Abstract
En av de lovende muligheter for klinisk anvendelse av kaldt plasma, såkalt kald atmosfærisk plasma (CAP), er dens anvendelse på maligne celler og kreftvevet ved hjelp av sin anti-neoplastisk virkning, først og fremst gjennom levering av reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser (ROS, RNS). I denne studien undersøkte vi effekten av CAP på celleproliferasjon og påfølgende molekylære responsmekanismer i etablert prostatakreft (PC) cellelinjer. PC-celler viste en betydelig redusert cellevekst følgende CAP behandling som et resultat av både en umiddelbar økning av intracellulære nivåer peroksid og gjennom induksjon av apoptose antydet med annexin V-analyse, TUNEL assay, og evaluering av endringer i atom morfologi. Spesielt, samtidig bruk av N-acetylcystein (NAC) fullstendig nøytralisert CAP effekter ved NAC opptak og rask konvertering til glutation (GSH). Vitamin C kan ikke motvirke CAP induserte effekter på cellevekst. I sammendrag, forholdsvis korte behandlinger med CAP av 10 sekunder var tilstrekkelig til å indusere en signifikant inhibering av proliferasjon kreft, som observert for første gang i urogenital kreft. Derfor er det viktig å forstå fremgangsmåten for CAP relatert celledød og klargjøre og optimalisere CAP som kreftterapi. Økte nivåer av peroksider kan endre redoks-regulert signalveier og kan føre til vekst og apoptose. Vi antar at den generelle intracellulære redoks homeostase, spesielt nivåene av cellulær GSH og peroxidases som peroxiredoxins påvirke utfallet av CAP behandling
Citation. Weiss M, Gumbel D, Hanschmann EM, Mandelkow R, Gelbrich N , Zimmermann U, et al. (2015) Kalde Atmospheric plasma behandling induserer antiproliferative effekter i prostata kreft celler med Redox og apoptotiske signalveier. PLoS ONE 10 (7): e0130350. doi: 10,1371 /journal.pone.0130350
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 25. september 2014; Godkjent: 18 mai 2015; Publisert: 01.07.2015
Copyright: © 2015 Weiss et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Deler av arbeidet ble finansiert med tilskudd av CHL: (1) Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), LI984 /3-1 (https://www.dfg.de), (2) Science Network molekylærmedisin, Universitetet Medicine Greifswald, FOMM-2013-06 (https://www.medizin.uni-greifswald.de/fvmm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tross for utviklingen av nye terapeutiske strategier lovende mot tidlige og avanserte urogenitale tumorer så som prostata, nyre eller uretral kreft, radikal kirurgi forblir standard terapi som en kurativ tilnærming. Primært, prostatakreft (PC) representerer en av de mest diagnostisert ondartede sykdommer og andre forblir ledende årsak til tumorassosierte dødsfall i hann i den vestlige halvkule [1]. I de fleste felt av kirurgisk onkologi det er bred enighet om fjerning av en svulst totalt og med et tilstrekkelig stort kirurgisk margin (R0-reseksjon). Overraskende kliniske studier viser at kreft-positive kirurgiske marginene er uunngåelig i et betydelig antall tilfeller [2, 3, 4]. Imidlertid, fortrinnsvis fullstendig lokal ekstirpasjon av ondartede celler, øker risikoen for å skade flankerende vev og organer. Derfor er nye terapeutiske anvendelser nødvendig for å forebygge kreft-positive kirurgiske marginer ved å eliminere mikroskopiske rester etter reseksjon av urogenitale svulster, og samtidig gjøre det mulig å redusere minsteavstand mellom behandlede tumor og omkringliggende vev.
Nylig, kald atmosfærisk plasma (CAP) viste lovende anti-neoplastiske effekt på en rekke tumorer, f.eks melanom, glioma, og bukspyttkjertelcancerceller [5, 6, 7], og derfor kunne være en effektiv metode for anti-kreft-behandling i klinisk urologi i fremtiden. Fysisk plasma er definert som en meget reaktiv ionisert gass inneholdende diverse biologisk reaktive faktorer som innebærer ladete partikler (ioner, elektroner), eksiterte atomer og molekyler (dvs. reaktive oksygen- og nitrogen-arter, ROS, RNS), frie radikaler (atomer eller molekyler inneholdende et uparet elektron), fotoner og elektromagnetiske felt, som fører til utslipp av synlig ultrafiolett, vakuum-ultrafiolett, samt infrarød stråling [8, 9]. Temperaturen kan justeres til kroppstemperatur. De reaktive forbindelser, som blir biokjemisk aktiv, dukke under generering av plasmaet ved interaksjon med molekyler av den omgivende luft, og /eller ved kontakt med plasma med enten medium, den kroppsvæske, eller det vev som skal behandles, [10, 11, 12]. Behandling av biologiske vev og celler med CAP blir det mulig, på grunn av elektroner varme opp mye raskere i et elektrisk felt i forhold til ioner, noe som resulterer i en omgivelsestemperatur plasmastråle [13]. Avklare de underliggende biologiske effekter og virkningsmekanismer er fremdeles en betydelig utfordring, men det er montering bevis rapporterer at ROS er primært ansvarlig for CAP-avhengig celledød [14]. Kreft cellevekst er ofte assosiert med en forstyrrelse av fysiologiske redoks-homeostase og signalering, for eksempel, økte nivåer av 8-hydroksy desoxyguanosin og hydrogenperoksyd er blitt vist i forskjellige carcinoma celler [15]. Redox signal er mediert av medlemmer av thioredoxin familien (f.eks thioredoxins, TRX, glutaredoxins, Grxs, peroxiredoxins, Prxs) som styrer viktige cellulære prosesser som proliferasjon og apoptose. TRX-ene og Grxs regulere proteinfunksjonen via den reversible reduksjon /oksydasjon av spesifikke cysteinylrester og tak intracellulære hydrogenperoksid nivåer ved å redusere Prxs, som i sin tur reduserer cellulære peroksider til vann. Thioredoxin isoformer er overalt uttrykt i pattedyr, er lokalisert i hele compartmentalized celler, og viser tydelige endringer i uttrykk i ulike sykdommer, inkludert kreft (for en oversikt se Hanschmann et al. [16]). En sterk og vedvarende avbrudd av redoks-signalering, da det kan resultere fra CAP påvirkning kan føre til inhibering av forstyrret eller avbrutt funksjoner av proteiner og essensielle cellulære signalveier [17].
I denne studien beskriver vi effektene av CAP behandling på menneskelige PC cellelinjer. Vår studie er ikke bare støtter tidligere data på CAP-drevet endring av ROS, men bekrefter videre den spesifikke induksjon av peroksider, som umiddelbart endre Redox tilstand av Prxs reversibelt og potensielt andre proteiner, som fremmer cellevekst og apoptose, henholdsvis.
Materialer og Metoder
Cell kultur
Menneskelig epiteliale PC cellelinjer LNCaP og PC-3 (cellelinjer Service, Eppelheim, Tyskland) ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10 % føtalt kalveserum og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin (PAN Biotech) ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktig atmosfære. For celle overføring på en cellekulturplate adherente celler ble løsnet med 0,1% trypsin /0,04% etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og resuspendert i RPMI-medium. For ytterligere eksperimenter RPMI-medium ble supplementert med 5 mM N-acetylcystein (NAC, Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland)., 100 pM vitamin C (Carl Roth) eller 5 pg /ml cykloheksimid (Merck, Darmstadt, Tyskland), henholdsvis
CAP behandling
For å generere CAP med argon som bæregass, ble det atmosfæriske trykket plasma jet kINPenMed (Neoplas GmbH, Greifswald, Tyskland) benyttet (figur 1). Suspenderte celler ble behandlet i 500 pl RPMI 1640 medium (PAN Biotech, Aidenbach, Tyskland) på en ubelagt cellekulturplate. Den viktigste årsaken til cellen behandling i suspensjonen for å unngå bivirkninger fra CAP-kilde ved behandling av adherente celler, det vil si mekaniske skader og tørking. Spredningsanalyser ble spredd med 3×10
4 LNCaP og PC-3 celler. Ytterligere analyser og Western Blot analyse ble utført med 6×10
5 LNCaP og PC-3 celler CAP kilde ble søkt om 10 s og kontroller ble behandlet med ikke-ionisert argongass i 10 s, henholdsvis. Følgende CAP behandlings celler ble umiddelbart overført til poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) belagt cellekulturplater og ble dyrket i RPMI 1640-medium for angitte tidspunkter. For CAP behandling med kINPen09 følgende innstilling ble brukt: Argon gasstrømmen: 3 l /min; forsyningsspenningen = 65 V DC; frekvens: 1,1 MHz; eksponeringstid: 10 s. Kontrollceller: Argon gasstrømmen: 3 l /min; eksponeringstid: 10 s [18, 7]
(A) Plasma jet kINPen09 (Neoplas GmbH, Greifswald, Tyskland), (B) skjematisk rekonstruksjon av kINPen09 og sammensetning av fysisk plasma
spredningsanalyse
Cellular spredning av LNCaP og PC-3 celler ble analysert i 24-brønners cellekulturplater (1 ml /brønn) med en casy celleteller og Analyzer Modell TT (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) i løpet av et tidsrom på 120 timer. Adherente celler ble løsnet med 0,1% trypsin /0,04% etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og resuspendert i CASYton løsning (Roche Applied Science). Antallet levende celler ble bestemt i duplikat for hver prøve.
Annexin V-analyse
LNCaP og PC-3-celler ble suspendert i 500 ul RPMI-medium og ble CAP behandlet i 10 sek. Argon behandlede celler tjente som kontroll. Etter 4 timers inkubering adherente celler ble løsnet med 0,1% trypsin /0,04% EDTA, vasket med PBS og resuspendert i bindingsbuffer. AnnnexinV analysen ble utført ved hjelp av FITC Annexin V apoptose Detection Kit I (BD Bioscience, Tyskland) som anbefalt av leverandøren.
Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) assay
6×10
5 suspendert LNCaP og PC-3-celler ble suspendert i 500 pl RPMI-medium og CAP ble behandlet i 10 sek. Argon behandlede celler tjente som kontroll. Etter 24 timers inkubering adherente celler ble løsnet med 0,1% trypsin /0,04% EDTA. TUNEL apoptose analyser ble utført ved hjelp av HT TiterTACS Assay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) etter leverandørens anbefalinger. Data ble ervervet ved hjelp av et Infinite 200 PRO multimode-leser (Tecan) og ble analysert ved hjelp av i-kontroll 1.9 programvare (Tecan).
Nuclear morfologi analysen
6×10
5 suspendert LNCaP og PC-3-celler ble CAP behandlet i 10 sek og sådd ut på en 6-brønners cellekulturplate inneholdende 2,5 ml RPMI-medium. Argon behandlede celler tjente som kontroll. Celler ble dyrket i 24 timer, ble vasket med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, skylt to ganger med PBS og inkubert med 0,2% Triton-X-100 i 5 minutter. Cellene ble vasket med PBS og farget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Carl Roth) for fluorescens-analyse ved anvendelse av en BZ-9000 fluorescerende mikroskop system (Keyence, Osaka, Japan) og en BZ II Analyzer (Keyence ). Under apoptose celler ligger til grunn for kjernefysiske morfologi endringer, kromatin kondens og degradering til atom kroppen fragmenter [19, 20, 21]. For påvisning av morfologiske endringer fluorescerende mikroskopiske bilder ble tatt fra 10 stillinger per 3,5-cm-cellekulturskål, tilsvarende 0,5% av det totale vekstområde. ble utført Beregnings morfometrisk analyse for hvert enkelt kjerne. Totalt antall DAPI positive kjerner varierte 400-600 (CAP /cycloheximide behandlede celler) og 700-1000 (argon /kjøretøy behandlede celler). Den morfometriske parametre ble beregnet ved hjelp av BZ II Analyzer. Derfor er det Hybrid celletall BZ-H2C-modulen ble anvendt for å definere parametre for valg. Enkelt kjerner ble definert ved colocalization funksjon som DAPI positive områder i området 0,3 til 200 um
2, med unntak av kjerner klynge og fragmenterte kjerner. De morfometriske parametere ble innhentet av verktøy programvare analyseverktøy areal, omkrets, hovedakse, lille aksen, og lysstyrke. Apoptotisk kondensering representert ved kjerner krymping er karakterisert ved en reduksjon av kjernefysisk areal og omkrets. Ytterligere morfologiske sjansene akkompagnert med atom deformasjon og disrounding utgjør misforhold av parametrene dur og moll aksen, samt en økning av kjernefysisk lysstyrke.
Western blotting
2-Cys Prxs redoks blot.
for å bestemme CAP-induserte endringer i cellulære nivåer og redoks staten Prx1, Prx2 og Prx3 6×10
5 suspendert LNCaP og PC-3 celler ble behandlet med CAP eller argon i 10 s. Cellene ble sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min. Supernatanten ble samlet opp og blandet med lasting fargestoff (0,3 M Tris /HCl (pH 7,0), 50% glycerol, 5% SDS, 0,1% bromfenolblått) og ble frosset ved -20 ° C for senere analyse av potensiell sekresjon av Prx1 og Prx2. Celler ble inkubert i 15 minutter i PBS inneholdende 100 mM av alkyleringsmidlet N-etylmaleimid (NEM) som irreversibelt binder seg til frie tiolgrupper. Etter sentrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble kastet, og pelleten ble resuspendert i NEM-inneholdende buffer (40 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, proteaseinhibitorer, 100 mM NEM ) i 15 minutter og lysert ved tilsetning av 2% CHAPS. Total proteinmengden ble bestemt i henhold til Bradford, og 10-20 ug protein ble fortynnet og blandet med lasting fargestoff. SDS PAGE ble kjørt ved hjelp av pre-støpt gels (4-20%, BioRad) og flekkfrie teknologi (Bio-Rad). For å analysere redoks-tilstand av den cellulære Prxs, proteiner analysert ved ikke-reduserende SDS-PAGE. For å analysere utskilt Prxs i supernatanten, ble like volumer redusert med 100 mM DTT i 30 minutter ved romtemperatur og 10 minutter ved 94 ° C. Proteiner ble separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner ved hjelp av den halvtørre teknikk. Membranene ble blokkert med 5% melkepulver og 1% BSA i TBS inneholdende 0,05% Tween-20. Prx1, Prx2 og Prx3 ble analysert ved hjelp av spesifikke primære antistoffer (produsert og evaluert som nevnt i [22] og [23]), en HRP-merket sekundært antistoff og den forbedrede kemoluminescens utvikling teknikk bruker ChemiDoc system (BioRad). Nivåer av oksidert Prxs ble kvantifisert ved densitometrisk analyse ved hjelp ImageJ og ImageLab programvare (BioRad) og ble normalisert til den totale mengden av den aktuelle PRX. Videre ble totalprotein kvantifisert basert på flekken-fri teknologi, og ble brukt for normalisering av blotting data fra densitometrisk analyse.
glutation (GSH) assay
LNCaP og PC-3 celler ble inkubert i nærvær eller fravær av 5 mM NAC over en periode på 12 timer. Cellene ble høstet ved 0,1% trypsin /0,04% EDTA, vasket med PBS og lysert i lyseringsbuffer (40 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, proteasehemmere, og 2% CHAPS). Den proteinmengden ble bestemt i henhold til Bradford. 100 mikrogram av protein ble utfelt over natten ved hjelp av 4% sulfosalisylsyre. Prøvene ble sentrifugert ved 4 ° C i 30 minutter ved 13 000 rpm. Supernatanter ble nøytralisert ved anvendelse av NaOH og ble analysert for totalt innhold GSH i en kolorimetrisk assay mot en GSH standard med kjente konsentrasjoner (0-0,2 mm). Analysen er basert på dannelsen av den gule TNB fra 5,5′-Dithio-bis- (2-nitrobenzosyre) (DTNB) i nærvær av GSH. Analysen ble utført i en 96-brønners plate; reaksjonsblandingen inneholdt 1,5 mM NADPH (Carl-Roth), gjær GSH-reduktase og 1,5 mM DTNB (Carl Roth-) og ble målt ved 412 nm som ende-punkt-analyse ved hjelp av Infinite 200 PRO multimode-leser (Tecan).
statistikker
statistiske sammenligninger ble utført fra minst 9 uavhengige vekstkinetiske eksperimenter og i tilfelle av andre analyser fra minimum 3 uavhengige eksperimenter med uparede Student
t
test. Resultater av
p
0,05 ble betraktet som signifikant. Data er gitt som gjennomsnitt ± SD.
Resultater
CAP behandling hemmet celleformering av menneskelig PC cellelinjer
I denne studien vi sikte på å analysere kort og lang langtidsvirkninger av CAP på spredning av menneskelig PC cellelinjer LNCaP og PC-3 etter en enkelt CAP behandling av 10 s. Argon behandlede celler ble anvendt som kontroll. Ved hjelp av en casy celleteller og Analyser Model TT det totale celleantall ble analysert i et tidsrom på 120 timer (figur 2A og 2B). 10 s CAP søknad forårsaket betydelige reduksjoner i de totale celle tall av den observerte cellelinjer LNCaP (Fig 2A, 4 t: 2,15 fold,
p
= 0,1138; 24 timer: 1,36 ganger,
p
= 0,2034; 48 h: 1,79 fold,
p
= 0,0227; 72 h: 1,88 fold,
p
= 0,0584; 96 h: 1,96 fold,
p
= 0,0148; 120 h: 2,30 ganger,
p
= 0,0050) og PC-3 (fig 2B, 4 t: 3,23 fold,
p
= 0,0040; 24 timer: 1.82 fold,
p
= 0,0007; 48 h: 1,90 fold,
p
= 0,0177; 72 h: 2,01 fold,
p
= 0,0011; 96 h: 2,58 fold,
p
= 0,0010; 120 h. 2,96 fold,
p
= 0,0015) sammenlignet med argon-behandlede kontroller
etter CAP behandling for 10 s LNCaP og PC-3 celler ble telt ved hjelp en casy celleteller og Analyzer Modell TT (Roche Applied Science) på angitte tidspunkter etter. Kontrollceller ble behandlet i 10 sekunder med argon (kontr). Levende celle antall (A) LNCaP-celler, og (B) PC-3-celler behandlet med CAP viste signifikant reduserte celleantall sammenlignet med kontroller. (C) LNCaP-celler inkubert med 10 nM docetaxel viste signifikant hemmet cellevekst, kan sammenlignes med CAP behandling. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av legemer. *
p
0,05; ***
p
. 0,001, som bestemmes av Student
t
test
CAP-indusert apoptose i LNCaP og PC-3 celler
for å bevis om reduksjon av celleantallet etter CAP behandling er et resultat av apoptotisk celledød, vi videre undersøkte effekten av CAP behandling av annexin V og TUNEL assay samt evaluering av kjernefysisk morfologi ved den kjernefysiske morfologi analysen. Farging av membranøs fosfatidylserin via annexin V, det vil si blant annet en avgjørende faktor for apoptose når den ekstern til den ytre plasmamembranen, viste en akkumulering av annexin V signal 4 timer etter CAP behandling av LNCaP og PC-3-celler (fig 3; LNCaP : 1.25 fold,
p
= 0,0007, PC-3: 1,60 fold,
p
= 0,2954). Resultatene var signifikante for LNCaP, mens tross for en respektabel økning på annexin V signal, ikke signifikant for PC-3. Av denne grunn vi håndheves apoptose deteksjon av TUNEL analysen og kjernemorfologi analyse for å visualisere endringer i kjernefysiske morfologi.
LNCaP og PC-3 celler ble behandlet med CAP i 10 s og ble dyrket i 24 timer. Argon behandlede celler ble anvendt som kontroll (kontr). Cellene ble høstet og behandlet ved hjelp av en FITC Annexin V apoptose Detection Kit I (BD Bioscience, Tyskland) ifølge produserer «instruksjoner. 24 timer etter behandling CAP LNCaP og PC-3-celler viste en økning av fosfatidylserin-bundet Annexin V. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ***
p
0,01, som bestemmes av Student
t
test
Ved merking DNA-fragmenter gjennom TUNEL analysen både LNCaP og PC-3 celler. viste en signifikant høyere alvorlighetsgrad av DNA-fragmentering og dermed en økning i TUNEL positiv celle området etter CAP behandling sammenlignet med argon behandlet kontroller (figur 4A, LNCaP, 4 t: 3,07 fold,
p
= 0,0068; 24 timer: 1.93 fold,
p
= 0,0012, figur 3B, PC-3, 4 t: 3,35 fold,
p
= 0,0078; 24 timer: 2.24 fold,
p
= 0,0384). Dessuten er den kjernefysiske morfologi analysen i utstrakt bruk for detektering av apoptose i eukaryote celler og andre celletyper, da det er en indikator for morfologiske forandringer av kjernen. Som vist i figur 5, atom morfologi analysen av CAP behandlet LNCaP og PC-3-celler viste signifikante og apoptose-assosierte forandringer av kjernemorfologi vedrørende område (fig 5A; LnCap: 1,04 gangers nedgang,
p = 0,0022
; fig 5F, PC-3: 1,27 ganger reduksjon,
p
= 0,0021), omkrets (fig 5B, LNCaP: 1,02 ganger reduksjon,
p
= 0,0310, figur 5G, PC-3 : 1,11 ganger reduksjon,
p
= 0,0065), hovedakse (figur 5C, LNCaP: 1,02 ganger reduksjon,
p
= 0,0405, figur 5H, PC-3: 1,13 ganger reduksjon,
p
= 0,0050) og lille aksen (fig 5D, LNCaP: 1,03 ganger reduksjon,
p
= 0,0085, figur 5I, PC-3: 1,14 ganger reduksjon,
p
= 0,0051), samt lysstyrke per celle (fig 5E, LNCaP: 2,25 ganger økning,
p
0,0001, figur 5J, PC-3: 1,45 ganger reduksjon,
p
= 0,0034), sammenliknet med argon-behandlede kontroller. Induksjon av apoptose ved cycloheximide inkubasjon fungert som intern kontroll [24] og forårsaket sammenlignbare endringer av området (figur 5A, LNCaP: 1,27 ganger reduksjon,
p
= 0,0028, figur 5F, PC-3: 1,14 ganger reduksjon
p
= 0,0006), omkrets (fig 5B, LNCaP: 1,13 ganger reduksjon,
p
= 0,0071, figur 5G, PC-3: 1,09 ganger reduksjon,
p
= 0,0005), hovedakse (figur 5C, LNCaP: 1,15 ganger reduksjon,
p
= 0,0099, figur 5H, PC-3: 1,13 ganger reduksjon,
p
= 0,0001) og mindre aksen (fig 5D, LNCaP: 1,13 ganger reduksjon,
p
= 0,0012, figur 5I, PC-3: 1,02 ganger reduksjon,
p
= 0,4306), samt lysstyrke per celle ( fig 5E, LNCaP: 1,23 ganger økning,
p
0,0001, figur 5J, PC-3. 1,55 ganger reduksjon,
p
= 0,0002)
LNCaP og PC-3-celler ble behandlet med CAP i 10 s og ble dyrket i 4 timer eller 24 timer. Argon behandlede celler ble anvendt som kontroll (kontr). Cellene ble høstet og bearbeidet av spesifikk merking av nukleært DNA fragmentering med en HT TiterTACS Assay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) ifølge produserer «instruksjoner. (A) Kjerne DNA-fragmentering av LNCaP og (B) PC-3-celler etter 10 sek med CAP behandling (CAP) sammenliknet med argon-behandlede kontroller (ko). Umerkede kontrollceller (umerket ko) tjente som negativ kontroll og nuklease behandlet celler (nuklease ko) tjente som positiv kontroll, henholdsvis. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05, **
p
. 0,01, som bestemmes av Student
t
test
LNCaP og PC -3-celler ble CAP behandlet i 10 sek, fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og farget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for fluorescens-analyse. Nuclear parametre område (A, F), omkrets (B, G), hovedakse (C, H), en mindre akse (D, I) og lysstyrke per celle (E, J) etter DAPI fluorescens av LNCaP og PC-3-celler etter CAP og argon (kontr) behandling. Inkubasjon med cykloheksimid (cykloheks) og dens kjøretøy tjente som intern positiv kontroll for apoptose. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,001, som bestemmes av Student
t
test.
Inkubasjon med NAC snudd anti-proliferative CAP effekter
Nylig er det er økende bevis for at anti-proliferative CAP effekter på pattedyrceller er forårsaket av induksjon av reaktive arter inkludert ROS og RNS [4]. For å avgjøre om reaktive arter er ansvarlig for reduksjon av cellevekst i PC, telte vi levende celler av CAP eller argon behandlet LNCaP og PC-3 celler som ble inkubert i nærvær eller fravær av NAC og vitamin C i opp til 120 timer ( figur 6). Begge reagenser er kjent for å formidle universell antioksidant virkning [22]. Igjen, bruk av CAP på celler dyrket i RPMI cellekulturmedium avdekket betydelig redusert celle tall av LNCaP (fig 6A, 4 t: 2,04 fold,
p
= 0.0328, 24 t: 1,30 ganger,
p
= 0,1277; 48 h: 1,58 fold,
p
= 0,0298; 72 h: 1,77 fold,
p
= 0,0275; 96 h: 2,00 fold,
p
= 0,0189; 120 h: 2,30 fold,
p
= 0,0205) samt PC-3 celler (fig 6B, 4 h: 2,63 fold,
p
= 0,0005; 24 h : 2.08 fold,
p
= 0,0008; 48 h: 2,07 fold,
p
= 0,0044; 72 h: 2,61 fold,
p
= 0,0048; 96 h: 2,29 fold,
p
= 0,0509; 120 h: 2,12 fold,
p
= 0,0056) sammenlignet med argon behandlet kontroller og var sammenlignbare med hva vi har vist før (fig 2). Spesielt, den supplementering av NAC til CAP behandlet LNCaP og PC-3-celler i stor grad fjernet den veksthemmende virkning av CAP som NAC-inkuberte cellelinjer oppviste økt cellevekst etter plasmabehandling sammenlignet med CAP-behandlede celler i fravær av NAC (figur 6A; LNCaP, 4 t: 2,30 fold,
p
= 0,1084; 24 timer: 1.27 fold,
p
= 0,1474; 48 h: 1,38 fold,
p
= 0,1853; 72 h: 1,50 ganger,
p
= 0,0952; 96 h: 1,52 fold,
p
= 0,1323; 120 h: 1,60 fold,
p
= 0,0134; fig 6B , PC-3, 4 t: 1,95 fold,
p
= 0,0287; 24 timer: 1.81 fold,
p
= 0,1111; 48 h: 1,61 ganger,
p
= 0,1011; 72 h: 1,73 fold,
p
= 0,0571; 96 h: 1,43 fold,
p
= 0.0917, 120 h: 1,57 ganger,
p
= 0.2247 ). Mest interessant var den antiproliferative CAP virkninger som ikke er begrenset av antioksidanten vitamin C som proliferasjonen av CAP-behandlede celler i nærvær eller fravær av vitamin C statistisk ikke forskjellig. CAP behandlede celler supplert med vitamin C viste en statistisk signifikant reduksjon av LNCaP og PC-tre spredning i forhold til argon behandlet kontroller (LNCaP, Fig 6C, 4 t: 1,85 fold,
p
= 0,0397; 24 timer: 1.61 fold,
p
0,0001; 48 h: 1,76 fold,
p
0,0001; 72 h: 1,91 fold,
p
= 0,0020, 96 t: 2,16 fold,
p
= 0,0007; 120 h: 2,20 fold,
p
= 0,0001, PC-3, fig 6D, 4 t: 2,24 fold,
p
0,0001; 24 timer: 1,80 fold,
p
0,0001; 48 h: 1,74 fold,
p
0,0001; 72 h: 2,25 fold,
p
0,0001; 96 h: 2,35 fold,
p
0,0001; 120 h:. 2,30 fold,
p
= 0,0002)
Å leve celle antall LNCaP og PC -3 celler etter CAP behandling i 10 s. CAP-behandlede celler ble inkubert med celledyrkningsmedium i fravær av NAC og vitamin C (○ og ●), (A + B) cellekulturmedium inneholdende 5 mM NAC (□ og ■), og (C + D) cellekultur medium inneholdende 100 pM vitamin C (VITC, □ og ■) over en periode på 120 timer. Cellene ble telt ved bruk av en casy celleteller og Analyzer Modell TT (Roche Applied Science) på angitte tidspunkter. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av legemer. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,001, som bestemmes av Student
t
test.
NAC er en etablert kilde for GSH-syntese og således en kilde for den mest tallrike to-elektron-donor, mens vitamin C er en mer effektiv en-elektrondonor. Deretter evaluerte vi hvorvidt de beskyttende virkningene av NAC behandling kan være basert på økte intracellulære GSH-nivåer ved hjelp av et kolorimetrisk assay for total cellulær GSH (figur 7). Faktisk NAC behandling førte til en økning i intracellulære GSH nivåer innen bare noen få timer etter behandling (LNCaP, figur 7A, 4 t: 1,18 ganger, 8 t: 1,66 ganger; 12 h: 1,66 fold, PC-3, fig 7B ; 8 H: 1,47 brette; 12 t.: 1,37 brette)
LNCaP og PC-3-celler ble behandlet med 5 mM NAC i en periode på 12 timer. Celler ble høstet og lysert ved forskjellige tidspunkter. Total GSH-nivåer ble analysert i en kolorimetrisk bestemmelse under anvendelse av 5,5′-Dithio-bis- (2-nitrobenzosyre) (DTNB) som substrat. GSH-nivåer ble kvantifisert mot GSH-standarder og er avbildet som pmol /mg totalt protein. 4 h (LNCAP) og 12 timer (PC-3) etter behandling NAC en signifikant økning i total GSH-nivåer ble påvist. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av legemer.
For å analysere hvorvidt CAP behandling induserer produksjonen av ROS eller snarere øker intracellulære nivåer av peroksyder, analyserte vi proteinnivåer og redoks-tilstanden 2-Cys Prx1, Prx2 og Prx3. I tillegg undersøkte vi en potensiell sekresjon av Prx1 og Prx2, som hovedsakelig er lokalisert i cytosolen, inn i det ekstracellulære fluid; Prx3 har en eksklusiv beliggenhet i mitokondriene, og derfor en Prx3 sekresjon var ikke forventet [16, 17]. I løpet av sin katalytiske mekanismen reduserer peroksider til vann, Prxs danne et inter disulfidbinding. Skiftet i størrelse kan lett påvises ved en prx redoks-blot, med celleprøver blir forbehandlet med alkyleringsmidlet NEM, som irreversibelt binder reduserte tiolgrupper og beskytter dem mot videre oksydasjon. Siden ROS produksjon potensielt er en umiddelbar årsak til CAP behandling, høstet vi LNCaP og PC-3 celler umiddelbart og en t etter 10 s CAP behandling. Sammenlignet med argon behandlede kontroller, CAP behandling drevet sekresjon av cytosolisk Prx1 til det ekstracellulære væske etter en h (data ikke vist). Ingen signifikante endringer i utskillelsen av Prx2 kunne påvises. Videre har vi ikke kunne påvise signifikante endringer i proteinnivået til hvilket som helst av de to-Cys-Prxs (figur 8). Men for begge cellelinjer LNCaP og PC-3, Prx1 og Prx3 viste en økt mengde av den oksyderte, dimer form følger umiddelbart etter CAP behandling (figur 8; Prx1, LNCaP: 1,41 fold, PC-3: 1,67 ganger; Prx3; LNCaP: 3,63 fold, PC-3: 1,67 ganger), målt som forholdet mellom den oksyderte, dimerisk protein sammenlignet med den totale (monomere plus dimert) protein ved CAP-behandling, sammenliknet med argon-behandlede kontrollceller. Overraskende, denne umiddelbare oksidasjon etter CAP eksponering kunne ikke påvises for Prx2. For å analysere om den forbedrede mengden av oksiderte prx proteiner er ikke bare en kortvarig virkning av CAP behandling, vi også analysert LNCaP og PC-3-celler i 1 time etter at hetten behandling. 1 time etter CAP behandling vi finner ikke noen mer tydelig endring av mengden av oksidert, dimer form av Prx1, Prx2 og Prx3 i begge cellelinjer i forhold til argon-behandlede kontrollceller. Igjen er det ingen vesentlige endringer i ekspresjonen eller sekresjon av det 2-Cys Prxs var påvisbar (figur 8A). Likevel, vi har oppdaget en litt forhøyet Prx2 oksidasjon i LNCaP celler en time etter CAP behandling ved hjelp av to-Cys redoks blot (fig 8).
LNCaP og PC-3 celler ble behandlet i 10 s med CAP eller argon (kontr), henholdsvis. Umiddelbart så vel som 1 time etter behandlingen ble cellene behandlet med alkyleringsmidlet N-etylmaleimid (NEM), som irreversibelt bindes til reduserte tiolgrupper før cellelysering. Protein nivåer av cytosoliske Prx1 og 2, samt mitokondrie Prx3 ble analysert i cellelysatene, såvel som redoks-tilstand ved hjelp av ikke-reduserende SDS PAGE og Western Blot. A) Representant PRX redoks blotter av de tre analyserte peroxidases Prx1, Prx2 og Prx3, viser monomere PRX og i løpet av den katalytiske mekanismen generert oksidert, dimer form. B) Densitometrisk kvantifisering av de oksiderte Prxs forhold til total PRX protein (monomere og dimer form).
Diskusjoner
CAP molekylære virknings fortsatt dårlig forstått. Denne studien undersøker kritisk virkningen av CAP på PC-celler og har som mål å undersøke hittil ukjente molekylære mekanismene bak CAP behandling.
