose ble signifikant redusert (p 0,05) fra ~ 30% i siRNA kontrollcellene til ~17% i CALB2-stilnet p53
+ /+ HCT116-celler (fig. 3B). I p53
– /- HCT116-cellelinjen, 5-FU-indusert apoptose ble også signifikant redusert (p 0,05), fra ~14% i siRNA kontrollcellene til ~9% i de CALB2-stilnet celler (Fig . 3C). Den reduserte følsomhet av p53
– /- HCT116-celler til 5-FU er tidligere blitt bemerket av vår gruppe og andre [23], [24]. ble observert tilsvarende effekter i en annen CRC cellelinje, lyddemping LS174T, hvor apoptose ble betydelig økt etter en ~IC
60 (72 h) dose på 20 mikrometer 5-FU og CALB2 betydelig redusert dette (Fig 3D, p. 0,01 ). CALB2 slå ned ble bekreftet ved Western blot (Fig. 3D innfelt) og som i HCT116 cellelinjer, CALB2 proteinnivået var nedregulert etter 5-FU behandling. For å utelukke off-target effekter av CALB2-målretting siRNA, vi brukte Annexin /PI strømningscytometri for å bestemme effekten av en ytterligere 4 CALB2-målretting siRNA-sekvenser på 5-FU-indusert apoptose i p53
+ /+ HCT116-celler (fig. 3E). En betydelig reduksjon i 5-FU-indusert apoptose ble observert med alle fire ytterligere CALB2 siRNA-sekvenser og CALB2 lyddemping ble bekreftet ved Western blot-analyse (innfelt).
(A) Western blot-analyse av CALB2 og PARP i p53
+ /+ HCT116-cellelinjen etter transfeksjon med kontroll siRNA (-) eller CALB2-målretting siRNA (+) og 72 timer samtidig behandling med ~IC60
(72 h) dose av 5-FU. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Propidiumjodid flowcytometrisk analyse som viser prosentdelen av cellepopulasjonen i sub-G1 /G0 for (B) p53
+ /+ og (C) p53
– /- HCT116-celler etter transfeksjon med kontroll siRNA (SC) eller CALB2 målretting siRNA (siCALB2) og 72 h samtidig behandling med 5 mikrometer 5-FU. (D) Annexin V /propidiumjodid- flowcytometrisk analyse av LS174T CRC cellelinje etter transfeksjon med kontroll siRNA (SC) eller CALB2 målretting siRNA (siCALB2) og 72 h samtidig behandling med ~IC60
(72 h) dose av 5-FU (20 uM). ** P 0,01, feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM. (Innfelt) Western blot analyse av CALB2 uttrykk i LS174T. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (E) p53
+ /+ HCT116 celler etter transfeksjon med kontroll siRNA (SC), CALB2 målretting siRNA (siCALB2) eller ekstra CALB2 målretting siRNA sekvenser (siCALB2_5, siCALB2_6, siCALB2_7 og siCALB2_8) og 72 h samtidig behandling med 5 uM 5-FU. (Innfelt) Western blot analyse av CALB2 uttrykket etter 72 h transfeksjon med kontroll siRNA (SC) eller CALB2 målretting sirnas i p53
+ /+ HCT116-celler. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting.
5-FU motstand er forbundet med de-regulering av Ca
2+ signale
Identifiseringen av CALB2 rolle ved formidling 5-FU-indusert apoptose sammen med sin Ca
2 + bindende eiendom førte oss å undersøke effekten av 5-FU på Ca
2 + signalering generelt. Transkripsjonelle profilering forsøk ble utført i HCT116 paren og 5-FU-resistente dattercellelinjer før og etter behandling med 5 uM 5-FU i 24 timer. Microarray analyse identifiserte 1389 gener i HCT116 foreldre celler og 922 gener i 5-FU-resistente dattercellene som ble endret (≥1.5-fold, p 0,05) etter 5-FU behandling. Også, 1329 gener ble identifisert som konstitutivt endret (≥1.5-fold, p 0,05) mellom de HCT116 foreldrecellene og 5-FU-resistente datterceller. De resulterende genelists ble deretter brukt for pathway analyse bruker KEGG pathway funksjon innenfor Genespring GX (v7.3.1). Pathway analyse identifiserte 60 baner i HCT116 foreldrecellene og 24 baner i 5-FU-resistente datterceller som ble endret (≥1.5-fold, p 0,05) etter 24 timer 5 uM 5-FU-behandling. Også, 49 banene ble identifisert som konstitutivt endret (≥1.5-fold, p 0,05) mellom de HCT116 foreldrecellene og 5-FU-resistente datterceller (tabell S1). Resultatene fra sti-analyse viste at 11 banene ble allment endret i hver av de tre genelists (tabell 1). Av særlig relevans for denne studien var Ca
2 + signal- og apoptose trasé, som ble endret i både foreldrenes og 5-FU-resistente celler følgende 5-FU behandling og også basalt deregulert i 5-FU-resistente celler sammenlignet med paren. Dette tyder på at Ca
2 + alarm og apoptose kan være formidlere av 5-FU følsomhet /resistens i denne innstillingen.
CALB2 lyddemping opphever 5-FU-indusert apoptose gjennom indre vei
Gitt Ca
2+ bindingsegenskapene til CALB2 og integral rolle Ca
2+ signalering i den indre apoptotiske reaksjonsvei, er rollen til CALB2 ved formidling av 5-FU-indusert, mitokondrie-regulert apoptose ble videre undersøkt. Undersøkelse av HCT116 sub-cellulære fraksjoner viste at i ubehandlede celler, ble CALB2 lokalisert i cytosol og er ikke forbundet med mitokondrier (Fig. 4A). Men etter 72 timer 5-FU behandling, CALB2 nivåer i cytosol ble redusert mens mitokondrielle CALB2 nivåene økt, noe som indikerer 5-FU-indusert translokasjon CALB2 til mitokondriene. Western blot-analyse av α-tubulin og CoxIV demonstrert renheten av disse sub-cellulære fraksjoner (fig. S2). Disse resultatene demonstrerer en induserbar assosiasjon mellom CALB2 og mitokondriene som respons på 5-FU-behandling.
(A) Western blot-analyse av CALB2 i mitokondrie og cytosoliske fraksjoner av p53
+ /+ HCT116-celler etter transfeksjon med kontroll siRNA (-) eller CALB2 målretting siRNA (+) og 72 h samtidig behandling med 5-FU. Cox IV ble anvendt som en kontroll mitokondrie lasting og a-tubulin ble anvendt som en kontroll cytosoliske lasting. (B) TMRE flowcytometrisk analyse som viser hvor mange prosent av isogen p53
+ /+ og p53
– /- HCT116-celler med tap av Δψ
m (% depolariserte) Følgende transfeksjon med kontroll siRNA (sc) eller CALB2 målretting siRNA (siCALB2) og 72 h samtidig behandling med 5 mikrometer 5-FU. ** P 0,01, feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM. (C) TMRE flowcytometri eksperiment gjentatt med en andre siCALB2 sekvens. (D) Western blot-analyse av SMAC og cytokrom C i mitokondrie og cytosoliske fraksjoner av 5-FU-behandlede p53
+ /+ HCT116-celler. Cox IV og α-tubulin ble brukt som laste kontroller. (E) caspase aktivitetsanalyser i p53
+ /+ HCT116-celler. RFU-verdier ble normalisert til cellenes levedyktighet (MTT-analyse) og uttrykt som fold-endring RFU i CALB2 stilnet cellene i forhold til den siRNA kontroll (SC) celler. Feilstolpene representerer gjennomsnitt ± SEM. (F) Annexin V /propidiumjodid strømningscytometrisk analyse av apoptotisk p53
+ /+ HCT116-celler følgende CALB2 eller XIAP stanse alene eller i kombinasjon. Celler ble ko-behandlet med 5 uM 5-FU i 72 timer som indikert. * P 0,05, ** p 0,01, feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM. (Innfelt) Western blot-analyse av XIAP uttrykk etter transfeksjon med 10 nM kontroll siRNA (-) eller 10 nM XIAP målrettet siRNA (+). GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Sammenhengen mellom CALB2 og mitokondriene følgende 5-FU behandling bedt oss om å undersøke nærmere rollen som den indre apoptotiske sti i 5-FU motstand. Den pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem, er Bax en viktig initiativtaker til mitokondrie-mediert apoptose. Vi undersøkte derfor HCT116 foreldre og isogene Bax null-celler etter behandling med foreldre ~IC
60 (72 h) dose av 5-FU i 72 timer. Foreldre ~IC
60 (72 h) dose av 5-FU forårsaket en ~3 ganger økning i apoptose i HCT116 foreldrecellelinje (p 0,01), men hadde ingen signifikant effekt på nivåene av apoptose i Bax null-celler (data ikke vist). Disse resultatene bekrefter tidligere funn [25], [26] som Bax og den iboende apoptotiske sti er viktige effektorer av 5-FU-indusert apoptose.
Tap av mitokondriemembranen potensial (Δ
ψ
m) med samtidig utgivelse av SMAC og cytokrom c fulgt av caspase 9 og 3/7 aktivisering er observert under apoptose via indre vei. Derfor TMRE, et fluorescerende fargestoff for å måle membranpotensialet av mitokondrier ble anvendt for å bestemme Δ
ψ
m ved strømningscytometri (Fig. 4B). 5-FU-indusert tap av Δ
ψ
m, som indikert ved ikke-fluorescerende celler ble signifikant redusert (p 0,001) i den CALB2-stilnet p53
+ /+ HCT116-celler . 5-FU-indusert tap av Δ
ψ
m ble også signifikant redusert (p 0,05) i CALB2-forstummet p53
– /- celler. Denne effekten ble bekreftet med en andre CALB2 siRNA sekvens (fig. 4C), utelukker off-target effekter av CALB2 siRNA. I tillegg, Western blot-analyse av sub-cellulære fraksjoner viste at 5-FU-indusert tap av SMAC og cytokrom c fra mitokondrie fraksjonen ble opphevet i CALB2-stilnet celler (fig. 4D). Dette var samtidig med reduserte nivåer av SMAC og cytokrom c slippes ut i cytosol i respons til 5-FU i CALB2-forstummet celler. Videre er 5-FU-indusert aktivering av kaspase 9 og 3/7, som målt ved hjelp av luciferase-rapportørbaserte aktivitetsanalyser, ble signifikant redusert i de CALB2-stilnet celler (fig. 4E). Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i caspase 8 aktivering mellom CALB2-forstummet celler og siRNA kontroller følgende 72 timer 5 mikrometer 5-FU behandling (data ikke vist). Disse resultatene tyder på ytterligere en rolle for CALB2 i regulering av 5-FU-indusert, er iboende apoptotisk veien.
5-FU følsomhet i CALB2-silenced celler restaurert av XIAP co-tie
eksperimentene beskrevet ovenfor viser at vedlikehold av mitokondriemembranen potensial, oppbevaring av SMAC og cytokrom c fra mitokondriene med samtidig reduksjon i caspase aktivitet er alle forbundet med økt 5-FU motstand i CALB2-forstummet celler, noe som tyder dysfunksjonell signalering via den indre apoptotiske sti. En tidligere studie av vår gruppe viste at apoptose Resistens med en kompromittert indre apoptotiske sti kan omgås følgende XIAP lyddemping. XIAP hemmer caspase 9 aktivisering gjennom sin BIR3 domene og caspase 3 aktivisering gjennom sin BIR2 domene. Smac frigivelse forstyrrer interaksjonen av XIAP med caspase 9 og caspase 3 [27], som fører til aktivering av slike caspaser og påfølgende apoptose. Vi hypotese at stanse XIAP kan overvinne motstand mot 5-FU forårsaket av CALB2 stanse ved å omgå blokken i indre apoptotiske sti. Derfor ble effekten av co-silencing XIAP og CALB2 på 5-FU respons undersøkt. XIAP tie i HCT116 cellene ved hjelp av en XIAP målretting siRNA ble bekreftet ved Western blot (Fig. 4F innfelt). Den apoptotiske fraksjon av celler som ble identifisert ved strømningscytometri med Annexin V og propidiumjodid. Dette igjen demonstrert at 5-FU-indusert apoptose ble signifikant redusert (p 0,05) i CALB2-stilnet-celler (figur 4F.), Mens 5-FU-indusert apoptose var signifikant økt i XIAP-dempede celler (p 0,05). Viktigere, ble motstanden mot 5-FU-indusert apoptose gitt av CALB2 lyddemping vunnet av co-stanse XIAP (p 0,01). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
