Abstract
Den antidepressive fluoksetin har vært under diskusjon på grunn av sin potensielle innflytelse på kreftrisiko. Den ble funnet å hemme utviklingen av kreftfremkallende induserte preneoplastiske lesjoner i tykktarmen vev, men virkningsmekanismer er ikke godt forstått. Derfor, undersøkte vi anti-proliferative effekter, og som brukes HT29 kolon tumorceller
in vitro
, samt C57BL /6-mus eksponert for intrarektal behandling med carcinogen N-metyl-N»-nitro-N- -nitrosoguanidine (MNNG) som modeller. Fluoksetin økte prosentandelen av HT29-celler i G
0 /G
en fase av celle-syklusen, og ekspresjon av p27-proteinet. Dette var ikke relatert til en induksjon av apoptose, reaktive oksygenarter eller DNA-skade.
In vivo
, fluoksetin redusert utvikling av MNNG-indusert dysplasi og vaskularisering relaterte dysplasi i colon vev, som ble analysert ved histopatologiske teknikker. Et anti-proliferativ potensialet av fluoksetin ble observert i epitelceller og stromale områder. Det ble fulgt av en reduksjon av VEGF-ekspresjon og av antallet celler med angiogene potensial, slik som CD133, CD34, CD31-positive og cellegrupper. Til sammen våre funn tyder på at fluoksetin behandling er rettet mot trinn på tidlig tykktarmskreftutvikling. Dette bekrefter sin beskyttende potensial, forklarer i hvert fall delvis lavere tykktarmskreft risiko under antidepressiv behandling
Citation. Kannen V, Hintzsche H, Zanette DL, Silva WA Jr, Garcia SB, Waaga-Gasser AM, et al . (2012) Antlproliferative Effekter av Fluoxetin på Colon kreft celler og i en Kolon Carcinogen Mouse Model. PLoS ONE 7 (11): e50043. doi: 10,1371 /journal.pone.0050043
Redaktør: Nikos K. Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: May 30, 2012; Godkjent: 15 oktober 2012; Publisert: 27.11.2012
Copyright: © 2012 Kannen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne avslørt mottak av følgende økonomisk støtte til forskning av denne artikkelen: DAAD (Deutscher Akademischer Austausch Dienst), kapper (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de nivel superior), CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), og FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de store menneskelige maligniteter over hele verden, og mye arbeid har blitt brukt til å forstå prosessen med kolon kreftutvikling, samt rollen som potensielle behandlinger og co-terapeutiske midler mot det [1] – [3]. En voksende mengde bevis tyder på at bruk av fluoksetin (FLX), en antidepressant tilhører de selektive serotonin reopptakshemmere (SSRI), kan være forbundet med en redusert tykktarmskreft risiko [4] – [6]. Imidlertid har kontroversielle meninger er publisert [7] -. [13] og en identifisering av mekanismene for aktiviteten av FLX på kolon celler ville hjelpe i avklaringen av denne uenigheten
Vi har nylig funnet ut at FLX redusert antall 1,2 dimetylhydrazin (DMH) indusert preneoplastiske colonic lesjoner, kalt avvikende krypten foci (ACF) og utøves en tidlig anti-VEGF aktivitet på stromale celler, minkende microvessel tall innenfor pericryptal colonic stroma (grunnfondsbevis) [5]. Tumor stroma utgjør 60-90% av kolon tumormasse [14], og GRUNNFONDSBEVIS omgir cryptal bunnen har blitt rapportert til å initiere visse trinn i kolontumorutvikling, for eksempel økt proliferasjon, microvessel formasjon, VEGF-syntese, regulering av selv- fornyelse og differensiering av tarmceller [15] – [18]. ACFs er betraktet som en egnet eksperimentell modell for å studere tidlige stadier av tykktarmskreft dannelse, hovedsakelig på grunn av deres nære likhet med utviklingen av kreft hos gnagere og mennesker, [17], [19].
(A og B) ROS produksjon analysert av flowcytometri, etter eksponering for ulike FLX konsentrasjoner for 30 min (A), og 4 h (B; * P 0,05
vs
DMSO). Hydrogenperoksyd (H
2o
2) ble anvendt som positiv kontroll, og i begge tilfeller anvendt i 30 min; vilkårlige enheter (a.u.). (C og D) O
2
– produksjon oppdaget av DHE farging for 30 min (C; P 0,05
vs
DMSO) og 4 t (D; p 0,05). (E og F) DNA-skade analysert ved komet analyse, etter eksponering for forskjellige FLX konsentrasjoner i 30 minutter (E), og 4 timer, med% DNA-innhold i hale representere DNA-skader (F; * P 0,05
vs
DMSO). Hydrogenperoksyd (H
2o
2) ble anvendt som positiv kontroll, og i begge tilfeller anvendt i 30 minutter. (G) Levedyktighet og apoptose assay (Annexin V /PI) utføres ved strømningscytometri, etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner FLX i 24 timer (
* P 0,05
vs
DMSO). (H) Fordeling av celler i cellesyklus faser ble analysert ved strømningscytometri. Gitt er prosentandelen av HT29-celler i G
0 /G
1, S og G2 /M-fasene med og uten FLX behandling i 24 timer (** P 0.01 vs DMSO). Alle tall viser resultater fra minst 4 uavhengige forsøk.
Selv FLX er kjent for å redusere kolon celleproliferasjon
in vitro product: [20], og
in vivo
modeller [5], [21], er mekanismen for dets antiproliferativ aktivitet ikke godt forstått. Her undersøkte vi hvorvidt antiproliferative virkningene av FLX behandling spille en rolle i kjemoprevensjon av dysplasi i tykktarm vev og hva de involverte mekanismer er. For dette formålet, brukte vi en human tykktarmskreft cellelinje (HT29) for
in vitro
eksperimenter og en
in vivo
modell for å studere kreftfremkallende-indusert preneoplastiske lesjoner.
in vivo
modell besto av C57BL /6 mus eksponert for intra-rektal behandling med alkylerende mutagen og kreftfremkallende N-metyl-N»-nitro-N-nitrosoguanidinmutasjon (MNNG). MNNG er blitt rapportert å indusere ACFs [22] for å høyere grad enn 1,2 dimetylhydrazin (DMH), carcinogen tidligere er brukt i colon cancermodeller etter vår gruppe [5], [17], [23].
Våre resultater viser at de antiproliferative virkningene av FLX-behandling ikke ble indusert ved økt apoptose eller produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) eller DNA-skade. I stedet FLX redusert ACF tall, mest sannsynlig ved å kontrollere aktiviteten til stromale celler knyttet til microvessel utvikling
Relativ uttrykk for p27 protein i HT29 celler som bestemt ved Western blot analyse (P . 0,05
vs
DMSO). En prøve blot og gjennomsnittlig resultat av 4 uavhengige forsøk er vist.
Materialer og metoder
Reagenser
Fluoxetin, TEMPOL, hydrogenperoksid (H
2o
2), dimetylsulfoksyd (DMSO), bisbenzimide, DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol), og MNNG ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA). DMEM (4,5 g /l glukose) medium ble anskaffet fra PAA Laboratories GmbH (Østerrike). Dihydroethidium (DHE) ble kjøpt fra Merck Millipore (Tyskland). Dichlorofluorescein (DCFH-DA) og Annexin V apoptose deteksjon kit (FITC), og Cytofix /Cytoperm kit ble kjøpt fra Becton Dickinson (Tyskland).
Cell Culture
HT29 kreftcelle menneskelige kolon linjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket under standard betingelser og dyrket i DMEM (4,5 g /l glukose) medium. Det ble supplert med 10% FBS, 1% L-glutamin, penicillin (100 enheter /ml) og 0,1 mg /ml streptomycin. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (Sarstedt Inc., USA), med en utgangskonsentrasjon på 5 x 10
5-celler /brønn, og den forblir ubehandlet i 20-24 timer. Da celler ble eksponert for 1, 10 eller 100 uM FLX i 30 minutter, 4 eller 24 timer. H
2o
2 (100 eller 200 mm) fungerte som kontroll for oksidative effekter og DNA-skader. Celler ble utsatt for H
2o
2 i 30 minutter.
Flow Cytometry for oksidativt stress, Levedyktighet og apoptose, og celle-syklusanalyse
Analyse for reaktive oksygenforbindelser ( ROS) produksjon ble gjennomført i henhold til vår standard metode ved flowcytometri og argon laser eksitasjon [24]. I korthet ble cellene merket i 10 minutter med DCFH-DA og, deretter analysert med en FL1 båndpassfilter (Becton Dickinson [BD] LSR I ™, Tyskland). Superoksyd ble detektert etter farging av cellene i 30 minutter med DHE (10 uM) i medium uten serum. Etter høsting ble cellene analysert med en FL2 band pass filter [25]. En levedyktighet og apoptose analysen ble utført av en Annexin V /propidiumjodid (PI) kit og analysert med FL1 og FL2 band pass filter, i henhold til produsentens instruksjoner. For cellesyklusanalyse, ble HT29-celler inkubert med FLX (1 uM og 10 uM), eller løsningsmidlet DMSO (1%). Deretter ble cellene permeabilisert (Cytofix /Cytoperm kit) og farget med bisbenzimide i 30 minutter. Eksperimenter ble analysert med ultrafiolett (UV) laser eksitasjon og en FL5 band pass filter. 20.000 celler ble analysert per prøve og evaluert med Pro ™ programvare BD Cellquest. Cellesyklus faser ble analysert ved ModFit LT ™ programvare (Verity Software House, USA). Minst fire uavhengige eksperimenter ble utført.
(A) Representative histologiske bilde av en sterkt dysplastisk område (MNNG eksponerte mus). Bildet innfelt (utvidet fra eske region) viser karakteristiske alvorlige dysplastiske funksjoner; f.eks delvis tap av celle polaritet, ingen slimceller, tilstedeværelse av Paneth celler (blå pil), og mitose (hvite piler). Bildene ble tatt på 200x forstørrelse, skala barer representerer 20 mikrometer. Høy forstørrelse bildene ble tatt på 1000x forstørrelse. (B) Representant bilde av en moderat dysplasi (MNNG + FLX behandlet mus). Det innfelte viser en komprimert cryptal luminal åpning, avlange kjerner (rød pil), en overfylt og pseudostrafied området (delt svart linje), men med et generelt fortsatt bevart celle polaritet, og et lavere antall Globet celler (gul pil). Forstørrelse er beskrevet ovenfor. (C) Kvantifisering av dysplastiske lesjoner. Avvikende krypten foci indeks (ACF-i) vist som antall dysplastiske lesjoner
per
mikrometer
2 (* P 0,05; MNNG uten FLX,
n
= 5; FLX + MNNG
n =
4). (D) Aberrant krypten indeks (AC-i) vist som antall dysplastiske enkelt krypter
per
mikrometer
2 (* P 0,05; MNNG uten FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n =
4). (E) Representative bilde av en dysplastisk område (i snitt svart linje), og dens relative vaskularisering å spre seg. Det innfelte (forstørret fra den innrammede område) viser to microvessels mot den indre regionen av dysplastisk området. De gule pilen peker på en microvessel vegg, og den røde pilen til erytrocytter inne i microvessel vegger. Bildene ble tatt på 400x forstørrelse, og ytterligere detaljer er beskrevet ovenfor. (F) Relativ dysplastisk vaskularisering, vist som antall microvessels
per
lesjon (* P 0,05; MNNG uten FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n =
4).
(A) prolifererende celler oppdages ved farging med anti-Ki67 antistoff (MNNG behandlede mus). (1) Røde piler viser mørkebrune positive celler migrerer oppover i epiteliale proliferativ sonen. (2) stromale positive celler er vist med en rød pil nær til den cryptal-bunnen. Det ble tatt bilder som beskrevet ovenfor. (B) prolifererende celler (anti-Ki67 antistoff, røde piler) i en MNNG + FLX-behandlede mus er vist i cryptal bunnen. Det ble tatt bilder som beskrevet ovenfor. (C) spredning i epitelceller områder vist ved merking med anti-Ki67 antistoff (*** P 0,001; MNNG uten FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n =
4 ). (D) spredning i grunnfondsbevis områder ved merking med anti-Ki67 antistoff (*** P 0,001; MNNG uten FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n =
4) . (E) spredning i epitelceller områder vist ved merking med anti-PCNA antistoff (** P 0,01; MNNG uten FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n =
4) . (F) spredning i grunnfondsbevis områder vist ved merking med anti-PCNA antistoff (** P 0,01; MNNG uten FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n =
4) . (G) Uttrykk for c-myc i epithelia av tykktarms vev (*** P 0,001; MNNG uten FLX,
n
= 3; FLX + MNNG,
n =
4). (H) Uttrykk for c-myc i grunnfondsbevis områder av tykktarmen vev (*** P 0,001; MNNG uten FLX,
n
= 3; FLX + MNNG,
n =
4) .
Comet assay
i henhold til vår forrige beskrivelse [24], en alkalisk versjon av kometen analysen ble utført. Analysen omfattet 100 tilfeldig utvalgte celler (50 per replikere lysbilde) for hver prøve som ble analysert med en fluorescens mikroskop (Labophot 2, Nikon, Tyskland) ved 200 gangers forstørrelse ved hjelp av Komet fem bildeanalyse programvare (BFI OPTILAS, Tyskland) . Prosentandelen av DNA i halen (% Tail-DNA) ble anvendt for å kvantifisere DNA-migrasjon. Minst fire uavhengige forsøk ble utført.
Western Blot analyse
Det ble utført som beskrevet i NuPAGE Technical Guide (Invitrogen, USA). Kort sagt ble proteinekstrakter kjørt på NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Geler (Invitrogen), og overført til membraner med iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) .Den Membranene ble inkubert 4 ° C over natten med anti-p27 (D69C12, Cell signalering, USA), og anti-GAPDH (9484, Abcam, UK) antistoffer. Sekundære antistoff (geite-anti-kanin og geit anti-mus IgG HRP-antistoff) ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Band av merkede-antistoffer ble påvist ved hjelp av SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, USA). Filmene ble skannet og intensiteten av båndene kvantifiseres med ImageJ programvare. Data fra 4 uavhengige forsøk er vist som forholdstall mellom verdier fra målrettede og endogene kontroll proteiner.
(A) Representative bilder av kolon seksjoner merket med anti-CD133 og anti-VEGF-antistoffer, og kjerner farget med DAPI. Hvite piler indikerer enkelt-farget og dobbelt-farget positive celler i grunnfondsbevis områder i kolon seksjoner fra (A1 til A3) MNNG uten FLX behandling, og (A4 til A6) MNNG + FLX behandlingsgruppene. Bildene ble tatt med FITC (495-521 nm), ultrafiolett (358-461 nm), og Texas Red (595-605 nm) filtre. Alle bildene ble tatt på 600x forstørrelse, skala barer representerer 20 mikrometer. (B) Representative bilder av enkelt kolon-farget seksjoner med anti-VEGF-antistoff (positive celler blir sett med mørkebrun cytoplasma) fra (B1) MNNG uten FLX behandling, og (B2) MNNG + FLX behandlingsgruppene. (B3) Relativ antall celler som uttrykker VEGF innen grunnfondsbevis områder (*** p 0,001; MNNG uten FLX,
n
= 3; FLX + MNNG,
n =
4). Alle bildene ble tatt på 400x forstørrelse, skala barer representerer 50 mikrometer. (C) Representative bilder av kolon seksjoner merket med anti-CD133 og anti-CD34-antistoffer, og kjerner farget med DAPI. Hvite piler indikerer enkelt-farget og dobbelt-farget positive celler i grunnfondsbevis områder i kolon seksjoner fra (C1 til C3) MNNG uten FLX behandling, og (C4-C6) MNNG + FLX behandlingsgruppene. Det ble tatt bilder som beskrevet ovenfor. (D) Representative bilder av enkelt kolon-farget seksjoner med anti-CD34 antistoff (positive celler blir sett med mørkebrun cytoplasma) fra (D1) MNNG uten FLX behandling, og (D2) MNNG + FLX behandlingsgruppene. (D3) Relativ antall CD34 positive celler i grunnfondsbevis områder (*** p 0,001; MNNG uten FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n =
4). Alle bildene ble tatt som beskrevet ovenfor.
Mus og behandling Protocol
Kvinne C57BL /6 mus (5 uker) ble levert av Medical School of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo , Brasil. Alle
in vivo
behandlinger var i samsvar med protokollen er godkjent av Animal Care og bruk Committee (n ° 068/2012) fra Medical School, University of São Paulo, og veiledning for dyr administrere på et minimum akseptabelt tall. Musene ble akklimatisert i en uke før start av eksperimentet. C57BL /6 mus ble eksponert eller ikke for den kreftfremkallende MNNG og tilfeldig fordelt til en av fire grupper, som kontroll (Ctrl) eller MNNG-behandling (fire suksessive doser av MNNG [5 mg /ml; intrarektal innskudd på 100 ul; Sigma- Aldrich, Louis, MO, USA] to ganger i uken i 2 uker), og FLX-behandling (30 mg /kg /dag, intraperitoneal, ip, Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA) eller MNNG + FLX-behandling. Hver gruppe hadde fem mus, og de ble plassert
per
plast bur ved 22 ± 2 ° C med 55% luftfuktighet og 12 timer lys /mørke syklus. FLX-programmet ble startet etter 2 uker fra slutten av MNNG-behandling, og fortsatte i de neste 4 uker. Alle dyrene hadde fri adgang til Chow og vann under forsøket. Alle mus ble avlivet ved CO
2 eksponering ved uke 8 av eksperimentet. Individuelle obduksjoner ble utført, og tykktarm vevsprøver ble lengderetningen åpnet og fast flat i 4% nøytral paraformaldehyde-buffer (24 timer). Mus med fragmenterte vevssnitt ble kassert fra analysen.
(A) Representative bilder av kolon seksjoner merket med anti-CD133 og anti-CD31-antistoffer, og kjerner farvet med DAPI. Hvite piler indikerer enkelt-farget og dobbelt-farget positive celler i grunnfondsbevis områder i kolon seksjoner fra (A1 til A3) MNNG uten FLX behandling, og (A4 til A6) MNNG + FLX behandlingsgruppene. (A3 og A6) Dobbel-farget positive celler er vist med hvite piler i microvessel-lignende strukturer nærliggende cryptal bunner. Bildene ble tatt med FITC (495-521 nm), ultrafiolett (358-461 nm), og Texas Red (595-605 nm) filtre. Alle bildene ble tatt på 600x forstørrelse, skala barer representerer 20 mikrometer. (B) Representative bilder av enkelt kolon-farget seksjoner med anti-CD31 antistoff (positive celler blir sett med mørkebrun cytoplasma) fra (B1) MNNG uten FLX behandling, og (B2) MNNG + FLX behandlingsgruppene. Bildene ble tatt på 400x forstørrelse, skala barer representerer 50 mikrometer. (B3) Relativ antall CD31 positive cellegruppene oppdaget
per
grunnfondsbevis område (** p 0,01; MNNG uten FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n =
4)
Histopatologisk analyse
Colon vevsprøver ble seksjonert og farget med H . E og analysert ved hjelp av lysmikroskopi. En vev oversikt ble utført ved 200x forstørrelse i colonic prøver, hvor dysplastiske avvikende krypten foci (ACF) med patologiske funksjoner som spenner fra mild til alvorlig dysplasi ble oppdaget og telles [26]. Deretter ble en andre analyse utført ved 400x forstørrelse på hver detektert lesjon for bekreftelse av dysplastiske funksjoner og telling av antallet av avvikende krypter (AC) og microvessels (MV). Hele området av hver analyserte delen ble bestemt med en gradert linse (100x
;
Nikon, Japan), og sitt område (mm
2) ble beregnet som
verdier (V) × 0,9801 /121
. Relative verdier for ACF-i (index) og AC-jeg ble beregnet at deres totale antall
per
mm
2 [5], [17]. Den vaskularisering relaterte dysplasi var fast bestemt på å være
ACF × MV /AC
.
Immunohistochemistry (IHC) og immunfluorescens (IMF)
Ifølge tidligere beskrivelse [5], [27], IHC og IMF-farging ble utført på parafin colonic seksjoner (4 pm). Primære antistoffer ble kjøpt fra Novocastra (USA), Santa Cruz Bioteknologi (Tyskland), og Biocare Medical (USA). Seksjoner ble inkubert med anti-Ki67 (klone MMA på 1:100), anti-PCNA (klone PC 10 på 1:100), anti-c-
Myc plakater (klone 9E11 på 1:100), anti -VEGF (klone A-20 på 1:100), anti-CD34 (klon QBEnd /10 på 1:100), anti-CD31 (klon 1A10 på 1:100), og anti-CD133 (klone N /A på en :100) primære antistoffer over natten. Den brune fargen ble vist ved å inkubere seksjoner med Picture-MAX Polymer Kit (Invitrogen, USA). Det viste seg i positive reaksjoner en brun utfelling ved kjernen for Ki67, og PCNA, og i cytoplasma og /eller perinuclei område for
c-myc
, VEGF, CD133, CD34, og CD31.
spredning i colonic seksjoner ble analysert med anti-Ki-67 og anti-PCNA antistoffer i epitel og grunnfondsbevis områder. Markører assosiert med vaskularisering (VEGF, CD133, CD34, og CD31) ble talt i grunnfondsbevis områder. Imidlertid, CD31 (eller PECAM-1; blodplate-endotelial adhesjonsmolekyl-1) ble tellet som positive cellegrupper (mer enn 3 positive celler), ettersom CD31 er hovedsakelig uttrykt på overflaten til endoteliale celler [28]. Nøkkeltall fra telling ble bestemt mellom positivt fargede kjerner og totale ufargede kjerner i epitel, mens forholdene i grunnfondsbevis områder ble beregnet mellom positive celler (eller CD31 klynger) og det totale antall telte områder. For positive celler
per
klynge av CD31, ble forholdet beregnet mellom antall merkede celler, og det totale antall klaser.
Double-merking ble utført i faste colon prøver merket med mus anti human CD133 (1:100; Miltenyl Biotec, 715-090-422, sekundært anti-mus FITC konjugert antistoff, 1:400, Dianova, 715-095-150), kanin anti-mus VEGF (1:100, Santa Cruz sc-152, sekundær anti-Kanin Cy3 konjugert antistoff, 1:400, Dianova, 111-165-144), rotte anti-mus CD34 (1:100, Applied Biosystems, ab 8158, sekundært anti-rotte Texas Red konjugert antistoff , 1:400, GeneTex, GTX 26732), og kanin anti-mus CD31 (1:100, Applied Biosystems, ab 28365, sekundært anti-kanin Cy3 konjugert antistoff, 1:400, Dianova, 111-165-144) antistoffer. Kjerner ble farget med DAPI. Bilder ble kjøpt med et Olympus BX51 mikros utstyrt med et Olympus DP71 kamera og en CellSens Dimension programvare (Olympus, Tyskland).
Statistical Analysis
Data ble analysert ved hjelp av statistikkprogrammet GraphPad Prism 5.0 ( Graph Pad Software Inc., San Diego, California, USA). To-veis ANOVA (Bonferroni post hoc-test) Testen ble benyttet for å analysere data fra annexin V /PI og celle-syklus analyser, og
in vivo eksperimenter
, siden det tillater forskjellige endepunktene som skal analyseres separat. Oksidativt stress og DNA-skade ble analysert ved en-veis ANOVA (Bonferroni post hoc test) test. Preneoplastiske lesjoner (ACF-i, AC-i, og vaskularisering relaterte dysplasi) ble analysert av Mann Whitney test. En sannsynlighet på p 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Alle verdier representerer betyr ± standardavvik.
Resultater
FLX Påvirkning av ROS Produksjon, skade DNA, celleviabilitet, apoptose, og Cell-syklus
For å forstå om og hvordan terapeutiske og over-terapeutiske konsentrasjoner av FLX kunne spille en rolle mot koloncancer celleproliferasjon, ble humane tarmkreft HT29-celler analysert for ROS produksjon, DNA-skade, levedyktighet, apoptose, og fordelingen av celle-syklus faser i kulturen. Vi fant at ROS-produksjon ble øket 2,5 ganger i HT29-celler ved 100 uM FLX etter 30 min behandling, men ingen signifikant økning ble observert med en og 10 uM FLX (figur 1A). Ytterligere eksperimenter viste at ROS var omtrent 2-ganger mindre i HT29-celler eksponert for 100 uM FLX etter 4 timer enn etter 30 min behandling (figur 1B). Med mer superoksid spesifikk fargestoff DHE et lignende mønster ble observert (figur 1C og 1D). En 2,8 gangers økning med 100 uM FLX (figur 1C), men ingen økning med 1 uM og 10 uM FLX ble funnet etter 30 min og en to gangers forbedring ble observert etter 4 h (figur 1D), igjen bare med 100 um FLX. Dermed øker med 100 pM FLX var 1,4 ganger lavere etter 4 timers behandling enn etter 30 min. Ingen av de FLX konsentrasjonene induserte betydelig DNA-skade i HT29-celler etter 30 min eller 4 h eksperimenter (figur 1E og F).
Etter 24 timer ble redusert 100 uM FLX celleviabilitet betydelig, apoptose, selv om en og 10 mikrometer ikke var i stand til å fremkalle lignende effekter (figur 1G). På den annen side, 10 pM FLX forårsaket en signifikant forsinkelse av celler i G
0 /G
1 celle-syklusfase i løpet av en 24 timers behandling (figur 1G). Når cellesyklusprogresjon relatert protein p27 ble undersøkt, 10 uM FLX forårsaket en liten oppregulering og et 1,3-gangers økning ble funnet etter 24 timers behandling med 20 uM FLX (fig. 2). Tatt sammen, en G
0 /G
en forsinkelse cellesyklus skjedde ved en terapeutisk FLX konsentrasjon, som ikke ble forårsaket av ROS produksjon eller induksjon av DNA-skade.
Potensiale FLX Mot dannelse av preneoplastiske lesjoner
på bakgrunn av funnene vist ovenfor, ble en chemopreventive aktivitet mot preneoplastiske kreft i tykktarmen vev bekreftet for FLX behandling i kreftfremkallende utsatte mus. Mus ble først utsatt for MNNG, ble behandlet med FLX i 28 dager, og preneoplastiske lesjoner ble nummerert ved histopatologisk analyse. Vi observerte alvorlig MNNG-indusert dysplasi (figur 3A) i colonic seksjoner, som ikke ble observert i en slik grad i prøver fra FLX-behandlede dyr (figur 3B). Kvantifisering av dysplastiske lesjoner (ACF) i MNNG og MNNG + FLX-behandlede mus viste at FLX redusert dysplasi 5,39 ganger (Figur 3C). FLX behandling betydelig redusert de totale verdiene av AC
per
mm
2 7,94 ganger (Figur 3D). Microvessels ble spredt over hele grunnfondsbevis mot dysplastiske områder (Figur 3E), og vi fant ut at FLX behandling reduserte vaskularisering relaterte dysplasi 3,13 ganger (figur 3F). Våre data tyder på at FLX opptrer i ulike colonic områder, nemlig epitel og stroma.
Aktivitet av FLX på spredning i epitel og grunnfondsbevis Områder
Siden vi identifisert chemopreventive virkninger under FLX-behandling i tykktarmen vev , ble det reist spørsmål om disse funnene var knyttet til antiproliferative aktiviteter i to forskjellige colonic områder, nemlig epitel og grunnfondsbevis områder (Figur 4A.1 og 2). Merkede seksjoner med anti-Ki67 antistoff viste at FLX svekket (figur 4B) den MNNG-indusert økning i spredning, ved epitelial og grunnfondsbevis områder (Figur 4C og D). PCNA farging viste også at FLX dempes den MNNG-indusert proliferativ aktivitet på begge colonic områder (figur 4E og F). Videre er en høy
c-Myc
ekspresjon ble funnet i begge colonic områder i MNNG-behandlede dyr, i hvilke FLX-behandling forhindret økningen av ekspresjonen (figur 4G og H). Dermed våre funn støtter hypotesen om at hemming av spredning spiller en viktig rolle i chemopreventive effekter av FLX behandling.
Aktivitet av FLX på Angiogenese
Med tanke på at angiogenese foregår innenfor grunnfondsbevis, og spredning samt stamcelle markører kan være relatert til at [15] – [16], [29] – [30], undersøkte vi muligheten forbindelse mellom disse hendelser under FLX behandling. CD133-positive celler som uttrykker VEGF ble funnet innenfor GRUNNFONDSBEVIS hos mus utsatt enten for MNNG eller MNNG + FLX behandlinger (Figur 4A). FLX behandling redusert sin relative tall i carcinogen-eksponerte gruppen sammenlignet med MNNG gruppen uten FLX (MNNG, 3,73 ± 0,44 [
n
= 4]
vs
MNNG + FLX, 1,97 ± 0,14 [
n
= 4]; P 0,001). Stromale celler uttrykker VEGF var også redusert i MNNG-eksponerte dyr behandlet med FLX uttrykk (figur 5B). Forbløffende nok CD133 positive celler som uttrykker CD34 glykoprotein ble bare funnet blant MNNG behandlet mus (figur 5C) mens FLX behandling betydelig redusert antall stromal CD34-positive celler (figur 5D). Videre ble det relative antall CD31-positive celler nummerert innenfor grunnfondsbevis områder, og en signifikant reduksjon ble funnet i den MNNG-eksponerte gruppe under FLX behandling (MNNG, 3,5 ± 0,87 [
n
= 4]
vs
MNNG + FLX, 1,8 ± 0,2 [
n
= 4]; P 0,01). En sammenligning mellom CD34 og CD31-positive celler viste en 1,2 ganger økning i CD31-positive celleverdier blant MNNG-eksponerte mus.
Siden CD31 er en angiogenese-relaterte markør [31] og ble forsterket etter MNNG- behandling, dobbelt-farging ble gjennomført for å forstå om CD133-positive celler ble uttrykker CD31-glykoprotein. I MNNG og MNNG + FLX grupper, CD133 positive celler uttrykt CD31 i microvessel lignende strukturer innenfor grunnfondsbevis områder (Figur 6b). Potensielle områder i utviklings microvessels ble oppdaget opplisting CD31-positive cellegruppene innenfor grunnfondsbevis (Figur 6b.1 og B.2). CD31-positive cellegruppene ble redusert betraktelig i FLX-behandling i MNNG-eksponerte mus (figur 6b.3). Derfor er disse data ført til hypotesen om at en reduksjon av microvessel formasjon kan ha oppstått på grunn av styringen av FLX på stromal celledifferensiering prosess.
diskusjon
terapeutiske konsentrasjoner av FLX varierer fra 10 til 30 uM i den menneskelige hjerne [32]. Denne konsentrasjonen (10 mm) forsinket cellesyklusprogresjon uavhengig av ROS produksjon og DNA-skade i humane tykktarmskreftceller
in vitro
. Lignende funn av FLX blokkert cellecyklusprogresjonen arrestere brystsvulster celler på G
o /G
1 fase har vært rapportert tidligere [33]. Disse forfatterne funnet blant andre bevis en opphopning av p27 og utviklet en modellbasert hypotese om at FLX kan forstyrre montering av cyclin avhengig kinase subenheten 1 (CKS1) med ubiquitin ligase skp2, hindrer ubiquitinering og proteasomal degradering av p27. Vi har også oppdaget en p27 oppregulering, som er konsistent med hypotesen om Krishnan et al. [33]. I en annen rapport med HT29 celler, ble FLX vist å hemme ERK1 /2 fosforylering av hypophosphorylating
c-myc Kjøpe og CREB proteiner, noe som resulterte i nedregulering av cyclin D1 og A, mens cellesyklus sjekkpunkt gener ble oppregulert , redusere celleproliferasjon [20].
ser på våre
in vitro
resultater og chemopreventive aktivitet FLX mot MNNG-indusert dysplasi gjennom redusert epitelproliferasjon, synes det mulig at FLX fremmer disse effektene ved å kontrollere cellesyklusprogresjon
in vivo
. Det er kjent at celler muterte henhold MNNG eksponering kan oppnå økt celleformering kapasitet gjennom endringer i onkogen og miRNA uttrykk [34]. På den annen side er en forsinkelse i G
2 /M-fasen av cellesyklusen ble rapportert i tykktarmskreftceller som er utsatt for MNNG [35]. Videre har kreftfremkallende aktivitet av MNNG vært knyttet til høy celleformering in colonic epithelia [22], [36] – [37], mens et chemoprevention mot de induserte dysplastiske effekter var relatert til en reduksjon i proliferasjon og ekspresjon av onkogener, for eksempel som
c-myc product: [36], [38]. Derfor endrer MNNG cellesyklus-progresjon gjennom induksjon av mutasjoner som fører til øket proliferativ kapasitet. FLX ble funnet å redusere cryptal spredning ved å påvirke serotoninerge aktivitet [5], og til å indusere ekspresjon av tumor-suppressorer, nemlig p53, p27 og p21 [20], [33].
Siden høy spredning spiller en viktig rolle
