Abstract
Forskjellige pattedyrceller, inkludert kreftceller, bod ekstracellulære vesikler (EVS), også kjent som exosomes og mikrovesikler, inn i omkringliggende vev. Disse elbiler spille roller i tumorvekst og metastase ved å fremme angiogenese. Imidlertid er detaljert mekanismen for hvordan kreft-avledede EV utløse endotelial celleaktivering er ukjent. Her gir vi bevis for at tidlig vekstrespons-en (EGR-1) aktivering i endotelceller er involvert i angiogene aktivitet av kolorektal kreft celle-stammer elbiler. Både RNA-interferens-mediert nedregulering av Egr-en og ERK1 /2 eller JNK inhibitor betydelig blokkert EV-mediert Egr-en aktivering og endotelceller migrasjon. Videre lipid flåte endocytose hemmer effektivt blokkert endothelial Egr-en aktivering og migrasjon indusert av kreft-avledet elbiler. Våre resultater tyder på at Egr-en aktivering i endotelceller, kan være en viktig mekanisme som er involvert i den angiogene aktivitet av kreft-avledet EV. Disse funnene vil forbedre vår forståelse for de proangiogenic aktiviteter elbiler i ulike patologiske tilstander som kreft, hjerte- og karsykdommer, og nevrodegenerative sykdommer
Citation. Yoon YJ, Kim DK, Yoon CM, Park J, Kim YK, Roh TY, et al. (2014) Egr-en aktivering av Kreft-Avledet ekstracellulær Blemmer Fremmer endotelcelle Migration via ERK1 /2 og JNK signalveier. PLoS ONE 9 (12): e115170. doi: 10,1371 /journal.pone.0115170
Redaktør: Shilpa J. Buch, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 24 juni 2014; Godkjent: 19 november 2014; Publisert: 12.12.2014
Copyright: © 2014 Yoon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Midt-karriere Forsker Program gjennom NRF finansiert av MEST (nr 2014023004), BK21 Plus (10Z20130012243) finansiert av Kunnskapsdepartementet , Korea, og stiftelsen National Research of Korea (2011-0030049). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Forskjellige typer av pattedyrceller, slik som kreftceller, makrofager, endotelialceller, blodplater, og epitelceller frigjøre ekstracellulære vesikler (EVS) i sine omgivelser fra plasma og endosomale membran kamrene [1] – [4] . Disse pattedyr EV, også kjent som exosomes og mikrovesikler, er sfæriske bilayered proteolipids med en gjennomsnittlig diameter på 40-250 nm og er beriket med ulike bioaktive bestanddeler, blant annet proteiner, lipider og genetisk materiale [1] – [9]. Økende bevis har vist at EV spille pleiotrope funksjoner i intercellulær kommunikasjon.: EV stimulere mottakercellene ved aktivering av en reseptor og overføring av membranproteiner, signalmolekyler, mRNA, og mirnas [4] – [9]
el-biler har ofte blitt referert til som «cellulær støv», selv om cellene felle EV enten konstitutivt eller på en regulert måte [1] – [9]. Videre er proteiner, mRNAer eller mirnas i el-biler har ulik sammensetning avhengig av tilstandene til donorcellene [1], [4]. Nylig har vår gruppe vist at proteiner av human kolorektal kreftcelle-avledede EV er innbyrdes forbundet via fysiske interaksjoner og klynge i funksjonelle moduler som er involvert i EV biogenese og funksjon [4], [10]. Videre er utskillelsen av el-biler en universell cellulær prosess som skjer fra enkle organismer (Archea eller Gram-negative og Gram-positive bakterier) til komplekse flercellede organismer, noe som tyder på at dette EV-mediert kommunikasjon er evolusjonært konservert [9], [11] – [1. 3]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at elbiler spille ulike roller i interkommunikasjon [6], [10]. Imidlertid er de patofysiologiske rolle av el-biler ikke fullstendig forstått.
Angiogenese, dannelsen av nye blodkar fra på forhånd eksisterende blodkar, er en kompleks og flertrinns prosess som omfatter adhesjon, migrasjon, invasjon, proliferasjon og differensiering av endoteliale celler [14], [15]. Dette neovaskularisering forekommer under forskjellige normale og patologiske tilstander, [14]. For eksempel, er angiogenese essensielt for tumorvekst og metastase ved å tilveiebringe oksygen og næringsstoffer til den voksende tumor [15]. I svulsten mikromiljøet, en heterogen populasjon av celler, inkludert kreft celler, endotelceller, fibroblaster, og immunceller modulerer et miljø som er gunstig for tumorvekst og invasjon [16] – [18]. Disse kreft og stromale celler utskiller vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), fibroblast-vekstfaktor 2 (FGF2), tumor nekrose faktor-α (TNF-α), og IL-6 inn i det omkringliggende området, og disse faktorene bidrar til tumor-assosiert angiogenese [16] -. [19]
i tillegg til disse proangiogenic løselige faktorer, celler som omfatter tumorvevet utskiller EV inn i det ekstracellulære miljø og disse felle elbil spille flere roller i tumorvekst og metastase ved å fremme angiogenese, tumorinvasjon, og immun flukt [4] – [8], [20] – [23]. Etter den første rapporten om angiogene aktiviteter elbiler avledet fra HT1080 menneskelig fibrosarkom og DU-145 menneskelige prostata carcinoma celler [5], flere studier bekreftet at elbiler avledet fra kreftceller, fibroblaster og kreftstamceller fremme
in vitro
og
in vivo
angiogenese [4], [8], [24] – [28]. Disse angiogene aktiviteter EVs formidles av vesikulær lipid (er), proteiner, inkludert reseptorer og tetraspanin proteiner, mRNA, og mirnas. Imidlertid er detaljert mekanismen for hvordan EV fremkaller angiogen aktivitet har ikke blitt grundig studert.
tidlig vekstrespons-1 (EGR-1), en umiddelbar tidlig gen og et sink finger transkripsjonsfaktor, spiller en avgjørende rolle i angiogenese [29] – [32]. I tillegg til serum eksponering, kan Egr-en hurtig og forbigående indusert av cytokiner, vekstfaktor, og miljømessige påkjenninger, bl.a. hypoksi, fluidskjærspenning, og vaskulær skade [33], [34]. EGR-1 regulerer ekspresjonen av proangiogenic gener, slik som VEGF, FGF2, og IL-6 i endotelceller eller TNF-α i makrofager [31], [34] – [36]. Innenfor tumorvev kan endotelceller, kreftceller, fibroblaster, og tumor-infiltrerende makrofager uttrykke Egr-1. Videre microvessel tettheter i tumorvev oppnådd fra Egr-1-manglende mus er lavere enn dem som ble oppnådd fra villtype-mus [37] og kar-liknende struktur dannelse i tumorvevet ble undertrykket ved DNAzymes som er rettet mot Egr-1 mRNA [31] Dette tyder på at Egr-en spiller viktige roller i tumorvekst og angiogenese. I denne forbindelse har flere studier rapportert at Egr-1-ekspresjon i kreftceller, endotelceller og makrofager er relatert til tumorprogresjon [32], [36] – [38]. Sammen er disse funnene tyder på at Egr-en spiller viktige roller i tumor-assosiert angiogenese og tumorprogresjon.
I denne rapporten gir vi bevis for at Egr-en aktivering i endotelceller bør være en viktig mekanisme involvert i angiogen aktivitet av kreft-avledet elbiler. Vi fant ut at Egr-en aktivering av kolorektal kreft celle-stammer elbiler forfremmet endotelceller migrasjon via ERK1 /2 og JNK signalveier og lipid flåte endocytose.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneske kolorektal adenokarsinom (SW480), tykktarmskreft (HCT116), lunge adenokarsinom (A549), og fibrosarkom (HT1080), og normal bronkial epitel (BEAS-2B) celler ble opprettholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. Human neuroblastom (SH-SY5Y) og prostata-carcinom (PC3) celler ble opprettholdt i MEM (Invitrogen) supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. SW480, HCT116, A549, HT1080, SH-SY5Y, PC3, og BEAS-2B ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Menneske mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1s) ble dyrket i endotel vekst Medium-2 (EGM-2; Lonza, Walkers, MD, USA) [5]. Humane navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) ble isolert fra nylig levert navlestrenger og opprettholdt som tidligere beskrevet [39]. HUVECs ble dyrket i medium 199 (Invitrogen) supplert med 20% FBS, 3 ng /ml FGF2 (R GAPDH omvendt, 5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3 «; EGR1 fremover, 5»-CCGCAGAGTCTTTTCCTGAC-3 «; EGR1 omvendt, 5»-AGCGGCCAGTATAGGTGATG-3 «. HMEC-1s (2 x 10
5-celler) sådd ut i 6-brønners cellekulturplate ble behandlet med EV (1 pg /ml, 2,0 ml) i 0,5, 1, 1,5, 2 og 4 timer. RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). For real time RT-PCR, ble total RNA (100 ng) forsterket med en One Step SYBR RT-PCR Kit (Takara Bio, Tokyo, Japan) med en LightCycler 2,0 PCR system (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Amplifikasjon ble utført ved å oppvarme prøvene til 50 ° C i 2 minutter, deretter ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av gjentatte sykluser ved 95 ° C i 15 sek, 55 ° C i 10 sek, og 72 ° C i 10 sek, for totalt 45 sykluser. Den komparative Ct metoden ble brukt for relativ kvantifisering av mål genuttrykk mot at en husholdningsgenet, GAPDH [40].
Egr-en kjernefysisk trans
HMEC-1s ble belagt i 24- brønncellekulturplater (Corning Inc.) med dekkglass (Fisher Scientific) ved en tetthet på 5 x 10
4 celler per brønn og fikk feste seg over natten. Celler ble behandlet med SW480-avledede EV (1 pg /ml, 0,5 ml), fiksert med 4% paraformaldehyd, og inkubert med kanin anti-Egr-1-antistoff (Cell Signaling Technology, Hitchin, Storbritannia), fulgt av geite-anti- AlexaFluor488 kanin-IgG-antistoff (Invitrogen). Kjerner ble kontra med Hoechst (Sigma-Aldrich). Bilder ble visualisert under en FV1000 Olympus konfokal mikroskop (Olympus) og anskaffet ved hjelp FV1000-ASW 3.0 programvare (Olympus). Prosentandelen av Egr-1-positive celler ble kvantifisert ved å telle celler med co-lokalisert fluorescens signaler.
For å undersøke effekten av signale hemmere (BIOMOL Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA) eller metyl- β-cyklodekstrin (MβCD; Sigma-Aldrich) på Egr-en nukleær translokasjon, ble HMEC-1s behandlet med ERK1 /2 inhibitor (PD98059, 20 uM), p38 MAPK-inhibitor (SB203580, 10 uM), JNK inhibitor (SP600125, 20 uM), Akt inhibitor (BML-257, 20 uM), eller MβCD (10 mM) i nærvær eller fravær av SW80-avledede EV (1 pg /ml).
RNA interferens-mediert nedregulering av Egr -1
Liten interfering RNA (siRNA) av Egr-en (Bioneer, Daejeon, Korea) til en endelig konsentrasjon på 50 nM ble transfektert inn HMEC-1s bruker Welfect-Q (Welgene, Taegu, Korea). Ikke-stanse egge siRNA ble anvendt som den negative kontroll. Etter 48 timer ble cellene anvendt for sanntids RT-PCR-analyse for å bestemme nivået av Egr-1 mRNA-ekspresjon, Egr-1 nukleære trans analyser, og skrape sårhelende analyser. SiRNA-sekvensene var som følger: egge siRNA, 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 «; EGR-1 siRNA-1, 5»-CAGUAUCAUCUCCAUCAUA-3 «; EGR-1 siRNA-2, 5»-AGUUUGCCAGGAGCGAUGA-3 «; EGR-1 siRNA-3, 5»-GUGCAAUUGUGAGGGACAU-3 «.
EV opptak
SW480-avledet elbiler ble merket med Dil (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, SW480-avledede EV (100 ug) ble inkubert med DII (1 uM) i 15 minutter ved 37 ° C og sentrifugert ved 100.000
g
i 2 timer ved 4 ° C (type 90 Ti-rotor med fast vinkel med en k-faktor på 126,4). Pelletene, DII-merkede EV, ble vasket med fosfatbufret saltoppløsning, og etter ultrasentrifugering ved 100 000
g
i 2 timer ved 4 ° C (type 90 Ti-rotor med fast vinkel med en k-faktor på 126,4), ble resuspendert i fosfatbufret saltvann. HMEC-1s ble forbehandlet uten eller MβCD (10 mM) i 0,5 timer, og deretter inkubert med dii-merkede SW480-avledede EV (1 pg /ml, 0,5 ml) i 1 time. Cellene ble deretter fiksert med 4% paraformaldehyd og kjerner ble farget med Hoechst (Sigma-Aldrich). Bilder ble visualisert under en FV1000 Olympus konfokal mikroskop (Olympus) og anskaffet ved hjelp FV1000-ASW 3.0 programvare (Olympus).
Statistiske analyser
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D.
P
verdiene ble beregnet fra enveis eller toveis variansanalyse (ANOVA) med Bonferroni korreksjon, basert på sammenligninger med de riktige kontrollprøvene testet samtidig.
Resultater
SW480-avledet elbiler fremme
in vivo Hotell og
in vitro
angiogenese
elbiler utgitt av SW480 celler ble renset fra kultursupernatantene ved en kombinasjon av differensialsentrifugering , ultrafiltrering ved bruk av et 100-kDa hulfibermembran, ultrasentrifugering på sukrose puter, og iodixanol tetthetsgradienter som rapportert [8]. I samsvar med forrige undersøkelse [8], de rensede elbiler hadde en tetthet på ~1.098 g /ml og næret CD81 og CD63, EV markørproteiner (Fig. 1a). Men disse rene elbiler ikke inneholde GM130 (en
cis
-Golgi protein) og cytokrom
c plakater (en mitokondrie protein som finnes i apoptotiske legemer): disse to proteiner er velkjent ikke- vesikulær proteiner (fig. 1B). Vi først viste at elbiler avledet fra SW480 human kolorektal adenokarcinomceller indusert
in vivo
neovaskularisering (Fig. 1C og 1D). Når SW480-avledet EV innenfor Matrigel ble injisert subkutant i mus, ble det observert en massiv dannelse av CD31-positive fartøy-lignende strukturer (fig. 1C). I motsetning til dette ble ingen åpenbare kar dannelse detektert i Matrigel uten EV. EVs signifikant induserte en 10,4-ganger økning i den CD31-positive området Matrigel sammenlignet med den ubehandlede kontroll (Fig. 1D).
(A, B) EV utgitt av SW480-celler ble renset fra kultursupernatanter av en kombinasjon av differensialsentrifugering, ultrasentrifugering på sukrose puter, og iodixanol tetthet stigninger. Hver fraksjon av gradienter iodixanol tetthet ble analysert ved Western blotting til å påvise CD81 og CD63, markørproteiner av el-biler (A). De rensede elbiler i fraksjon 3 ble analysert ved Western blotting å oppdage ikke-EV markørproteiner (GM130 og cytokrom
c
). SW480-avledet hele cellelysat (WCL, 10 mikrogram) og SW480-avledet elbiler (EVS, 10 mikrogram) ble lastet for Western blotting-analyse (B). (C, D) Matrigel i nærvær eller fravær av SW480-avledede EV (20 ug) ble injisert subkutant i C57BL /6 mus. Etter 7 dager, hel-mount farging av Matrigel med anti-CD31-antistoff ble utført (n = 5). Representative confocal Z-stack bilder av hele mounts farget for CD31 (grønn) er vist i panel C. Scale barer representerer 100 mikrometer. Fluorescensstyrkene CD31 farging av Z-stabelen planet for Matrigel ble målt som beskrevet i fremgangsmåtene (D). (E) trekkende aktivitet av SW480-avledet EV ble evaluert ved en ripe sårhelende analysen. Sammenflytende HMEC-1s var riper og behandlet med SW480-avledet elbiler (1 mg /ml); Da antallet migrerte celler i ribbet sonen ble evaluert etter 12 timer (n = 3). (F) Proliferativ aktivitet av SW480-avledet EV (1 ug /mL) ble evaluert ved å vurdere mitose markør PH3. Etter 24 timer ble den PH3 og kjerner farget med anti-antistoff og PH3 Hoechst, henholdsvis og evaluert av konfokal mikroskopi. Prosentandelen av PH3-positive celler i HMEC-1s ble kvantifisert ved telling av cellene med ko-lokaliserte fluorescenssignaler (n = 3). Som en positiv kontroll ble HMEC-1s behandlet med EGM-2-medium supplert med forskjellige angiogene faktorer slik som EGF, FGF2, VEGF, og IGF1. Data er representert som gjennomsnitt ± SD. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001; N.S., ikke signifikant.
Vi neste undersøkte proangiogenic aktiviteten SW480-avledet elbiler på humane endotelceller, HMEC-1s
in vitro
. Skrape sårhelende analyser avslørte at EV induserte en 4,1-ganger økning i antallet migrerte endotelceller inn i ribbet sone, sammenlignet med den ubehandlede kontroll (fig. 1E). Videre EV potent stimulert proliferasjon av endotelceller: andelen av PH3-positive celler øket 8,9 ganger i forhold til det av de ustimulerte celler (Fig 1F.). Den positive kontrollen, EGM-2 supplert med forskjellige angiogene faktorer slik som EGF, FGF2, VEGF, og IGF1, også indusert både endotelial cellemigrering og proliferasjon. Trekk og proliferativ aktiviteter SW480-avledet elbiler ble også observert i andre endotelceller, HUVECs (data ikke vist). Derfor våre data indikerer at SW480-avledet elbiler har
in vivo Hotell og
in vitro
angiogene aktiviteter.
SW480-avledet elbiler indusere Egr-en aktivering i endotelceller
Egr-en spiller en avgjørende rolle i tumor-assosiert angiogenese [29] – [32]. Vi undersøkte derfor muligheten for aktivering av endotel Egr-1 av SW480-avledede EV (fig. 2). Sanntid RT-PCR-analyser viste at behandling med SW480-avledede EV forårsaket en rask og forbigående økning av Egr-1-ekspresjonen på transkripsjonsnivået i humane endotelceller, HMEC-1S og HUVECs (fig. 2A). Vi brukte HMEC-1s i de følgende forsøk. Videre elbiler fra andre humane kreftceller (HCT116 tykktarmskreft, A549 lunge adenokarsinom, HT1080 fibrosarkom, PC3 prostata kreft, og SH-SY5Y neuroblastom) også indusert Egr-1 mRNA uttrykk i humane endotelceller, mens elbiler fra normale humane bronkiale epitelceller (BEAS-2B) ikke (fig. 2B). Vi undersøkt videre Egr-en aktivering etter stimulering av SW480-avledet elbiler. Elbiler indusert rask og forbigående uttrykk og kjernefysisk translokasjon av Egr-1 protein i HMEC-1s; den maksimale effekt ble observert ved 1 time etter behandling EV (Fig. 2C og 2D). Til sammen kreft-avledet elbiler indusere Egr-en aktivering ved å øke sitt uttrykk og kjernekraft translokasjon i endotelceller. Disse observasjoner tyder på at Egr-1-aktivering kan være kritisk for å modulere EV-indusert angiogenese.
(A) HMEC-1s og HUVECs ble inkubert med SW480-avledede EV (1 pg /ml) eller ubehandlet kontroll. mRNA ble isolert fra ubehandlede kontrollceller eller celler behandlet med EV for 0, 0,5, 1, 2 og 4 timer og analysert ved hjelp av sanntids RT-PCR (n = 3). Verdier representerer Egr-1 mRNA /GAPDH mRNA normalisert til ubehandlede kontrollceller. (B) HMEC-1s ble behandlet med EV (1 mg /ml) avledet fra HCT116 kolorektal karsinom, A549 lunge adenokarsinom, HT1080 fibrosarkom, PC3 prostata-karsinom, SH-SY5Y neuroblastom, og BEAS-2B normale bronkiale epitelceller i 0,5 timer ( n = 3). (C, D) I HMEC-1s, nukleær translokasjon av Egr-1 protein etter stimulering med SW480-avledet EV (1 pg /ml) i 0,5, 1, 2 og 4 timer ble analysert under konfokal mikroskopi (n = 3) . Kjerner og Egr-1-proteinene ble farget med Hoechst (blå) og anti-Egr-1-antistoff (rød), respektivt. Samlokalisert fluorescens-signaler (lilla) viser translokasjon av Egr-en inn i kjernen. Representative fotografier er vist i panel C. Scale søylene representerer 30 mikrometer. Prosentandelen av Egr-1-positive kjerner ble bestemt ved å måle antall celler med nucleus colocalized signaler over det av totale celler (D). Data er representert som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05; **
P
0,01; **
P
0,001; ns, ikke signifikant.
Egr-en siRNA demper endotelceller migrasjon indusert av SW480-avledet elbiler
Vi neste undersøkt hvilken rolle Egr-1 i EV-indusert endotelial celle migrasjon ved hjelp av siRNA. Når vi undersøkte tre Egr-1 sirnas, fant vi at Egr-en siRNA-1 mest effektivt redusert EGR-1 mRNA nivå i endotelceller, men egge siRNA ikke vist dette hemmende effekt (fig. 3A). Endotelceller behandlet med Egr-en siRNA-en effektivt blokkert EV-indusert Egr-en aktivering (fig. 3B) og migrasjon som observert i skrape sårhelende analyser (Fig. 3C og 3D) mens egge siRNA viste ikke disse hemmende effekter . Dermed resultatene indikerte at EV-indusert ekspresjon og kjernefysisk translokasjon av Egr-en i endotelceller skal bidra til EV-indusert endotelial celle migrasjon.
(A) HMEC-1s ble transfektert med 50 nM av egge siRNA eller Egr-en siRNA-1, Egr-en siRNA-2, eller Egr-en siRNA-3. mRNA ble isolert fra cellene etter 48 timer og nivået av Egr-1 mRNA ble analysert ved hjelp av sanntids RT-PCR (n = 3). (B) Kjernetranslokasjon av Egr-1 protein etter stimulering med SW480-avledet EV (1 pg /ml) i 1 time ble analysert i egge siRNA (50 nM) og EGR-1 siRNA-1 (50 nM) transfekterte HMEC-1s (n = 3). (C, D) Sammenflytende HMEC-1s transfektert med egge siRNA (50 nM) og EGR-1 siRNA-1 (50 nM) ble skrapet og behandlet med SW480-avledede EV (1 ug /mL); Da antallet migrerte celler i ribbet sonen ble evaluert etter 12 timer (n = 3). Antallet migrerte celler i ribbet sone i hver gruppe er vist i panel D. Skala stolper representerer 100 um. Data er representert som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0,001; ns, ikke signifikant.
ERK1 /2 og JNK signalveier er involvert i EV-indusert Egr-en aktivering og migrasjon i endotelceller
Vi neste undersøkt signalveier involvert i EV-mediert Egr-en aktivering. ERK1 /2 inhibitor (PD98059) og JNK-inhibitor (SP600125) nesten fullstendig undertrykt Egr-en nukleær translokasjon i endotel-celler etter stimulering med SW480-avledede EV, men p38 MAPK-inhibitor (SB203580) og Akt-inhibitor (BML-257) hadde ingen virkning (fig. 4A og 4B). Videre har vi observert at PD98059 og SP600125 behandlinger nesten fullstendig blokkert EV-indusert endotel-cellemigrasjon mens disse inhibitorene viste ingen tilsynelatende virkning på den basale migrering av endotelceller (fig. 4C og 4D). Videre PD98059 eller SP600125 hemmet nesten helt på
in vivo
angiogene aktiviteter SW480-avledet elbiler (fig. 4E og 4F). Alle disse observasjoner indikerte at ERK1 /2 og JNK-signalreaksjonsveier er nødvendig for Egr-1-aktivering, endotel-cellemigrering, og
in vivo
angiogenese.
(A, B) HMEC-1s ble forbehandlet med signalerings inhibitorer i 1 time og deretter stimulert i 1 time med SW480-avledet EV (1 pg /ml). Nukleær translokasjon av Egr-1-protein ble analysert ved hjelp av konfokal mikroskopi (n = 3). Kjerner og Egr-1-proteinene ble farget med Hoechst (blå) og anti-Egr-1-antistoff (rød), respektivt. Samlokalisert fluorescens-signaler (lilla) viser translokasjon av Egr-en inn i kjernen. Representative fotografier er vist i panel A. Andelen Egr-1-positive kjerner ble bestemt ved å måle antall celler med nucleus colocalized signaler over totale celler (B). (C, D) Sammenflytende HMEC-1s ble skrapet og behandlet med SW480-avledet EV (1 pg /ml) i nærvær eller fravær av signalisering inhibitorer; Da antallet migrerte celler i ribbet sonen ble evaluert etter 12 timer (n = 3). Representative fotografier av konfokal mikroskopisk avbildning er vist i panel C og antallet migrerte celler i ribbet sone i hver gruppe er vist i panel D. ERK1 /2-inhibitor, PD98059 (20 uM); p38 MAPK inhibitor, SB203580 (10 mm); JNK inhibitor, SP600125 (20 mm); Akt inhibitor, BML-257 (20 mm). (E, F) C57BL /6 mus ble subkutant injisert med Matrigel inneholder SW480-avledet elbiler (20 mikrogram) med PD98059 (20 mm) eller SP600125 (20 mm). Etter 7 dager, hel-mount farging av Matrigel med anti-CD31-antistoff ble utført (n = 5). Representative konfokale Z-stack fotografier av hele monteringer farget for CD31 (grønn) er vist i panel E. Fluorescens intensiteter av CD31 i Z-stabelen planet for Matrigel ble målt som beskrevet i fremgangsmåtene (F). Skala barer i panelene A, C og E representerer 30, 100, og 100 um, respektivt. Data er representert som gjennomsnitt ± SD. ***
P
. 0,001
Endocytose inhibitor hemmer Egr-en aktivering og endotelceller migrasjon indusert av SW480-avledet elbiler
Som potensiell engasjement av lipid flåte endocytose i EV-opptak [41], [42], undersøkte vi rollen til de lipid flåter i EV opptak av endotelceller. DII-merkede EV opptaket ble inhibert signifikant etter behandling med MβCD (10 mM) (Fig. 5A). EV-indusert endotel-cellemigrasjon inn i ribbet sone ble fullstendig blokkert av MβCD behandling (Fig. 5B). Videre endotelceller behandlet med MβCD fullstendig blokkert EV-indusert Egr-1-aktivering (Fig. 5C og 5D).
