Abstract
lysofosfatidisk syre (LPA) spiller en avgjørende rolle i spredning og migrasjon av tykktarm kreft celler; men nedstrøms signale hendelsene bak disse prosessene forbli dårlig karakterisert. Hensikten med denne studien var å undersøke signalveier som utløses av LPA å regulere de mekanismene som er involvert i utviklingen av tykktarmskreft (CRC). Vi har brukt tre cellelinje modeller av CRC, og først analysert uttrykket profilen til LPA reseptorer (LPAR). Deretter, behandlet vi cellene med LPA og hendelser relatert til deres karsinogent potensial, for eksempel migrasjon, invasjon, forankrings-uavhengig vekst, proliferasjon og apoptose og cellesyklus ble evaluert. Vi brukte Chip matrisen teknikk for å analysere den globale genuttrykk profilering som oppstår etter behandling LPA, og vi identifiserte cellesignalveier er knyttet til cellesyklusen. Hemming av disse banene bekreftet konklusjonene fra transcriptomic analyse. Vi fant ut at cellelinjene uttrykte LPAR1, -2 og -3 i en differensiell måte, og at 10 mikrometer LPA ikke påvirker celle migrasjon, invasjon og forankringsuavhengig vekst, men det gjorde indusere spredning og cellesyklusprogresjon i HCT-116 celler . Selv LPA i denne konsentrasjonen ikke induserer transkripsjonen aktivitet av β-catenin, det fremmes aktiveringen av Rho og STAT-3. Videre ROCK og STAT-3-hemmere forhindret LPA-indusert spredning, men ROCK hemming forhindret ikke STAT-3-aktivering. Til slutt, observerte vi at LPA regulerer ekspresjon av gener relatert til cellesyklusen, og at den kombinerte inhibering av ROCK og STAT-3 hindret cellesyklusprogresjon og økte LPA-indusert ekspresjon av cykliner E1, A2 og B1 i større grad enn enten inhibitor alene. Samlet er disse resultatene viser at LPA øker proliferativ potensialet i colon adenokarsinom HCT-116 celler gjennom en mekanisme som involverer samarbeid mellom de Rho-rock og Stat3 trasé som er involvert i cellesykluskontroll
Citation. Leve F, Peres- Moreira RJ, Binato R, Abdelhay E, Morgado-Díaz JA (2015) LPA Induserer Colon Cancer Cell Proliferation gjennom et samarbeid mellom ROCK og STAT-3 Pathways. PLoS ONE 10 (9): e0139094. doi: 10,1371 /journal.pone.0139094
Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 15 juni 2015; Godkjent: 09.09.2015; Publisert: 29.09.2015
Copyright: © 2015 Leve et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) og Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia em kreft INCT (573806 /2008-0 og 170,026 /2008) til JAMD; og Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) (26/11703/2013) til JAMD
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lysofosfatidisk syre (LPA) er en naturlig forekommende bioaktive lysophospholipid stede i de fleste vev og biologiske væsker. LPA kan genereres av både lysophospholipase D (lyso-PLD), så som autotaxin (ATX), eller via fosfolipase A1 eller A2 (PLA2 PLA1 og, henholdsvis) [1]. ATX ble først identifisert i malignt melanom som et kjemotaktisk faktor som er nødvendig for melanom invasivitet [2], og ATX /Lyso-PLD blir avvikende uttrykt i mange humane kreftformer og i inflammatorisk tarmsykdom [1,3]. Dessuten, ble høye nivåer av LPA finnes i plasma og ascitesvæske av ovarialcancer pasienter [4]; på samme måte, ble høye nivåer av lysofosfatidylcholin (LPC), en LPA-forløper, som finnes i plasma av kolorektal kreft (CRC) pasienter [5]. Selv om økningen i LPA nivåer i væsker fra pasienter med CRC har ennå ikke blitt direkte påvist, Lin
et al
. [6] har vist at oral administrering av LPA til APC
min /+ mus, som er en modell som er mye brukt i CRC, nesten doblet antall polypper i tarmen. Sammen utgjør disse studier støtter den oppfatningen at LPA spiller en viktig rolle i CRC patologi, som er den tredje hyppigste kreft i menn og den nest hyppigste hos kvinner over hele verden [7].
Via sin binding til spesifikke G -protein-koblede reseptorer (GPCR), formidler LPA mange biologiske responser i kreft. I CRC-celler, øker LPA proliferasjon [8], apoptose beskyttelse [9], migrasjon [10] og tilpasning til hypoksi [11]. Det er godt akseptert at den cellulære respons på LPA er avhengig av ekspresjonen mønster av LPA-reseptorer (LPARs) fordi den varierer blant de forskjellige vev og celletyper. Det er for tiden seks anerkjente LPARs, LPA
1-6, som er overuttrykt i forskjellige typer kreft, inkludert CRC [12,13,14]. Blant disse LPARs, de klassiske kjente LPARs, LPA
1-3, hører til endotelial celledifferensiering gen (EDG) familie av GPCR, og har blitt beskrevet for å regulere forskjellige virkemåter i CRC-celler. For eksempel, ved bruk av spesifikke RNA-interferens, ble det vist at LPA
2 og LPA
3 men ikke LPA
1 er mål for den LPA-indusert proliferasjon av HCT-116 og LS174T [8]. I tillegg, ble det vist at LPA
1 medierer LPA-stimulert celle-spredning av DLD-1-celler ved bruk av en shRNA-lentivirus system [15]. Videre øker LPA
3 knockdown migrasjon og invasjon av HCT-116 celler [16].
LPARs utløse en rekke nedstrøms signalveier. Det er vel-etablert at LPA produserer Rho-avhengige cytoskeletal responser som stress fiberdannelse [17], som er strukturer relatert til cellemigrering. Faktisk viste vi at i Caco-2-celler, er LPA-indusert cellemigrering Rho-ROCK avhengig [10]. I tillegg er Rho-ROCK signale ble også rapportert å spille en rolle i reguleringen av celleproliferasjon [18]. Selv om noen studier har allerede vist at LPA stimulerer spredning av tykktarmskreftceller som HCT-116 og SW480 [8,19], Rho-ROCK signale deltakelse i denne hendelsen var ikke adressert.
Signalet svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT-3) er en transkripsjonsfaktor involvert i tumorgenese prosesser. Konstitutiv STAT-3 aktivering er forbundet med forskjellige humane kreftformer og ofte antyder dårlig prognose [20]. Det ble tidligere vist at ROCK stimulerer STAT-3-aktivering gjennom Janus kinase 1 (JAK 1); STAT-3 og JAK 1 samarbeide for å kontrollere actomyosin kontraktilitet å formidle den avrundede amoeboid migrasjon i melanomceller [21]. I tillegg ble det observert at LPA induserer cellemotilitet gjennom STAT-3-fosforylering i eggstokkreft celler [22]. Interessant er STAT-3 fosforylering innblandet i HCT-116 tykktarmskreft cellevekst [23]. Likevel er det ukjent om LPA aktiverer STAT-3 i CRC celler eller forårsaker aktivering av Rho-ROCK deltakelse i denne signalveien.
Dermed Hensikten med denne studien var å analysere rollen som LPA spiller i ulike biologiske prosesser av CRC progresjon, slik som migrasjon, invasjon og spredning, og for å bestemme mekanismene bak disse hendelsene. Her viste vi at LPA øker HCT-116 celleproliferasjon gjennom en kaskade som integrerer RhoA-ROCK og STAT-3 signale å kontrollere cyclin uttrykk og cellecyklusprogresjonen.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
L-α-lysofosfatidisk syre (oleoyl natrium katt ingen L7260..), kanin anti-LPA
1 (N-terminal;. katt nr SAB4500689), kanin anti-LPA
2 (kat. nr. HPA019616), kanin-anti-LPA
3 (kat. nr. HPA013421), anti-Cyclin B1 (Kat. nr. SAB4503501), 40,6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI ;.. Katt nr 32670) og pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-kanin og anti-mus IgG ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Rabbit monoklonalt anti-STAT-3 (kat 9139..), Mus monoklonalt anti-fosfor-STAT3 (pTyr 705,.. Katten ikke 9131), kanin polyklonale anti-α tubulin (kat 2144..), Kanin monoklonalt anti -GSK-3β (kat 9315.), anti-fosfor-GSK-3β (pSer9;.. katt ingen 9336)., mus monoklonalt anti-β-catenin (.. kat 9582) og anti-GAPDH (kat . 2118) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). STA-21 ((S) -Ochromycinone deoxytetrangomycin;.. Kat sc-200 757), anti-Cyclin A2 (.. Kat sc-596) og muse anti-Cyclin E1 (.. Kat sc-247) ble anskaffet fra Santa Cruz Bioteknologi (Dallas, TX, USA). Alexa 488-konjugert sekundært antistoff (kat. Nr. A11008) ble oppnådd fra Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Y-27632 ((R) – (+) – trans-N- (4-pyridyl) -4- (1-aminoetyl) cvkloheksankarboksamid;. Katt nr US1688000). Ble innkjøpt fra Calbiochem EMD Millipore (Darmstadt, Tyskland)
Cell kultur og LPA behandlinger
den menneskelige kolorektal adenokarsinom cellelinjer Caco-2 (HTB-37TM) og HT-29 (HTB-38TM), den menneskelige tykktarmskreft cellelinje HCT-116 ( CCL-247TM) og eggstokk-kreft cellelinje OVCAR-3 (HTB-161) ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Kolon kreftceller ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin G (60 mg /l) og streptomycin (100 mg /l) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 /luft. Cellene ble passert ukentlig med 0,05% trypsin /0,02% EDTA i PBS-løsning. Ovarian adenokarsinomceller ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI 1640) (Sigma-Aldrich) som ble supplert med 20% FBS, penicillin G (60 mg /l) og streptomycin (100 mg /l) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 /luft. Caco-2 celler har en differensiert fenotype når de danner en konfluent monolag, med lav invasiv og metastatisk potensial; HT-29 celler er moderat differensierte, mens HCT-116-celler har en udifferensiert fenotype og høy karsinogent potensial. Så, disse cellene representere forskjellige stadier av CRC progresjon. Cellekulturene ble skiftet til serumfritt medium i 24 timer før den 10 uM LPA behandling, som tidligere rapportert [10].
Selektive farmakologiske inhibitorer ble tilsatt til cellekulturene 1 time før behandling og LPA var til stede i løpet av behandlingen som angitt. Inhibitorene ble fortynnet i DMSO og lagret ved -20 ° C. Hver konsentrerte oppløsning ble fortynnet umiddelbart før bruk for å gi endelige konsentrasjoner på 10 uM Y-27632 (ROCK) og 10 uM STA-21 (STAT-3).
Western-blot-analyse
behandlede celler ble homogenisert i lyseringsbuffer (1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,2% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM Hepes, pH 7,4) inneholdende 20 mM NaF, 1 mM ortovanadat, og en protease inhibitor cocktail (Sigma, MO, 1: 100 fortynning) i 30 minutter ved 4 ° C. Den homogeniserte lysater ble forelagt sentrifugering ved 10.000 g i 10 min ved 4 ° C. Supernatantene ble samlet og lagret ved -80 ° C for etterfølgende analyse. Like mengder av protein (30 til 60 ug /spor), kvantifisert ved BCA proteinanalysesettet (BioRad, Hercules, CA, USA), ble fremstilt ved koking etter tilsetning av denaturering prøvebuffer; de ble elektroforetisk separert ved SDS-PAGE på 7,5, 10 eller 12% geler og overført til nitrocellulosemembraner ved hjelp av en semi-tørr overføring celle (Bio-Rad) ved 10 V i 60 minutter. Membranene ble blokkert i 1 time med TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 137 mM NaCl og 0,1% Tween-20) inneholdende 5% lav-fett tørrmelk eller med 1% BSA (Sigma); de ble inkubert over natten med følgende primære antistoffer: anti-LPA
1 (1: 500), anti-LPA
2 (1: 500), anti-LPA
3 (1: 500), anti -α-tubulin (1: 1000), anti-GAPDH (1: 3000), anti-β-catenin (1: 1000), anti-GSK3p-β (1: 1000), anti-fosfo-GSK3p-β (Ser9 ) (1: 1000), anti-STAT-3 (1: 1000), anti-fosfo-STAT-3 (Tyr 705) (1: 1000), anti-cyclin A2 (1: 2000), anti-cyclin E1 ( 1: 2000) og anti-cyklin B1 (1: 2000). Etter vasking ble membranene inkubert i 1 time med peroksidase-konjugert geite-anti-kanin eller anti-mus IgG (1: 5000). Deretter ble membranene vasket, og proteinbånd ble visualisert ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens kit (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK). Bandet bilder av tre uavhengige forsøk ble kvantifisert ved optisk tetthet ved hjelp LabWorks 4.6 programvare (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
RhoA aktiveringstest
Aktivitetene i Rho protein ble bestemt ved hjelp av en bestemt G-LISA
TM
RhoA Aktivering analysen Biochem Kit
TM (Cytoskjelett, CO, EUA) etter produsentens anvisninger. I korthet ble Rhotekin RBD bundet til platene som brukes til å utfelle GTP-bundet Rho fra cellelysatet. Den aktive RhoA ble påvist ved anvendelse av et spesifikt antistoff mot Rho og ble visualisert ved anvendelse av en kjemiluminescens reaksjon. Graden av aktivering ble målt ved absorbans innstilt ved 490 nm i en mikroplate-spektrofotometer.
sårhelende assay
cellemonolag ble serum-sultet i 24 timer, behandlet med LPA og oppskrapet ved hjelp en steril pipette tips. For hver rett ble tre sår manuelt gjort, og de tre vanlige såret steder ble bekreftet under en Axio Observer Z1 mikroskop (Carl Zeiss, Inc., Jena, Tyskland) er utstyrt med en Axio Cam HRc og en Axio Vision versjonen 8.2 Bilde Analyzer; sårene ble deretter valgt og merket. Etter vasking med PBS, ble friskt medium inneholdende inhibitorene tilsatt til cellene, som ble inkubert ved 37 ° C i serumfritt DMEM inneholdende 10 uM LPA. Ubehandlede og behandlede celler ble tillatt å migrere inn i såret området og ble fotografert både umiddelbart etter såret (0 h) og 24 timer etter såret. Avstanden mellom de to kantene av skaden ble kvantifisert ved hjelp av Adobe Photoshop 6.0 fra tre uavhengige forsøk. Verdiene er representert i prosent og plottet på grafen.
Invasion analysen
For å teste svulst celle invasjon, en transwell med en 6,5 mm polykarbonat filter (8 mikrometer porestørrelse, kat. No. 3422; Costar, Cambridge, Massachusetts) ble belagt med 20 ul av Matrigel® (Cat nr 356230;.. BD Biosciences, San Diego, CA) fortynnet i DMEM (01:10) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Caco-2 (2,5 x 10
4), HT-29 (2 x 10
4), HCT-116 (2 x 10
4) og OVCAR-3 (2 x 10
4) celler i 200 ul serumfritt medium med LPA, ble sådd i det øvre kammer av transwell. Kulturmedium med 20% FBS ble tilsatt som en kjemoattraktant i det nedre kammer. Etter 48 timers inkubering ble den øvre overflaten av membranen skrubbet med en bomullspinne. Den invaderte celler i den nedre membranen ble fiksert i etanol i 10 minutter og farget med krystallfiolett. Antallet invaderte ubehandlede og behandlede celler ble uttrykt som gjennomsnittet av fire tilfeldige felt under mikroskopet. Verdiene er representert i prosent og plottet på diagrammet. OVCAR-3 ble anvendt som en positiv kontroll av LPA effekt.
forankrings-uavhengig vekst
Caco-2, HT-29 og HCT-116 celler ble sådd i en 12-brønns plate ( tidligere er dekket med 1 ml 0,6% agarose-semi-faststoff) ved en tetthet på 250 celler /brønn i en oppløsning av DMEM inneholdende 10% SFB og 0,3% agarose i 30 minutter. DMEM med 10% FBS som enten inneholdt LPA eller ikke inneholde LPA (kontroll) ble tilsatt til toppen av den halvfaste oppløsningen og ble fornyet hver 3. dag. Etter 14 dager ble koloniene dannet avbildes og telles ved hjelp av en Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Inc.) mikroskop utstyrt med en Axiocam MRC5 kamera.
Celleviabilitet analyse
HT-29 ( 1×10
3 celle /ml) og HCT-116 (2 x 10
4 celle /ml) celler ble sådd og dyrket i 96-brønners plater, og etter FBS uttømming, behandlet med en av de følgende løsninger: 10 uM LPA alene, 10 uM STA-21, 10 uM Y-27632, eller LPA i kombinasjon med disse inhibitorer i de angitte tidsrom før inkubering med MTT (Sigma Chemical Co.). Cellene ble opprettholdt i 2 timer ved 37 ° C og sentrifugert ved 1500 g i 5 min. Supernatanten ble fjernet, og krystallene ble oppløst i DMSO. Absorbansen ved 538 nm ble målt med en Spectra-Max 190 spektrofotometer (Molecular Devices Sunnyvale, CA).
celleproliferasjonsanalyse
krystallfiolett-metoden ble anvendt for å måle celleproliferasjon. Caco-2 (2×10
4 celle /ml), HT-29 (10
3 celle /ml) og HCT-116 (2×10
4 celler /ml) celler ble dyrket i 96-brønners plater og ble FBS-utarmet og behandles som angitt med LPA og hemmere av STAT-3 og ROCK for 24, 48 og 72 timer og fast med etanol i 10 min. Den krystallfiolett-oppløsning (0,05% krystallfiolett og 20% metanol) ble tilsatt i 10 min. Cellene ble vasket to ganger med vann og deretter oppløst med metanol. Absorbansen ved 595 nm ble målt med en Spectra-Max 190 spektrofotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Verdiene er representert i prosent og plottet på grafen.
apoptose og overlevelsesanalyse
HT-29 og HCT-116 celler (10
5-10
6 celler /ml) ble dyrket i seks-brønners mikrotiterplater og ble serum-sultet i 24 timer. Etter, de ble behandlet i 24, 48 og 72 timer med 10 uM LPA. Apoptose ble påvist ved en Annexin V /propidiumjodid (PI) farging analyse for å påvise tidlig apoptotiske celler, sen apoptotiske celler, og ikke-apoptotiske celler ved de angitte tider. Cellene ble vasket i iskald PBS og resuspendert i 100 pl av Annexin V bindingsbuffer (0,1 M Hepes /NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl
2) inneholdende annexin V-FITC og PI ( 1 pg /ml) i 15 min. En FACS analyse ble utført ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer og Cellquest programvare (BDBiosciences, San Jose, CA, USA); cellene negative for både annexin V og PI ble ansett levedyktig (overlevelse).
Cell syklus analyse
HCT-116 celler (10
5-10
6 celle /ml ) dyrket i seks-brønners mikrotiterplater ble FBS utarmet og behandlet i 8, 12 og 16 timer med LPA og /eller inhibitorer av STAT-3 eller ROCK. Etter denne perioden ble cellene høstet ved trypsinering og vasket en gang med iskald PBS. Cellene ble deretter farget i mørket med 75 uM propidiumjodid (Sigma) i 10 minutter i en buffer inneholdende 3,4 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM NaCl, 0,2% Triton X-100 og 3500 U /L RNAse. En analyse av DNA-innhold ble utført ved å samle 10.000 hendelser for cellesyklus og sub-G1 analyse ved hjelp av et FACSCalibur strømningscytometer (BD Transduction Labs, Lexington, KY, EUA) og Mod Fit LT-programvare.
Immunofluorescence
cellene ble sådd ut på dekkglass som hadde blitt plassert på 24-brønners plater på forhånd. Etter uttømming FBS og behandling ble cellene vasket i PBS supplert med 100 mM CaCl
2 og 100 mM MgCl
2 (PBS /CM) og fiksert i 100% metanol i 20 min. Prøvene ble permeabilisert med 0,5% TX-100 i PBS i 10 min. Senere ble cellene inkubert i 50 mM NHCl
4 i PBS i 10 min og blokkert i 3% BSA i 1 time. Cellene ble inkubert med primære antistoffer, anti-β-catenin (1: 250) og anti-STAT3 (01:50) i 1 time, etterfulgt av en ytterligere time med inkubering med sekundær Alexa 488-konjugert anti-kanin eller anti -mouse antistoffer. Deretter ble cellene inkubert med 40,6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) (1: 1000) i 3 minutter. Glassene ble vasket i PBS og montert med
n
propyl-gallate, og cellefarging ble oppdaget ved hjelp av en Axio Observer Z1 immuno-fluorescens mikroskop utstyrt med en Axiocam HRc Rev. 3 kamera og en Axiovision versjonen 4.8. en bildeanalysator program (Carl Zeiss Inc., Tyskland)
luciferase-analyse for TCF aktivitet
To forskjellige TCF-luciferase reportergener ble anvendt i denne analyse. intakt villtype-TCF-luciferase reporter-konstruksjonen (SUPER 8 TOPFLASH) og en mutert TCF-luciferase reporter-konstruksjonen (SUPER 8 FOPFLASH), som ble anvendt som en negativ kontroll. HCT-116 (2×10
4) celler ble sådd ut i seks-brønns plater og transient transfektert med 2 pg av det SUPER 8 TOPFLASH eller FOPFLASH reporter plasmid, sammen med 3 ul av FUGENE® 6 Transfeksjon reagens (Roche). Som en kontroll for transfeksjonseffektivitet, 0,2 ug av et Renila luciferase-konstruksjonen ble inkludert i hver transfeksjon. Etter 24 timer etter transfeksjon, ble cellene vasket to ganger med PBS, FBS utarmet i 24 timer og deretter behandlet med 10 uM LPA. Cellene ble høstet 6 og 24 timer etter transfeksjon, og ekstrakter ble preparert med 200 pl reporter lyseringsbuffer (Promega). Renila og luciferase-aktiviteten ble analysert i henhold til produsentens protokoll ved anvendelse av en kit Dual-luciferase reporter Assay System (Promega). Luciferaseaktiviteten i hver brønn ble normalisert til den renila aktivitet. Tre uavhengige eksperimenter, hver analysert i tre eksemplarer, ble utført på separate celle passasjer.
Expression Chip tabellens dataanalyse
Total RNA fra FBS-utarmet HCT-116 celler som ble enten behandlet eller ikke med LPA i 12 timer ble oppnådd ved anvendelse av en RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Ett hundre nanogram total RNA ble brukt til å syntetisere biotinylated cRNA henhold til Genechip hele transkripsjon (WT) følelse target-merkingsassay (
Affymetrix
,
USA
). Etter ble biotinylert cRNA hybridisert til Genechip menneskelige genet 1,0 ST array (
Affymetrix
,
USA
), vasket og farget i henhold til produsentens protokoller. De Genechip arrays ble skannet med en GeneChip® Scanner 3000. Affymetrix Expression Console Software Versjon 1.0 ble brukt til å lage oppsummert uttrykk verdier (CHP-filer), og Robust multichip Analysis (RMA) algoritme ble brukt. Dataene ble analysert ved hjelp av Partek
® programvare (https://www.partek.com) [24]; differensielt uttrykte gener med ≥ 2-fold-forandring ble anvendt som kriterier for å definere overekspresjon eller nedregulering. De pathway analyse og relaterte prosesser ble oppnådd ved hjelp MetaCore
TM programvare (https://thomsonreuters.com/metacore) og oppfinnsomhet
® Pathway analyse programvare (https://www.ingenuity.com).
statistisk analyse
Den statistiske analysen av tre uavhengige eksperimenter ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Statistiske analyser av migrasjon, invasjon, forankringsuavhengig vekst, TCF aktivitet og protein optisk tetthet ble utført ved hjelp av Student t-tester; cellesyklusanalyse ble utført ved anvendelse av en enveis ANOVA med Bonferroni post-test; og en to-tailed ANOVA med Bonferroni post-testen ble utført for celleproliferasjonsanalyse. Dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. En forskjell ble ansett statistisk signifikant når P * 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001
Resultater
kolorektal kreft celler uttrykker LPA reseptorer i en differensial måte, men LPA behandling endrer ikke cellemigrasjon, invasivitet, eller ankeruavhengig vekst
i utgangspunktet vi undersøkt uttrykket nivåer av LPA reseptorer i tre cellelinjer for tykktarmskreft, Caco-2, HT-29 og HCT-116, ved hjelp av western blotting. Figur 1 viser at Caco-2, HT-29 og HCT-116 celler uttrykker reseptorer LPA
1, LPA
2 og LPA
3 i differensial oppførsel. Den lave grad av invasive Caco-2-celler presentert lavere nivåer av LPA
1 og LPA
3 i forhold til de andre cellelinjer, og høyere nivåer av LPA
2 i forhold til HT-29. Den mellomliggende invasiv HT-29 cellene uttrykte lignende nivåer av alle tre LPA reseptorer; og den sterkt invasive HCT-116-celler presentert høyere nivåer av reseptorene LPA
2 og LPA
3, i forhold til Caco-2 og HT-29 celler, men lavere nivåer av LPA
1 i forhold til HT-29. Dette resultatet indikerer at i virkeligheten de tre cellelinjer reagerer på denne biolipid. Noen studier har vist at LPA medierer cellemigrering i et bredt spekter av kreftcelletyper [25,26], og vi har tidligere vist at LPA øker migrering av Caco-2-celler [10]. Derfor ønsket vi å evaluere effekten av LPA om hendelser knyttet til kreft progresjon i tykktarm kreft celler med en høyere invasiv potensial. Derfor utførte vi sårhelende, en celle invasjon analysen og forankringsuavhengig vekst (AIG) i Caco-2, HT-29 og HCT-116 celler. Vi fant ut at LPA ikke endre cellemigrasjon i HT-29 og HCT-116 celler eller øke invasiv potensialet i de tre tykktarmskreft cellelinjer; Videre, LPA endret ikke tumorigenisitet, som evaluert ved AIG (S1, S2 og S3 figurene, henholdsvis).
Representative western blotting og densitometriske analyser av Caco-2, HT-29 og HCT-116-celler ved hjelp spesifikke antistoffer mot LPAR
1-3 (ac, henholdsvis). Caco-2 celler som uttrykker høye nivåer av LPA
2, HT-29 celler som uttrykker høye nivåer av LPA
1-3 og HCT-116 celler som uttrykker høye nivåer av LPA
2-3. Gjennomsnittlig score ± SEM. for tre uavhengige eksperimenter er vist.
LPA ikke induserer celledød, men øker spredning ved å fremme celle progresjon til S-fasen og deretter G2 /M faser
Fordi LPA øker celle spredning og unndragelse av død i tykktarm kreft celler [8,9,27], bestemte vi oss for å vurdere om LPA modulerer celleviabilitet i vår studie. Våre resultater viste at etter 48 og 72 timer etter behandling, øket LPA antallet levedyktige HCT-116 celler, men ikke antallet levedyktige Caco-2 og HT-29-celler (figur 2A). Fordi økt antall levedyktige celler kan indikere induksjon av proliferasjon eller minsket celledød ved apoptose flukt, bestemt vi hvorvidt LPA kunne påvirke celledød ved inkubering av serum-sultet HCT-116-celler med LPA for 24, 48 og 72 timer, og deretter flekker celler med Annexin V og PI (fig 2B og 2C). LPA ikke endre antallet døde celler, noe som indikerer at økningen i celletall observert på figur 2A skjer gjennom økning i celleproliferasjon og ikke reduksjon av dødsfall. For å bestemme hvorvidt den LPA-indusert HCT-116 celleveksten var et resultat av endring av cellesyklusregulering, ble cellesyklus profilene overvåkes av en strømningscytometrisk analyse av DNA-innhold. Som vist i figur 3, fordeling i de faser av cellesyklusen indikerte at behandling med LPA for 8, 12 og 16 timer fremmet celle progresjon til S-fasen og deretter G2 /M-faser, hvor befolkningen økte i forhold til serum-sultet celler.
kolon kreftceller ble FBS sultet i 24 timer og deretter behandlet med LPA (10 uM) i 24, 48 eller 72 timer. Det relative celleantall ble bestemt ved krystallfiolett farging (a), og apoptose ble etterfulgt av Annexin V-/PI dobbel fargemetoden (b). a) LPA økte den relative antall HCT-116-celler, men ikke Caco-2 eller HT-29-celler. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av
toveis
ANOVA med
post-hoc
Bonferroni test. ** P 0,01; *** P 0,001. Gjennomsnittlig score ± SEM. for tre uavhengige eksperimenter er vist. b) FACS-analyse via Annexin V-FITC /PI farging viste at LPA ikke reduserte celledød i HCT-116-celler. Fire forskjellige cellepopulasjoner ble oppdaget etter Annexin V /PI farging av HCT-116 celler. Alive cellene er gruppert i nedre venstre del av panelet, er tidlig apoptotiske celler gruppert i nedre høyre del av panelet, blir sent apoptotiske celler gruppert i høyere høyre del av panelet og nekrotiske celler er gruppert i høyere venstre del av panelet. FL1-H, Annexin V; FL2-H, PI. c) Dataene oppnådd fra strømningscytometriske analyser er plottet i en graf. Det var ingen økt andel av LPA-mediert apoptose.
Cellene ble FBS sultet i 24 timer (forts, kontroll), behandlet med LPA på angitte tidspunkter, farget med PI og analysert ved hjelp av FACS. a) Andelen av celler i G2 /M fasen ble signifikant økt etter 12 og 16 timer med LPA behandling. M1: celler i G1; M2: celler i S-fasen; M3: celler i G2 /M. b) Den kurve som viser prosentdelen av S- og G2 /M-celler i forhold til kontrollgruppen. Andelen av DNA i S-fasen ble beregnet ved anvendelse ModfitLT Software. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av
enveis
ANOVA (*** p 0,001). PI, propidiumjodid; FACS, fluorescens-aktivert cellesortering.
LPA-indusert celleproliferasjon av HCT-116 innebærer Rho-ROCK signale aktivering
Basert på tidligere studier som viser at LPA aktiverer liten GTPase Rho [14] og at Rho regulerer celleproliferasjon i ulike celletyper [28], bestemte vi oss for å undersøke om LPA-induserende spredning av HCT-116 celler er Rho-ROCK avhengig. Celle lagene ble serum-sultet i 1 time, etterfulgt av behandling med 10 uM LPA ved de angitte tider; vi deretter utførte Rho aktivitetsanalyse. Fig S4 viser at LPA induserer RhoA aktivering først og fremst ved 5 og 15 minutter etter behandling. Dette resultatet bekrefter tidligere studier som viser at LPA aktiverer RhoA GTPase.
Neste, vi undersøkt om LPA aktiverer ROCK nedstrøms Rho og om dette signalveien er ansvarlig for å modulere celleproliferasjon. Derfor utførte vi en krystallfiolett analyse og cellesyklusanalyse etter hemming av ROCK med Y-27632. Resultatene tyder på at inhibisjon ROCK forhindret økning i det relative celleantall etter behandling med LPA i 48 timer (Figur 4A). Videre er ROCK inhibitor forhindret LPA-induserte cellesyklusprogresjon (figur 4B). Disse data understøtter ideen om at LPA induserer HCT-116 celleproliferasjon gjennom Rho-ROCK-aktivering.
Subkonfluente cellemonolagene ble FBS utarmet i 24 timer og behandlet med LPA ved de angitte tider. a) Krystallfiolett farging av HCT-116 viste at ROCK inhibitoren Y-27 632 (10 uM) forhindret en LPA-mediert økning i det relative celleantall etter 48 timers behandling. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av
toveis
ANOVA med
post-hoc
Bonferroni test. *** P 0,001, vs kontroll; ### P 0,001, vs LPA. Gjennomsnittlig score ± SEM. for tre uavhengige eksperimenter er vist. b) FACS-analyse via PI farging viste at ROCK inhibering med Y-27632 forhindret LPA-induserte økning i andelen av celler i S-G2 /M-fasen. De statistiske analysene ble utført ved hjelp av
enveis
ANOVA med
post-hoc
Bonferroni test. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. (*** P 0,001, vs kontroll, ## p 0,01, vs LPA)
LPA aktiverer STAT-3 for å megle celleproliferasjon i en Rho-ROCK uavhengig måte
Det er velkjent at både LPA og Rho kan utløse forskjellige signalbaner for å modulere celleproliferasjon. Videre har vi tidligere vist at LPA forstyrrer adherens veikryss i Caco-2 celler gjennom Rho-ROCK signale [10], og en studie utført av Yang
et al
.
