Abstract
hematogenous metastase står for de fleste kreftrelaterte dødsfall, men likevel mekanismen er fortsatt uklart. Sirkulerende tumorceller (CTCs) i blodet kan bruke forskjellige veier å krysse blod endothelial barriere og etablere en metastatisk nisje. Flere studier gir holdepunkter for at prostatakreft (PCA) celle-deling og rulle på mikrovaskulær endotelet via E-selektin /E-selectin ligand interaksjoner under skjæring flyt teoretisk fremme bloduttredelse og bidra til utvikling av metastaser. Imidlertid er det ikke kjent om CTCs fra PCA-pasienter samvirke med E-selektin uttrykkes på endotel, initiere en rute for tumormetastaser. Her rapporterer vi at CTCs avledet fra PCA pasientene viste interaksjoner med E-selektin og E-selektin uttrykker endotelceller. For å undersøke E-selektin-medierte interaksjoner av PCA cellelinjer og CTCs avledet fra metastatisk PCA pasienter, vi brukte fluorescens-merket anti-prostata spesifikt membranantigen (PSMA) monoklonalt antistoff J591-488 som er internalisert følgende celleoverflaten bindende. Vi har anvendt en mikrostrømningsanordning som består av E-selektin-belagte mikrorør og humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) på parallell-plate strømningskammeret simulere vaskulært endotel. Vi observerte at J591-488 ikke vesentlig endre rullende atferd i PCA celler ved skjærspenninger under 3 dyn /cm
2. CTCs innhentet fra 31 PCA pasientprøver viste at CTCs tjore og stabilt samhandle med E-selektin og E-selektin uttrykke HUVECs på fysiologisk skjærspenning. Interessant, prøver samlet inn i løpet av sykdomsutviklingen viste signifikant flere CTC /E-selektin interaksjoner enn prøvene i tider med terapeutisk respons (
p
= 0,016). Analyse av ekspresjon av sialyl Lewis X (SLE
x) i pasientprøvene viste at en liten del som omfatter 1,9 til 18,8% av CTCs besitter høy SLE
x uttrykk. Videre ble E-selektin-medierte interaksjoner mellom prostata CTCs og HUVECs redusert i nærvær av anti-E-selectin nøytraliserende antistoff. CTC-endotelceller interaksjoner gi en ny innsikt i potensielle selvklebende mekanismer for prostata CTCs som et middel for å initiere metastase
Citation. Gakhar G, Navarro VN, Jurish M, Lee GY, Tagawa ST, Akhtar NH, et al . (2013) Sirkulasjonstumorceller fra pasienter med prostatakreft Samhandle med E-selektinuttrykk henhold fysiologisk Blood Flow. PLoS ONE 8 (12): e85143. doi: 10,1371 /journal.pone.0085143
Redaktør: Kjetil Tasken, Universitetet i Oslo, Norge
mottatt: 27 august 2013; Godkjent: 23 november 2013; Publisert: 27.12.2013
Copyright: © 2013 Gakhar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en postdoktor opplæring prisen fra Department of Defense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124, til G. Gakhar); U54CA143876 fra National Cancer Institute (til D. M. nanus og M.R. King); David H. Koch Foundation og Robert Dow Foundation (til N.H. Bander); National Science Foundation Graduate Research Fellowship (til Y. Geng); fra USA NIH (R01 CA137020-01, P. Giannakakou); The Charles H. Leach, II Foundation, og Robert H. McCooey Genitourinary Oncology forskningsfond; fra Clinical Translasjonell Science Center, National Center for Advancing Translasjonsforskerne Sciences (UL1-TR000457-06, til PJ Christos). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter. NHB er en oppfinner på patenter relatert til J591 antistoff brukt i denne studien (Se Fil Feste Bander_J591Patent). Disse patentene er tildelt Cornell. Dr. Bander er konsulent for og har eierandeler i Bzl Biologics, selskapet som patenter ble lisensiert av CRF for videre forskning og utvikling. MS er en co-oppfinner på følgende patent som dekker bruk av E4ORF1 endotelceller (endotelceller Uttrykke Adenovirus E4ORF1 og metoder for bruk av disse, US Patent # 8,465,732). Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Utviklingen av metastaser er en hypotese for å initiere via liknende mekanismer som brukes av leukocytter for adhesjon og sjelevandring gjennom blod endotelet [1]. Den leukocytt rekruttering kaskade til endotelet ved betennelse innebærer sekvensielle trinn inkludert tethering, rullende, heft, og til slutt sjelevandring. Den innledende skritt for tethering og rullende skjer gjennom dynamiske og forbigående interaksjoner mellom selectins uttrykt av endotelceller (ECS) og deres respektive ligander tilstede på leukocytter i løpet av blodstrøm forårsaker kontinuerlig bryte og dannelse av reseptor-ligand obligasjoner. Denne syklusen fører til den karakteristiske rullende oppførsel av leukocytter [2]. Hos mennesker har E-selektin vist seg å være hovedansvarlig for selektin-mediert rullende og tethering [3].
Mange studier med tumorcellelinjer og musemodeller viser at endothelial (E) -selectin er også involvert i tumor celle adhesjon, migrasjon og utvikling av metastaser [4,5].
In vivo
musemodeller har vist at E-selektin fremmer metastaser [6] og omdirigeringer metastaser til leveren [7]. Cimetidin, som inhiberer induksjonen av E-selektin ekspresjon, betydelig nedsatt levermetastaser av HT-29 colon cancerceller i en atymisk mus modell uten at det påvirker den primære svulsten [8]. Videre E- og P-selektin som mangler mus injisert med HT-29 tumorceller viste en signifikant reduksjon i antallet lungemetastaser sammenlignet med villtype mus [9].
koblingen mellom E-selektin og metastase førte til mange studier som karakteriserer selektin ligander på tumorcelleoverflater. Selektin ligander er spesifikke glykoproteiner, som blir funksjonell etter post-translasjonell modifikasjon av glycosyltransferases og sulfotransferaser. Tilstedeværelsen av sialyl-Lewis-X (SLE
x) og sialyl-Lewis et (SLE
a), karbohydrat epitoper av selektin-ligander [10,11] er ofte assosiert med cancer progresjon og dårlig prognose [12,13 ]. Studier tyder også på at tropisme av PCA celler til benet er knyttet til samspillet mellom E-selektin uttrykt på benmarg endotelceller (ECS) og E-selektin ligander tilstede på PCA celler [14].
bevis impliserer rollen som E-selektin og deres ligander i tumormetastase avledet fra studier med tumorcellelinjer, men har aldri blitt bekreftet i sirkulerende tumorceller (CTCs) avledet fra pasienter. Vi rapporterer her ved hjelp av
ex vivo
forhold som CTCs isolert fra menn med kastrering resistent prostatakreft (CRPC) demonstrere fysiske interaksjoner, hovedsakelig tethering og fast heft, med E-selektin-belagte overflater og E-selektin uttrykker egenkapitalbevis under fysiologiske blodstrømmen. I tillegg CTC /E-selektin interaksjoner viste en signifikant sammenheng med klinisk respons av pasientene til behandling. Disse interaksjonene ble redusert i nærvær av anti-E-selectin nøytraliserende antistoff. Videre fant vi variable uttrykk for SLE
x på CTCs, noe som tyder på at sannsynlig ikke alle CTCs bidra til metastaser.
Materialer og metoder
Cellelinjer
PC3, c4-2, LNCaP, MDA PCa 2b (MDA), og KGI celler fra ATCC (Manassas, VA, USA ). PCa cellelinjer PC3, c4-2, og LNCaP ble opprettholdt i RPMI supplert med 10% FBS, og MDA PCa 2b (MDA) ble holdt i F-12K media supplert med 20% føtalt bovint serum (FBS), 10 ng /ml EGF, 0.005mg /ml insulin, 100 pg /ml hydrokortison, 25 ng /ml koleratoksin, 45 nM selenious syre, og 0,005 mM phosphoethanolamine. KG1 celler (akutt myelogen leukemicellelinje) ble dyrket i IMDM media supplert med 20% FBS.
Etikk erklæringen og pasient prøvetaking
Under en Weill Cornell Medical College Institutional Review Board (IRB) godkjent protokoll, 31 perifere blodprøver ble oppnådd fra pasienter med CRPC og 10 perifere blodprøver ble tatt fra friske donorer etter skriftlig informert samtykke. Blod ble oppnådd i enten Ficoll-Paque rør (7,5 ml blod hver) eller BD Vacutainer-rør (2,7 ml blod hver; Becton Dickinson) som inneholder 2,3% natriumsitrat antikoagulant. De identifiserte kliniske opplysninger ble innhentet. Fastsettelse av svulst tilstand (klinisk progresjon eller klinisk respons) ble bestemt etter 2 uavhengige leger som bruker standardkriteriene.
Surface Merking med anti-PSMA monoklonalt antistoff J591
MDA celler ble trypsinert, sentrifugeres, og inkubert i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) /10 mM HEPES /2 mM CaCl
2 /0,5% humant serum albumin (buffer i). Monoklonalt antistoff J591 [15] som gjenkjenner det eksterne domene av prostata spesifikt membran antigen (PSMA), konjugert med Alexa fluor-488 (J591-488) ble tilsatt til MDA og PC3-celler (alene og celler piggete i normalt, friskt blod) ved 20 ug /ml i 30 minutter ved romtemperatur på en rotator, sentrifugert ved 1500 rpm i 5 minutter, og pelleten ble resuspendert i RPMI-medium. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra normale friske blod ved hjelp av Ficoll tetthetsbaserte sentrifugering ble likeledes behandlet, og plassert på BD-celle-tak (BD Biosciences, San Jose, CA) belagt med dekkglass cytospin. PBMC ble fiksert ved bruk av 2% formaldehyd (Tousimis, Rockville, MD) og farget med muse anti-CD45-antistoff (1: 200, klon 2D1, BD Pharmingen, San Jose, CA), vasket med PBS og inkubert med geite-anti-mus Alexa fluor (AF) -594 sekundært antistoff, vasket og kontra med DAPI.
Anriking av CTCs av anti-CD45 immunomagnetisk perle uttømming
å berike for CTCs, PBMC isolert fra perifert blod ved Ficoll tetthet -basert sentrifugering ble utsatt for negativ seleksjon for leukocytter ved hjelp av anti-CD45 immunomagnetiske perler (Life Technologies, Grand Island, New York). PBMC ble vasket to ganger med 2% RPMI /4 mM MgCl
2/1 mM CaCl
2 buffer (buffer II) og inkubert med pre-vasket anti-CD45 immunomagnetiske kuler i 1 ml buffer I i 20 min på en rotator. Etter inkubering ble 35 ml buffer I ble tilsatt, og cellene ble holdt på en magnet i 10 minutter ved 4 ° C. Cellene ble sentrifugert ved 400 g i 12 min og anti-PSMA J591-488 antistoff ble tilsatt i 40 minutter, sentrifugert og resuspendert i buffer I og rullende analyser ble utført. For farging eksperimenter, etter anti-CD45 Immunomagnetisk uttømming ble cellene resuspendert i 500 mL av 2% RPMI medium og cytospun på positivt ladede glassplater (Thermo Scientific, Asheville, NC). Slides ble lagret ved -20 ° C for påfølgende immunfarging.
Flow-Based Micro analysen
Kort, steril 50 cm lengde på 300 mikrometer «D» microrenathane rør (Braintree Scientific, MA) var inkubert med 10 mg /ml protein-G-løsning i 1,5 timer, etterfulgt av en 2 timers inkubasjon med 10 ug /ml humant rekombinant IgG E-selektin [16] (R 2) Rolling /deling CTCs (dvs. refererer tilknytning til CTCs som festes til overflaten, og deretter koble på mindre enn fem sekunder og sett igjen); og 3) Ikke-heft CTCs (CTCs som ikke rulle /tjore eller holder seg til overflaten).
Immunofluorescent farging av celleoverflatemarkører
Etter anriking av PBMC fra PCA pasienter, isolerte celler var festet til glassplater ved cytospin, fiksert i 2% formaldehyd (Tousimis, Rockville, MD) i 20 minutter, og vasket 3 x med PBS. Celler ble blokkert med 2% BSA i 1 time, og inkubert med primære antistoffer rotte-anti-SLE
x (01:10, Heca-452, BD Pharmingen, San Jose, CA) eller kanin polyklonalt anti-CXCR4 (1: 100, Novus Biologicals, Littleton, CO) mAbs i 1 time, og inkubert med sekundært Abs (geit-anti-rotte AF594 og geite-anti-kanin Dylight 405) i 1 time, inkubert i AF-488 og AF-647 konjugerte primære antistoffer for anti-PSMA (humanisert) og anti-EpCAM (mus, Clone 9C4, BD Biosciences), henholdsvis og montert på en coverslide med nylagde Mowiol (Calbiochem, Billerica, MA). Alle inkubasjoner ble utført ved romtemperatur, etterfulgt av 3 x vask med PBS pluss 0,5% BSA. For immunofluorescerende farging, MDA, PC3, KG1cells, og PBMC erholdt fra normale, friske donorer ble anvendt som negative og positive kontroller for forskjellige proteiner. Kontrollceller ble podet på BD Cell-Tak belagte dekkglass og behandlet på samme måte som pasientprøver. Kvantifisering av SLE
x uttrykk data ble innhentet ved hjelp Metamorph
TM programvare (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA) og måle gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) per piksel [20]. Bakgrunnsintensiteten, bestemmes ved å velge et område som ikke har CTCs, ble subtrahert fra disse verdiene for hvert bilde. For disse målingene, ble Z-stabler av de oppkjøpte bilder som brukes tatt av LSM 700 Zeiss Observer.Z1 (Carl Zeiss, Microimaging Inc, Thornwood, New York).
Western blot og immunofluorescene for E-selektin uttrykk i HUVECs
Både 1 ° og E4ORF1 HUVECs ble stimulert med IL-1β 4 timer. Etter at IL-1β stimulering, ble både ustimulerte og stimulerte celler ble vasket tre ganger med iskald PBS. Celler ble resuspendert i lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH = 7,5, 5 mM EDTA) inneholdende Protease Inhibitor cocktail tabletter (en tablett /10 ml lyseringsbuffer; Roche). Proteinkonsentrasjoner av cellelysatet ble bestemt ved Bradford-metoden. Cellelysat ble fortynnet for å redusere 6X prøvebuffer (12% vekt /volum SDS, 0,06% vekt /volum bromfenol blå, 47% volum /volum glycerol, 0,5 M Tris, pH = 6,8, bringe volumet til 10 ml med destillert vann) og separert på 10% SDS-PAGE-gel. Løst proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membran (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) og blokkert i 5% melk i 1 time ved romtemperatur. Membranen ble kuttet og deretter inkubert med mus-anti-E-selectin (1: 500, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, CA) og muse anti-β-Actin (1: 10.000, Sigma Aldrich) for over natten ved 4 ° C. Immunoreaktivitets ble visualisert ved LI-COR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap). For immunofluorescens ble både 1 ° og E4ORF1 HUVECs stimulert med IL-1β i 4 timer og både ikke-stimulerte og IL-1-stimulerte HUVECs ble fiksert, permeabilisert med 0,1% Triton-X-100, og immunofarget med mus anti-E-selectin monoklonalt antistoff (2,5 mikrogram /ml, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, California) over natten ved 4 ° C. HUVECs ble farget med Alexa fluor geite-anti-muse-488 nm-antistoff (1: 500, Molecular Probes) i 1 time ved romtemperatur. HUVECs ble vasket og kontra med DAPI.
Statistical Analysis
Beskrivende statistikk presenteres med histogram som viser gjennomsnitts + standardavvik (SD). Midler ble sammenlignet med de to utvalgs t-test med riktig varians kalkulator. Boksplott ble gjort og ikke-parametrisk Wilcoxon rank sum test ble utført for å sammenligne distribusjoner (dvs. median, range) mellom gruppene. Et minimum av tre uavhengige eksperimenter ble utført med kreftcellelinjer. The Fishers eksakte test ble utført for å vurdere forholdet mellom pasient CTC /E-selektin interaksjon status og klinisk progresjon status. En p-verdi på
0,05
ble ansett som statistisk signifikant i alle analysene. Alle analyser ble utført i STATA versjon 10.0 (StataCorp, College Station, TX).
Resultater
Merking av prostata kreftceller med anti-PSMA J591-488 antistoff
Å studie CTCs isolert fra pasienter med CRPC, tok vi fordel av det faktum at 90% av PCA-celler uttrykker PSMA på deres celleoverflate [21,22], og anvendes mAbJ591-488, som gjenkjenner et eksternt domene av PSMA og er hurtig internalisert bindes til celleoverflate PSMA, for å identifisere PCa CTCs [15,23] .. MDA-celler som uttrykker PSMA og PC-3-celler (PSMA negativ kontroll) ble tilsatt separat til normalt friskt blod, og blandingen ble inkubert med mAbJ591- 488. Etter inkubering ble PBMC-lag inneholdende kreftceller oppsamlet. Som forventet (figur 1A), MDA celler som uttrykker PSMA internalisert mAbJ591-488 og var lett synlig under fluorescerende mikroskopi, mens mAbJ591-488 ikke binde seg til PC3 celler (Figur 1b). Blod spiking eksperimenter med MDA og PC3 ble utført seks ganger med forskjellige frisk donor blod. Ingen PSMA ekspresjon ble påvist i området leukocytter som ble identifisert ved farging med anti-CD45-antistoff (figur 1C). PSMA ekspresjon ble heller ikke observert i PC3-celler blandet med blod (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at mAbJ591-488 kan spesifikt merke PCA-celler og kan dermed brukes til å merke PCa CTCs.
Kreftceller ble platet enten alene (A, B) eller i nærvær av frisk donor avledet PBMC (C ). Celler ble merket med J591-488 antistoff (grønn) ved værelsestemperatur, deretter fiksert og immunofarget for CD45 (rød) og DAPI (blå). A) MDA-celler er positive for PSMA ekspresjon. B) PC3-celler er negativ, og derfor mangler PSMA uttrykk. C) Høyre subfigure viser spesifikke uttrykk for PSMA av MDA celler mens blodceller uttrykker CD45. PBMC isolert fra friske donorer ble blandet med MDA celler og behandlet som i A, B. PSMA-positive MDA kreftceller er klart og spesifikt avbildet (hvit pil) blant CD45-uttrykke leukocytter (pilspisser) i miksen.
Grønn = PSMA, Rød = CD45, og blå = DAPI
.
E-selektin-avhengige adhesjon av umerket og anti-PSMA J591-488 merket prostata kreftceller
I løpet av en betennelsesreaksjon, leukocytter holder seg til blodåreendotelets av interaksjoner mellom vedheft molekyler som er tilstede på den luminale siden av det vaskulære endotel og komplementære ligander til stede på leukocytter. Disse interaksjonene resultere i transient dynamisk adhesjon (rulling) av celler til karveggen [2]. Rolling er observert som følge av kontinuerlig bryt og dannelse av reseptor-ligand-bindinger ved den bakre ende av cellen og den fremre kanten av cellen, respektivt. For å undersøke hvorvidt E-selektin-avhengig interaksjon forekommer i prostata CTCs, vi først brukt MDA, PC3, LNCaP og c4-2 PCA-cellelinjene for å vurdere sin rullende oppførsel i nærvær av E-selektin-belagte overflater mikrorør. Ut av de fire PCA-cellelinjer som er undersøkt, vi bare oppdaget robust rullende oppførsel i MDA-celler (data ikke vist), i samsvar med tidligere studier [24,25].
monoklonalt antistoff J591 er internalisert følgende celleoverflatebinding som tyder på at PCa CTCs kan merkes
ex vivo Hotell og studert for CTC-endoteliale interaksjoner. Men for å utelukke muligheten for at J591-488 bindende og internalisering endrer rullende atferd, merket vi MDA celler med J591-488 og sammenlignet den rullende atferd med umerkede MDA celler ved skjærspenninger som spenner 0,5 til 8 dyn /cm
2 . Den midlere rullende hastighet av ikke-merkede og J591-488-merkede MDA-celler ved 0,5 dyn /cm
2 var 5,27 + 1,28 um /sek, og 5,23 + 1,85 um /sek (figur 2, p = 0,88, NS). Vi observerer en liten, men statistisk signifikant forskjell i gjennomsnittlig rullerende hastigheter på umerket versus J591-488 merket MDA celler på 3 (7,04 + 1,15 vs 6,33 + 1,22 mikrometer /sek,
p 0,005
) og 8 ( 17,81 + 3,51 vs 14,38 + 1,83 mikrometer /sek,
p 0,0005
) dyn /cm
2 skjærspenning. Derfor basert på våre resultater og tidligere studier har vi gjennomført eksperimenter på 0,6 dyn /cm
2, et mye brukt fysiologisk skjærspenning for å måle rullende oppførsel [17]. Dessuten har det vist seg at svulsten cellene rulle og tjore ved lavere skjærspenninger (
3 dyn /cm
2) [26]. Disse data tyder på at CTCs kan merkes med J591-488 og det fluorescerende merking av CTCs påvirker ikke rullende oppførsel ved lave skjærspenninger. Av notatet, hadde vi ikke påvise noen rullende atferd enten i fravær av E-selektin til enhver skjærspenning undersøkt eller i nærvær av humant rekombinant L-selektin protein (data ikke vist), noe som tyder på at E-selektin er nødvendig for rullende oppførsel. Videoer S1 og S2 viser rullende atferd umerkede og J591-488-merkede MDA celler
.
MDA cellene ble merket med mAb J591-488 for PSMA. Etter merking ble 10
6 J591-488 merkede MDA-celler perfusert ved 0,5, 1, 3, 5 og 8 dyn /cm
to skjærspenning. Tilsvar umerkede MDA celler ble også dynket via E-selektin belagt mikrorør. Ti videoer ble tatt på forskjellige lengder av mikrorør for hver skjærspenning. Rullende hastighet ble målt for både umerket og anti-PSMA J591-488 merkede MDA-celler. Figuren viser ingen signifikant forskjell i valse hastighet mellom umerket og anti-PSMA J591-488 merkede MDA-celler ved skjærspenning som strekker seg 0,5 til 1 dyn /cm
2. De gjennomsnittlige rullende hastigheter på 0,5 dyn /cm
2 var 5.27+ 1,38 og 5,23 + 1,85 mikrometer /sek i umerket og J591-488 merket MDA celler, henholdsvis. Ved høyere skjærspenninger, ble det observert en signifikant forskjell mellom de to kategorier av MDA-celler. Histogram viser resultatene fra tre separate forsøk kombinert sammen. UNL = umerkede MDA celler, Lab = J591-488 merket MDA celler. Data representert som Mean + SD.
E-selektin-medierte interaksjoner i CTCs avledet fra prostatakreftpasienter
Vi neste fastslått om CTCs avledet fra PCA pasienter vil samhandle med E- selektin lik MDA PCA celler. PBMC fra ~ 6 ml (5.4-7.5) av fullblod ble oppnådd fra 17 enkeltpasienter (27 blodprøver) med metastatisk PCA og inkubert med mAb J591-488. Etter merking, 21 prøver gikk anti-CD45 depletion; mens i 6 prøver ble det ikke anti-CD45 depletion utført. Vi først kjørte seks pasientprøver uten anti-CD45 depletion. Deretter, for å unngå forurensende leukocytter som potensielt kan redusere sjansen for CTCs samspill med overflaten, ansatt vi anti-CD45 depletion å berike for CTC befolkningen. Utvinningsgraden av denne teknikken var 60-70% ved bruk PSMA uttrykker PCA celler (data ikke vist). Hver pasientprøve ble perfusert i løpet av E-selektin-belagte mikrorør flater på 0,6 dyn /cm
2 genererer en vegg skjærhastighet på 60
-s, som er innen området av fysiologisk vegg skjærhastighet i postkapillære venyler [27 ]. PCa CTCs merket med mAb J591-488 ble identifisert i 23 prøver, og median antall CTCs oppdaget ved hjelp av aktiv videoanalyse var ni (range 0-270) (tabell 1). Ni av 23 (39,1%) og 10/23 (43,5%) av pasientprøver viste rulle /tethering og stabil adhesjon, henholdsvis. De E-selektin mediert interaksjoner observert i prostata CTCs består hovedsakelig tethering og stabil heft med svært få CTCs viser rullerende atferd. Når vi vurderte klinisk tilstand på tidspunktet for prøvetaking og behandling, bemerket vi at CTCs fra prøver av pasienter som opplever en klinisk respons var betydelig mindre sannsynlighet for å ha E-selektin-medierte interaksjoner i forhold til CTCs fra klinisk progresjon pasienter (tabell 1; 0,0 % vs. 61,9%, henholdsvis
p
= 0,016). Anti-CD45 uttømming ikke har en virkning på E-selektin-avhengig interaksjon i CTCs (tabell 1, eksempel 1, 13, 17, 21, 22, 25); selv, vi kan ikke helt utelukke muligheten for at noen CTCs ble tapt under anti-CD45 depletion prosess. Video S3 viser en video fra en pasientprøve som viser samspillet av CTCs med E-selektin. Disse resultatene gir direkte bevis for at fysisk prostata CTCs som uttrykker PSMA samvirke med E-selektin og antyder at prostata CTCs har E-selektin ligand (er) (ESLs) på sine celleoverflater.
Pasient nr
prøve nr
Rolling og deling
Stabil Heft
Total
klinisk historie på tidspunktet for prøvetaking
klinisk respons på tidspunktet for prøvetaking
1 * 13329Bone og LN metastaser følgende progresjon på docetaxel og utprøvende behandling for tiden på ketokonazol /hydrocortisoneProgression121310Bone og LN metastaser følgende progresjon på docetaxel og utprøvende behandling for tiden på ketokonazol /hydrocortisoneProgression132814270Bone og LN metastaser følgende progresjon på hormonbehandling, docetaxel, og utprøvende behandling for tiden på abiraterone /prednisoneProgression140072Bone og LN metastaser følgende progresjon på docetaxel og abiraterone tiden på karboplatin /paclitaxelResponding150012Bone og LN metastaser følgende progresjon på docetaxel og abiraterone tiden på karboplatin /paclitaxelResponding26009Bone og LN metastaser tidligere er behandlet med hormonbehandling og docetaxel på investigational therapyProgression27004Bone og LN metastaser tidligere er behandlet med hormon terapi og docetaxel på investigational therapyProgression38035Bone metastaser følgende flere linjer med hormonelle therapyProgression39009Bone metastaser følgende flere linjer med hormonbehandling på docetaxelResponding410012Bone, LN, lever og lungemetastaser som tidligere er behandlet med docetaxel og abiraterone tiden på carboplatin /paclitaxelProgression511009LN metastaser med progresjon på hormonelle therapyProgression512001LN metastaser med progresjon på hormonbehandling og docetaxel for tiden på abiraterone /prednisoneResponding6 * 13400166bone metastaser med progresjon på docetaxel og prøvings therapiesProgression614036bone metastaser med progresjon på docetaxel, investigational terapier, og abirateroneProgression7152141bone, LN, tykktarm og blære metastaser følgende hormonelle og eksperimentell therapyProgression716002bone, LN, tykktarm og blære metastaser etter hormonell og eksperimentell terapi, for tiden på docetaxelResponding8 * 17023bones metastaser tidligere er behandlet med flere linjer med hormonelle therapyProgression818000bones metastaser tidligere er behandlet med flere linjer med hormonbehandling, for tiden på docetaxelResponding919000bone metastaser som utvikler seg på innledende hormonell therapyProgression10202153LN og levermetastaser som tidligere er behandlet med docetaxel for tiden på abirateroneProgression11 * 219228bone metastaser tidligere er behandlet med docetaxel, ketokonazol, og utprøvings therapyProgression12 * 22102LN metastaser tidligere behandlet eksperimentell terapi og docetaxel, for tiden på enzalutamideProgression1323000bone og LN metastaser på leuprolide og bicalutamideProgression14240020bone og lunger metastaser tidligere er behandlet med hormon therapyProgression15 * 250010bone, LN, blære- og lungemetastaser tidligere behandlet med eksperimentell terapi og docetaxelProgression1626000bone og LN metastaser som tidligere er behandlet med eksperimentell terapi og docetaxelProgression17271022LN og blære metastaser tidligere treatd med ketokonazol, docetaxel, eksperimentell terapi, for tiden på cabazitaxelProgressionTable 1. Interaksjoner mellom CTCs avledet fra metastaserende PCA pasienter og E-selektin-belagt microtube . flater
LN = lymfeknute; Totalt betyr at alle J591-merket CTCs;
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
