Abstract
Epigenetikk er tenkt å spille en viktig rolle i kreftutvikling av flere sporadiske kolorektal kreft (CRC). Tidligere studier har antydet konkordant DNA hypermethylation mellom svulst par. Imidlertid har bare noen få metylering markører analysert. Denne studien var rettet mot å beskrive epigenetisk underskrift av flere CRC bruker et genom-skala DNA metylering profilering. Vi analyserte 12 pasienter med synkron CRC og 29 alders-, sex-, og tumor steds paret pasienter med solitære svulster fra EPICOLON II kohort. DNA metylering profilering ble utført ved hjelp av Illumina infinium HM27 DNA metylering analyse. De mest signifikante resultatene ble validert av Methylight. Svulster prøver ble også analysert for CpG Island Methylator Fenotype (CIMP);
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjoner og mismatch reparasjon mangel status. Funksjonell merknad clustering ble utført. Vi identifiserte 102 CpG områder som viste betydelige DNA hypermethylation i flere tumorer i forhold til den ensomme motstykker (forskjell i β verdi ≥0.1). Methylight analyser validert resultatene for 4 utvalgte gener (p = 0,0002). Åtte av 12 (66,6%) av flere tumorer ble klassifisert som CIMP-høy, sammenlignet med 5 ut av 29 (17,2%) enslig tumorer (p = 0,004). Interessant, 76 ut av 102 (74,5%) hypermethylated CpG områder som finnes i flere tumorer ble også sett i CIMP høye tumorer. Funksjonell analyse av hypermethylated gener som finnes i flere svulster viste anriking av gener involvert i forskjellige tumorigene funksjoner. I konklusjonen, er flere CRC forbundet med en distinkt metylering fenotype, med en nær sammenheng mellom tumor mangfold og CIMP høy. Våre resultater kan være viktig for å løse den underliggende mekanismen for tumor mangfold
Citation. Gonzalo V, Lozano JJ, Alonso-Espinaco V, Moreira L, Muñoz J, Pellisé M, et al. (2014) Flere Sporadiske kolorektal kreft Vise en unik Metylering Phenotype. PLoS ONE 9 (3): e91033. doi: 10,1371 /journal.pone.0091033
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 11. desember 2013, Godkjent: 06.02.2014; Publisert: 18 mars 2014
Copyright: © 2014 Gonzalo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Hospital Clinic i Barcelona (Josep Font tilskudd), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2007-64873 og SAF2010-19273), Fundación Científica de la Asociación Española contra el kreft, og Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). «Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Unión Europea. Una manera de hacer Europa «. CIBEREHD er finansiert av Instituto de Salud Carlos III. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
inntil 10% av alle kolorektal kreft (CRC) pasienter utvikler mer enn en tumor i colorectum, enten synkront (diagnostisert samtidig) eller metachronously (diagnostisert under oppfølging) [1], [ ,,,0],2], [3]. Tumor multiplisitet er antatt å forekomme på grunn av en felles etiologisk faktor (genetisk eller miljømessig) og gir en god modell for å undersøke felles molekylære forandringer og, mer spesifikt, en potensiell felteffekt [4], [5], [6], [7 ]. Genetikk forklare bare en del av spekteret av flere CRC, spesielt de som forekommer i sammenheng med Lynch syndrom (forårsaket av mutasjoner i mismatch-reparasjonsgener) [8], [9], [10], familial forbundet polypose (FAP) [ ,,,0],11],
MUTYH
forbundet polypose (MAP) [11] og andre former for kolorektal polypose [12]. På den andre siden, har begrepet feltdefekt blitt foreslått for å forklare tumor multiplisitet gjennom en generalisert cellulær eller molekylær uorden i hele tykktarmsslimhinne, forårsaker en antatt felteffekt (såkalt «felt cancerization») [6], [7] , slik som i sagtakket polypose syndrom [13], [14], [15]. Men den definitive underliggende sykdomsfremkallende mekanisme for tumor mangfold forblir unnvikende.
I den ikke-arvelig scenario, tidligere studier har funnet felles molekylær endring mønsteret mellom CRC par og i den normale tarmslimhinnen av pasienter med multipler kolorektal tumorer, understøttelse av en antatt feltdefekt [4], [10], [14], [16]. I motsetning til genetiske endringer, som ikke vanligvis finnes i normal slimhinne fra kreftpasienter, er epigenetikk tenkt å spille en viktig rolle i kreftutvikling av de individene som utvikler flere svulster [4], [5], [14], [17 ], [18], [19], [20], [21]. I denne forstand, har det vært antydet at synkrone CRC er oftere forbundet med CpG island methylator fenotype (CIMP) [4],
BRAF
mutasjon og mikro ustabilitet [10]. Faktisk, vår gruppe sammenlignet et sett med 41 parvise flere og ensomme CRC og identifisert hypermethylation av
MGMT2
locus og
RASSF1A
genet som variabler uavhengig assosiert med tumor mangfold. Videre har flere studier funnet samstemmige metylering mønstre i svulst par [4], [14], [17], [18]. På den annen side har global DNA hypometylering vært knyttet til genomisk instabilitet og karsinogenese [22], [23] og nylig høyere hypometylering av LINE-1 (en surrogatmarkør for global DNA-metylering) i normal tarmslimhinnen er blitt funnet å være et karakteristisk trekk ved pasienter med synkron CRC [14]. Alle disse resultatene tyder på at felles miljø og /eller genetisk bakgrunn kan forårsake samstemmige mønstre av DNA-metylering i pasienter med flere svulster. Imidlertid har bare noen få metylering markører blitt analysert og høy gjennomstrømning teknikker med genome wide kapasitet er nødvendig for å finne og bedre forstå den underliggende epigenetisk underskrift av flere sporadiske CRC.
I denne studien vi tar sikte på å beskrive den underliggende epigenetisk signatur som skiller flere fra ensomme CRC svulster ved hjelp av et genom-wide tilnærming. For dette formålet, analyserte vi 12 synkron og 29 kontroll ensomme CRC avledet fra populasjonsbasert EPICOLON-II årsklasse, og evaluert genomet stilt metylering profil ved hjelp av Illumina infinium HM27 DNA metylering analyse, en tilnærming som ikke tidligere har vært forsøkt.
Materialer og metoder
pasienter og prøver
Tolv pasienter med synkron CRC og 29 alders-, sex-, og tumor steds paret pasienter med solitære svulster ble rekruttert fra EPICOLON II kohort, en multisenter populasjonsbasert studie utført i Spania mellom 2006 og 2007 [24]. Synkron svulster ble klart atskilt med normal colonic slimhinnen og begge var invasiv (minst PT1). Pasientene ble fulgt inntil død eller mars 2012, avhengig av hva som kom først. Demografiske, kliniske og kreftrelaterte karakteristika for pasienter inkludert i studien er oppsummert i Tabell 1. Eksklusjonskriterier for denne undersøkelsen var kolorektal polypose syndromer, Lynch syndrom, og personlige historie av inflammatorisk tarmsykdom. Den institusjonelle etiske komité for hver deltakende sykehus (se Anerkjennelse) godkjent studien, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Frozen kreft kolorektal vev ble oppnådd ved kirurgi fra alle pasienter, og umiddelbart lagret ved -80 ° C inntil bruk. Hos pasienter med multiple lesjoner, ble vevsprøve oppnådd fra en av de tumorer (den mest avanserte eller den største når flere tumorer hadde den samme tumorstadium).
DNA ekstraksjon og bisulfitt omdannelse
frosne prøver ble tint og genomisk DNA ble isolert ved hjelp QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Bisulfite behandlingen ble utført på genomisk DNA ved hjelp av EZ DNA Metylering-Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA) i henhold til produsentens protokoll.
infinium rekke
Vi utførte DNA metylering profilering fra 12 synkron og 29 ensomme CRC bruker infinium metylering analysen med HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, San Diego, CA), som er i stand til samtidig analysere metylering status for 27,578 individuelle CpG områder som dekker 14,495 proteinkodende gener og 110 mirnas [25], [ ,,,0],26], [27]. Hele genomet forsterkning, merking, hybridisering og skanning ble utført i henhold til produsentens instruksjoner på en kjernefasilitet (Centre de Regulació Genòmica, Barcelona, Catalonia, Spania). Metylering status ble målt som forholdet for signal fra en metylert sonden i forhold til både denaturert og unmethylated sondesignaler. Metylering forhold ble trukket ut ved hjelp av Metylering Module i Illumina Bead Studio følgende gjennomsnittlige normalisering. Kvantitativ β-verdi i området fra 0 (0% metylering) til 1 (100% metylering). P-verdien avskåret for oppdagede prober (forskjellige fra bakgrunnsmålinger) ble satt til 0,05. Vi ekskluderte sonder som tidligere ble utgitt for å være upålitelig (de som inneholder én nukleotid polymorfismer (SNPs) og de repeterende sekvenser som dekket målrettet CpG dinucleotide) og de som ble utformet for sekvenser på enten X eller Y-kromosomet. Sammen maskert vi datapunkter for 7549 prober [27]. Komplett microarray datasettet er tilgjengelig på GEO. (Gene Expression Omnibus; sjonsnummer GSE52573)
Definisjon av CIMP høye svulster basert på infinium analysen
Vi klassifisert svulster som CIMP-høy (CIMP- H), CIMP-lav (CIMP-L) og CIMP-0 basert på en to-trinns paneler av markører nylig beskrevet av Hinoue
et al
basert på Illumina infinium HM27 DNA metylering analyse [27]. Den første panelet (
B3GAT2
,
FOXL2
,
KCNK13
,
RAB31
, og
SLIT1
) kvalifiserer en prøve som CIMP (High and Low) versus CIMP-0 dersom β-verdi er ≥0.1 i tre eller flere markører. Den andre markør panel (
FAM78A
,
FSTL1
,
KCNC1
,
MYODCD Hotell og
SLC6A4
) skiller CIMP-H versus CIMP-L-tumorer dersom β-verdi er ≥0.1 i tre eller flere markører (tabell 2). Disse markørene har vist for å vise 100% sensitivitet og 100% spesifisitet for å identifisere CIMP-H-tumorer [27].
Teknisk validering av infinium analysen bruker Methylight
Methylight teknikk for kvantitativ analyse av metylering ble anvendt for den tekniske validering av resultatene observert i Illumina infinium analyse [28]. Følgende strenge kriterier ble brukt til utvalgte kandidatgener for validering: 1) enslig svulsten hadde en β verdi 0,2; og 2) flere svulster hadde enten en β verdi 0,3 og en forskjell i β verdi ≥0.2; og 3) justeres p-verdi 0,05; og 4) tidligere tegn på at tumoren undertrykkende funksjoner basert på publisert litteratur. Etter disse kriteriene, valgte vi 4 gener for teknisk validering (
MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP3
). Locus spesifikke PCR primere og prober er oppført på Tabell S1 og ble spesielt utviklet for bisulfited-konvertert DNA-sekvenser og ligger på hvert gen promoter regionen. Methylight ble utført som tidligere beskrevet, ved hjelp av ALUC4 som intern kontroll [17], [28].
Evaluering av tumor mismatch reparasjon mangel
Tumor mismatch reparasjon mangel ble evaluert av både mikrosatelitt ustabile ( MSI) testing og farging inkludert vurdering av MSH2, MLH1, MSH6 og PMS2 som tidligere beskrevet [29]. MSI status ble vurdert ved hjelp BAT26 og NR24 quasimonomorphic markører som tidligere beskrevet [30]. Svulster ble klassifisert som MSI når en av de to markørene var ustabil.
Evaluering av
BRAF Hotell og
KRAS
mutasjonsstatus
BRAF
mutasjoner i kodon 600 i exon 15, og
KRAS
mutasjoner i kodon 12 og 13 i exon 2 ble analysert ved Methylight og direkte sekvensering, henholdsvis, som tidligere publisert [31].
funksjonell merknad clustering av ulikt denaturert gener mellom flere og ensomme kolorektal kreft
Vi brukte Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) [32] for å identifisere veier som er relevante for kreftutvikling basert på genene som viste signifikant differensial metylering mellom flere og ensomme flere svulster (forskjell i β verdi ≥0.1 og p 0,05). (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov)
Statistisk analyse
Logistic regresjon korrigert for alder, kjønn og tumor stedet ble anvendt for å evaluere forskjellen i DNA-metylering p-verdiene for hver sonde mellom to uavhengige grupper. De Illumina infinium DNA metylering betaverdiene var representert grafisk ved hjelp av en heatmap, generert av R /Bioconductor pakker. Clinicopathological funksjoner ble sammenliknet med Chi-square (kvalitative variabler) og t-tester (kvantitative variabler). Methylight kvantitative data (prosent metylering ratio, PMR) ble analysert med Mann-Whitney U test. En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk analyse og visualisering av data ble utført ved hjelp av R /Bioconductor programvarepakke og SSPS programvare (v.15).
Resultater
Differensial metylering mellom flere og ensomme svulster
tolv pasienter med multippel CRC og 29 alders-, sex-, og tumor steds paret pasienter med solitære svulster utgjør grunnlaget for denne studien. Demografiske og tumor egenskaper fra pasienter inkludert i denne studien er oppført i tabell 1. Vi brukte Illumina infinium HM27 DNA metylering analyse, som vurderer DNA metylering status for 27,578 CpG områder som ligger i promotorområdene på over 14 000 proteinkodende gener. Vi identifiserte 102 CpG nettsteder som viste betydelig DNA hypermethylation i flere svulster med hensyn til ensomme (forskjell i β verdi ≥0.1 og p 0,05). Ved hjelp av strengere kriterier (forskjell i β verdi ≥0,2; p 0,05), identifiserte vi 36 CpG nettsider betydelig hypermethylated (se detaljert liste over genene i tabell S2). En heatmap viser de mest betydelig hypermethylated CpG områder som skiller flere og ensomme svulster er vist i Figur 1. Samlet er disse resultatene viser at flere svulster er forbundet med en distinkt metylering fenotype, uavhengig av alder, kjønn og svulst plassering.
DNA-metylering β-verdier er representert ved hjelp av en fargeskala fra rød (høy DNA-metylering) til grønn (lav DNA-metylering). Rader representerer prober og kolonner representerer tumorprøver. Kliniske og molekylære funksjoner (gruppe, kjønn, tumor beliggenhet, CIMP-H og
KRAS
mutasjonsstatus) er representert over heatmap med vannrette streker.
Teknisk validering av microarray resultater
for å kunne teknisk validere resultatene av infinium analysen brukte vi strenge kriterier for å velge sonder som ble betydelig hypermethylated i flere svulster i forhold til ensomme lesjoner (β verdi i ensomme svulster 0,2; β verdi 0,3 i flere svulster, forskjell i β verdi mellom flere og ensomme svulster ≥0.2, og en justert p value 0,05). For å kunne velge biologisk relevante CpG områder, prioritert vi gener med tidligere tilstedeværelse av tumor suppressor egenskaper. Etter disse kriteriene, har vi valgt
MAP1B
,
HTRA1
,
ALOX15
, og
TIMP3
for validering av fem sammenkoblede flere og ensomme svulster. Resultater er vist i figur 2. På verdensbasis, har vi funnet en signifikant høyere metylering nivåer i flere tumorer sammenlignet med ensomme (totalt PMR, 14% mot 2,7%, henholdsvis p = 0,0002). Som vist i figur 2, er alle fire markører viste høyere metylering i multiple tumorer med hensyn til ensomme, og dermed forsterke den konsistens på resultatene.
Fire gener (
MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP3
) ble valgt basert på strenge kriterier (β verdi i ensomme svulster 0,2; β verdi 0,3 i flere svulster, forskjell i β verdi mellom flere versus enslig ≥0.2, og en justert p-verdi 0,05). Box-plott vise Prosentvis Metylering Ratio (PMR) bestemt av Methylight. Linjene inne boksene betegne median og bokser markere intervallet mellom den 25. og 75. percentil. Svarte linjer betegne den høyeste og laveste PMR verdi. P-verdier for sammenligning mellom flere (rød) og ensomme (blå) tumorer (Mann-Whitney test) er vist.
CIMP-høy er assosiert med tumor mangfaldet
neste analysert CIMP status for flere og ensomme svulster basert på den nylig utviklede gente paneler som er definert av Hinoue
et al product: [27]. Dette panelet har nylig vist seg å utkonkurrere Methylight baserte fem-markør panel beskrevet av Weisenberger [33]. Ti av de 12 (83%) flere svulster og 25 ut av 29 (86,2%) enslig CRC viste hypermethylation av tre eller flere markører fra det første panelet (dvs.
B3GAT2
,
FOXL2
,
KCNK13
,
RAB31
, og
SLIT1
), slik at de ble klassifisert som CIMP svulster. Basert på det andre panelet (dvs.
FAM78A
,
FSTL1
,
KCNC1
,
myOCD
, og
SLC6A4
), 8 ut av de 12 (66,6%) av flere tumorer slutt ble klassifisert som CIMP-H, sammenlignet med 5 av de 29 (17,2%) enslig tumorer (p = 0,004) (tabell 2). CIMP-H-tumorer vises betydelig hypermethylation (forskjell i β verdi ≥0.1; p verdi 0,05) i 301 CpG sider (109 med en forskjell i β verdi ≥0.2; p value 0,05). En varmekart som viser de mest betydningsfulle CpG områder som skiller CIMP-H og CIMP-L /0 tumorer er vist i figur 3. En detaljert liste med CIMP-H hypermethylated CpG områder er vist i Tabell S3. Interessant, 76 av de 102 hypermethylated CpG områder i flere svulster ble også sett på som hypermethylated i CIMP-H-tumorer (figur 4). Det var ingen
BRAF
mutasjoner i noen svulst. Våre resultater viser en nær sammenheng mellom tumor mangfold og CIMP, uavhengig av alder, kjønn og svulst plassering. Denne observasjonen er i overensstemmelse med en tidligere større studie hvor svulstene ble klassifisert ved hjelp Methylight-baserte markører [4], og dermed forsterke felt feil teori.
DNA metylering β-verdier er representert ved hjelp av en farge skala fra rød (høy DNA metylering) til grønn (lav DNA metylering). Rader representerer prober og kolonner representerer tumorprøver. Kliniske og molekylære funksjoner (gruppe, kjønn, tumor beliggenhet, CIMP-H og
KRAS
mutasjonsstatus) er representert over heatmap med vannrette streker.
Blå sirkel viser 102 hypermethylated CpG nettstedene som finnes i flere versus ensomme svulster og gul sirkel viser 301 hypermethylated CpG steder i CIMP-H versus CIMP-L /0 svulster. Bemerkelsesverdig, 76 av de 102 hypermethylated genene i flere svulster ble også sett på som hypermethylated i CIMP-H-tumorer, og er representert som et veikryss.
sammenheng mellom
KRAS
mutasjoner og hypermethylation
KRAS
mutasjoner har vært knyttet til en metylering fenotype kalt CIMP-low, hvor hypermethylation av et redusert antall CIMP-definer loci skje [27]. Vi ønsket å undersøke metylering profilen forbundet med
KRAS
muterte tumorer og sin tilknytning til tumor mangfold. Vi fant ut at
KRAS
muterte tumorer var representert i både flere og ensomme svulster (33,3% versus 43,4%, henholdsvis; p = 0,7) (figur 1). Interessant, fant vi at
KRAS
muterte tumorer viste en tydelig metylering profil sammenlignet med
KRAS
villtype svulster. Vi identifiserte 189 CpG nettsteder som viste betydelig DNA hypermethylation i
KRAS
mutante CRC med hensyn til
KRAS
vill type tumorer (forskjell i β verdi ≥0.1 og p 0,05). Ved hjelp av strengere kriterier (forskjell i β verdi ≥0,2; p 0,05), identifiserte vi 92 CpG nettsider betydelig hypermethylated. En detaljert liste med
KRAS
-associated hypermethylated CpG nettsider er vist i tabell S4 og figur S1. Prosentandelen av CIMP-H var ikke forskjellig mellom
KRAS
mutant og villtype svulster (23% versus 35%, henholdsvis; p = 0,7). Tilsvarende hadde andelen CIMP lave ikke skiller mellom
KRAS
mutant og villtype svulster (69,2% versus 55%, henholdsvis; p = 0,485). Total, selv om vi fant at
KRAS
muterte tumorer vise en tydelig metylering profiler, var det sammenheng med verken svulst mangfold eller CIMP status.
Funksjonell analyse av differensial metylering observert i flere tykktarmskreft
Vi utførte en berikelse analyse på 102 hypermethylated sondene observert i flere svulster (β verdi 0,1; p 0,05) ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery verktøy for å finne en funksjonell sammenheng i noen kreftfremkallende sti involvert i kreftutvikling. Denne funksjonsanalyse viste tilstedeværelse og berikelse av gener som er involvert i ulike tumorigen funksjoner: celle bevegelse (12 gener), cellemigrasjon (7 gener), veier i kreft (8 gener), cellemotilitet (7 gener), regulering av celleproliferasjon ( 11 gener), transkripsjonsfaktor aktivitet (14 gener), og transkripsjon regulering (17 gener) (tabell 3). Full liste over funksjonell annotering gruppering av ulikt denaturert gener er vist i tabell S5.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi for første gang genomet stilt DNA metylering profilen til tumor vev fra pasienter med multippel og ensom CRC rekruttert fra en populasjonsbasert kohort. Vi fant at tumor multiplisitet er assosiert med en distinkt metylering profil, uansett alder, kjønn eller tumor sted. Sammenlignet med enslig svulster, flere CRC viste signifikant hypermethylation på bestemte CpG områder og interessant, det var en sterk tilknytning til CIMP-H beskrevet for CRC. Funksjonell analyse av ulikt denaturert CpG områder i flere svulster viste anriking av gener involvert i forskjellige tumorigene funksjoner. Resultater fra metylering profilering ble vellykket validert av kvantitative PCR-analyser. Totalt sett, våre data gir ny innsikt i feltet cancerization effekt og kolorektal kreftutvikling i ikke-arvelige tilfeller. Denne studien viser at somatiske hypermethylation spiller en viktig rolle i tumor mangfold og kan utgjøre et interessant biomarkør for CRC risikovurdering.
Nyere studier har rapportert en nær sammenheng mellom avvikende DNA metylering og tumor mangfold [4], [14 ], [16], [17], [18]. Nosho og kolleger [4] analysert 47 pasienter med synkron CRC og 2021 ensomme svulster i flere metylering markører, inkludert åtte CIMP spesifikke CpG island (dvs.
CACNA1G
,
CDKN2A
,
CRABP1
,
IGF2
,
MLH1
,
NEUROG1
,
RUNX3
, og
SOCS1
) og fant en signifikant sammenheng mellom tumor og multiplisitet nærvær av CIMP-høy (35% i synkrone tumorer sammenlignet med 8% i ensomme tumorer; p = 0,036). Enda viktigere, fant forfatterne konkordant metylering innen kreft par. Tilsvarende Konishi og kolleger [18] analysert metylering status for et begrenset antall beslutningstakere i 57 flere svulster og 69 ensomme CRC, og fant at metylering status for
P14 Hotell og
MGMT
var betydelig høyere i flere svulster, viser konkordant metylering for noen markører innenfor svulster par av samme colonic nettstedet. I tråd med disse observasjonene vi tidligere viste at hypermethylation av
MGMT Hotell og
RASSF1A
er uavhengig assosiert med tumor mangfold [17]. I en annen studie, Kamiyama og kolleger [14] analysert metylering status for lang ispedd nucleotide element-en (LINE-1) i matchet kreft vev og ikke-kreft colonic slimhinnen fra pasienter med én og flere høyresidige CRC. Forfatterne fant høyere hypometylering av LINE-en i både svulsten og normal slimhinne fra pasienter med flere svulster sammenlignet med pasienter med solitære svulster, og enda viktigere, LINE-en hypometylering var en uavhengig prediktor for metachronous svulster (p = 0,003). Forfatterne antydet at LINE-en hypometylering i normal slimhinne kan brukes som en epigenetisk prediktiv biomarkør for flere CRC risiko. Det er viktig å merke seg at LINE-1 hypometylering er tidligere blitt funnet å være inverst korrelert med den CIMP fenotype, som kan være i strid med våre og tidligere studier. Imidlertid har korrelasjonen mellom LINE-en hypometylering og CIMP i flere svulster ikke blitt utforsket i dybden, og forskjeller i pasientens valg og metodikk kunne forklare disse uventede resultater. Til slutt, har andre studier hypotese at den genetiske og epigenetisk landskapet i en gitt tumor bestemmes av plasseringen i tykktarmen, og at tilsvarende molekylære profiler for synkrone tumorer påvirkes av nærhet [34], [35]. Dessverre kunne vi ikke subanalyze dette problemet på grunn av utilgjengelighet av den andre svulst. Alle disse resultatene tyder på at akkumulasjon av aberrant DNA-metylering forekommer hovedsakelig hos personer med en tilbøyelighet til å utvikle flere svulster. Resultatene av denne studien ikke bare argumentere for denne hypotesen, men også gi nye bevis om epigenetisk landskapet av pasienter med flere svulster. Den underliggende mekanisme for foreningen mellom avvik metylering og mangfold er fortsatt ukjent. Enkelte forfattere har foreslått en arvet predisposisjon i noen tilfeller [14], med akkumulering av metylering feil under aldring i en genetisk disponert undergruppe av individer. Imidlertid gjenstår denne hypotesen uprøvd og fremtidige studier er nødvendig.
I denne studien vi lykkes validert av Methylight metylering status av 4 differensielt denaturert CpG nettsider observert i oppdagelsen fase av studien. Spesielt vi observert at
MAPB1B
,
HTRA1
,
ALOX15
, og
TIMP3
ble betydelig hypermethylated i flere svulster.
MAP1B plakater (mikrotubul-assosiert protein 1B) har tidligere blitt vist å være hypermethylated i CIMP-høy-tumorer uten MSI, som i hovedsak tilsvarer den gruppe av svulster som ble analysert i vårt studium [36].
HTRA1
er medlem av HtrA (High-Temperature Krav Factor A) familie av serin proteaser og spiller en beskyttende rolle i ulike kreftformer på grunn av sin svulst undertrykkende egenskaper [37], [38], [39] .
HTRA1
har vist seg å bli brakt til taushet gjennom arrangøren hypermethylation [38], og foreslått som en mulig ny biomarkør for diagnostisering og prediksjon i flere kreftformer.
ALOX15 plakater (15-lipoksygenase eller 15-LOX) er en induserbar og svært regulert enzym i normale humane celler som spiller en nøkkelrolle i produksjonen av lipid signale meklere.
ALOX15
har nylig vist seg å være nedregulert i CRC og fungere som en tumor suppressor ved å fremme ulike anti-tumorigen begivenheter, inkludert celledifferensiering og apoptose, og hemmer kronisk betennelse, angiogenese og metastase [40]. Endelig Tissue Inhibitor of metalloproteinaser-3 (
TIMP-3
) har funnet å bli brakt til taushet i flere typer kreft ved promoter genet hypermethylation, inkludert CRC [41], [42]. Totalt sett, viser våre resultater at flere svulster er forbundet med hypermethylation av veletablerte tumorsuppressorgener.
Uavhengig av den underliggende mekanisme bak den sterke assosiasjonen mellom avvik metylering og tumor multiplisitet, våre resultater tyder på at metylering av status spesifikke markører kan brukes til å stratifisere risiko for tumor multiplisitet. Kamiyama og kolleger nylig viste at LINE-en metylering status i normal tarmslimhinnen kunne forutsi utviklingen av metachronous CRC med høy følsomhet [14], og dermed representerer en klinisk viktig prognostisk biomarkør for identifisering av «high-risk» pasienter. På samme måte kan analysen av metylering status for spesifikke markører som er identifisert i vår undersøkelse bli brukt i en klinisk situasjon for å identifisere pasienter med høy risiko og skreddersy den overvåking strategi. Prospektive studier spesielt analysere denne hypotesen, men er garantert.
Den største styrken til denne studien er at vi utnyttet en populasjonsbasert kohort av godt beskrevet CRC tilfeller, og dermed minimere utvalget bias. Videre brukte vi for første gang genome-wide metylering profilering med Illumina infinium analysen i denne innstillingen. Men vi er klar over noen begrensninger. Først gjorde vi ikke analysere DNA metylering korrelasjon i tumor par på grunn av utformingen av EPICOLON II-prosjektet, hvor bare en svulst ble samlet inn. For det andre, CIMP definisjon var ikke basert på tidligere beskrevne metylering markører [33]. Men det er foreløpig ingen konsensus definisjon av CIMP svulster, og Hinoue og kolleger [27] nylig viste at en ny panel basert på Illumina infinium DNA metylering plattform gjorde det bedre enn Methylight baserte fem-markør panel (dvs.
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
). Hyppigheten av CIMP-høy frekvens i ensom CRC observert i vår studie (17%) er i tråd med tidligere tall, noe som forsterker nøyaktigheten av det nye panelet foreslått av Hinoue
et al.
Tredje i vår studie var det ikke
BRAF
mutant svulster, og følgelig foreningen av svulsten mangfold med en distinkt metylering fenotype refererer bare til CIMP-høy /
BRAF
vill type svulster, som kan representere opp 40% av CIMP høye svulster. Til slutt, som våre resultater bør formelt sett ikke statistisk signifikant når du bruker flere test korreksjoner, er flere studier i andre kohorter nødvendig for å bekrefte resultatene. Men vi var i stand til å bekrefte noen av de mest betydningsfulle hypermethylated CpG områder ved Methylight, og dermed forsterke gyldigheten av våre resultater.
I sammendraget, våre resultater er i samsvar med hypotesen om at svulsten mangfold er forbundet med en distinkt mønster av avvikende metylering. Sammenlignet med enslig svulster, flere CRC vise oftere CIMP-H og hypermethylation på andre spesifikke locus. Våre resultater kan være viktig for å løse den underliggende mekanismen for tumor mangfaldet i den ikke-arvelig scenario, og gi nye potensielle biomarkører for å identifisere høyrisikopasienter og skreddersy overvåkningsstrategier.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Heatmap viser de 172 mest betydelig hypermethylated CpG områder som skiller KRAS mutant (n = 13) versus KRAS villtype tumorer (n = 28) basert på infinium DNA metylering data.
